低溫保存對4種作物種子超弱發(fā)光特性影響規(guī)律的研究

張文蘭　田茜　李群　賈文斌　戴雙　段乃彬

摘要：為探索超弱發(fā)光特性（UWL）與種子活力之間的相關(guān)性，并為研究種子活力無損測定新方法提供技術(shù)依據(jù)，對不同保存年限的玉米、小麥、大豆、水稻種子進行超弱發(fā)光和延遲發(fā)光測定，并通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計、曲線擬合及作圖，分析種子超弱發(fā)光特性與低溫保存時間的關(guān)系及延遲發(fā)光的變化特征。結(jié)果表明，同一品種不同保存年限的種子超弱發(fā)光能力差異明顯，隨保存延長超弱發(fā)光強度逐漸下降，與發(fā)芽勢變化呈現(xiàn)極強的正相關(guān)；種子的延遲發(fā)光呈現(xiàn)隨貯藏年限延長強度降低而衰減系數(shù)先增大后減小的特征。

關(guān)鍵詞：低溫保存；作物種子；超弱發(fā)光；種子活力

中圖分類號：S510.1文獻標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2014）12-0038-05

種子活力檢測方法的種類多達數(shù)十種，歸納起來不外乎直接法和間接法，即通過發(fā)芽試驗測定田間出苗率的方法和生化方法，這些方法繁瑣、耗時長，會破壞組織以及物理、化學(xué)結(jié)構(gòu)，且要求操作人員具備較高的專業(yè)操作水平，屬有損檢測方法。特別對于稀有種子，發(fā)芽試驗測定將造成不可挽回的資源損失，因此在種質(zhì)資源保存領(lǐng)域需要一種快速、高效、無損的種子活力檢測方法。

生物組織或細胞在生命活動的代謝過程中，都自發(fā)地輻射出一種極其微弱的光子流，這是一種極微弱的準連續(xù)光子輻射[1]，是生物在生命活動中出現(xiàn)的一種機體自身發(fā)光，其強度為每秒每平方厘米上幾個至幾千個光子，波長180～800 nm，稱為生物系統(tǒng)的代謝超微弱發(fā)光（Ultra-Weak Luminescence，UWL），是所有活的生物都具有的一種普遍現(xiàn)象[2]。生物代謝的超弱發(fā)光廣泛存在于動植物中，反映了生物體與生命活動過程的有關(guān)信息。生物超弱發(fā)光通常包括兩部分：一種為自發(fā)的超微弱發(fā)光，與生物體的代謝有關(guān)；另一種為外因誘導(dǎo)發(fā)光稱為延遲發(fā)光（Delayed Luminescence，DL），如光、電離輻射、超聲、化學(xué)藥物等外界激勵因素。自身發(fā)光和延遲發(fā)光與生物的新陳代謝狀態(tài)和水平，細胞的分裂、死亡、變異以及細胞間信息的傳遞等許多基本的生命過程都有著內(nèi)在的聯(lián)系，是反映生物體內(nèi)部機能的一個重要窗口[3]?；谝陨?，通過超微弱發(fā)光特性檢測種子基礎(chǔ)代謝（反映種子的活力）與保存時間的關(guān)系，在不破壞被檢測種子的物理和化學(xué)結(jié)構(gòu)情況下，對種子進行無損、快速檢測，將為種質(zhì)資源的安全保存與及時更新提供更為準確的技術(shù)依據(jù)[4，5]。

1材料與方法

1.1試驗材料

從種子資源庫（中期庫）選取玉米鄭單958、小麥濟南16、大豆齊黃27、水稻香粳9407共4種作物種子，其保存時間分別為1、3、5、7、9年，保存溫度為0℃。種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院種質(zhì)資源研究所國家種質(zhì)中期庫提供。

1.2試驗方法

1.2.1發(fā)芽勢及發(fā)芽率的測定取以上玉米、小麥、大豆、水稻凈種子，按照《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》（GB/T 3543.3-1995）操作規(guī)程進行發(fā)芽試驗，統(tǒng)計發(fā)芽勢和發(fā)芽率。

1.2.2自身發(fā)光的測量從0℃中期庫中取出種子，置于4℃保鮮箱中24 h緩慢升溫，再置于25℃生化培養(yǎng)箱中緩慢升溫并保持恒溫，使之不因升溫破壞種子的基礎(chǔ)代謝，盡量保持種子保存時的自然狀態(tài)。每個保存年限的種子樣品分成3個平行組，其中玉米每組10粒、小麥50粒、大豆15粒、水稻70粒，以便使種子數(shù)量能夠完全覆蓋測量杯底并略有盈余。在進行試驗前種子先置于暗室中30 min，取出后放入BPCL-2-ZL超微弱發(fā)光測量儀樣品室的測量杯中進行自身發(fā)光的測定，時間為100 s，取每種樣品3個平行組測量數(shù)據(jù)的平均值作為該樣品的測量值，樣品室溫度設(shè)定為恒溫25℃。

1.2.3延遲發(fā)光的測量由于自身發(fā)光主要反映種子的基礎(chǔ)代謝特征，這對于判斷種子活力并不全面，本試驗進一步測量了種子的延遲發(fā)光特征。前人的研究發(fā)現(xiàn)新鮮種子采取的激勵方法是日光燈或LED燈珠照射，照度只有幾十勒克斯[7]。而本試驗是經(jīng)過較長時間保存的種子，較低的照度顯然不足以對樣品產(chǎn)生足夠激勵，為深入研究種子對外界激勵的響應(yīng)，需要較強的“喚醒”信號，故選擇波長較寬的日光燈為光源，光照強度為4 000 lx。樣品分組方式與自身發(fā)光測量相同，將待測樣品依次放在日光燈下照射2 min后，迅速測定延遲發(fā)光光子數(shù)，每次測量100 s，樣品室設(shè)定為恒溫25℃。

2結(jié)果與分析

2.1發(fā)芽率、發(fā)芽勢測定結(jié)果

由圖1可知，玉米、小麥、大豆、水稻4種作物種子的發(fā)芽率隨保存時間的延長逐漸降低，降低趨勢一致，保存1～7年間緩慢降低，7年后顯著降低。以玉米種子為例，保存1年的種子發(fā)芽率為97%，保存3、5、7、9年后的發(fā)芽率分別降低為96%、95%、93%和86%。

4種作物種子發(fā)芽勢降低趨勢也接近一致。圖2反映出發(fā)芽勢的降低幅度比發(fā)芽率大。以小麥為例，保存1年后種子發(fā)芽勢為99%，保存3、5、7、9年后分別降低為95%、90%、78%和70%。

以上結(jié)果表明，在中期庫保存對4種作物種質(zhì)生活力變化趨勢的影響是一致的，同時說明，在中期庫保存過程中，玉米、小麥、水稻和大豆的耐貯性相差不大。

2.2自身發(fā)光檢測結(jié)果分析

超微弱發(fā)光的測試及數(shù)據(jù)處理是一個比較復(fù)雜的工作，這是由于數(shù)據(jù)本身跳變性較大，直接作圖往往難以提取有用的信息，有些研究者做了很多有益的嘗試，效果很好[6～15]。本試驗采用更直觀的方式，發(fā)現(xiàn)效果更好。方法是將同一樣品而保存年限不同的種子，取其100 s 內(nèi)的總光子數(shù)除以總粒數(shù)和總測量時間，即單位時間單粒種子在一定測量時間內(nèi)的平均自身發(fā)光光子數(shù)（S）。

S=Nn×t

式中：t為100 s，N為總光子數(shù)，n為種子粒數(shù)。

將測得的4種作物各5個保存年限種子的自身發(fā)光光子數(shù)用OriginPro 8.0作圖3?？梢钥闯?，同種種子隨保存時間的不同，其自身發(fā)光S存在明顯差異，總體上是隨保存時間的延長而減弱，這一結(jié)果與種子的新陳代謝以及活性規(guī)律相吻合，表明種子活性與保存時間之間具有負相關(guān)性。同時還可以看出不同種子存在明顯差異，這可能與種子本身的特性，如種子大小、形狀以及胚所在位置有關(guān)。在大豆的發(fā)芽勢（活力）與超弱發(fā)光變化上，在前期有一個明顯的平臺，即保存第1～3年兩個指標(biāo)均變化較小，保存第3～5年以后則急劇下降。這直接證明了種子超弱發(fā)光可以作為衡量種子活力的重要指標(biāo)。由DPS數(shù)據(jù)分析軟件對4種作物發(fā)芽勢及超弱發(fā)光數(shù)據(jù)進行相關(guān)分析表明，兩組數(shù)據(jù)之間存在極強的正相關(guān)（表1），4種作物兩者的相關(guān)系數(shù)分別為玉米0.97、小麥0.99、大豆0.98、水稻0.96，相應(yīng)P值均小于0.01，表明差異達極顯著水平。

2.3延遲發(fā)光結(jié)果分析

由于超弱發(fā)光測量數(shù)據(jù)的特殊性，對所得數(shù)據(jù)進行分析處理，獲得盡可能多的信息，目前沒有統(tǒng)一的方法。經(jīng)比較分析發(fā)現(xiàn)，延遲發(fā)光的擬合曲線，同樣可反映種子的活力。而延遲發(fā)光衰減所呈現(xiàn)的規(guī)律性，往往受到諸多偶然因子及系統(tǒng)因子的影響，需要進行修正。將玉米、小麥、大豆、水稻種子在100 s內(nèi)的延遲發(fā)光測量數(shù)據(jù)，用OriginPro 8.0直接作圖，并對延遲發(fā)光曲線進行擬合處理，得到各自的擬合曲線為圖4、圖5、圖6和圖7。

從擬合曲線中可知，種子的延遲發(fā)光光子數(shù)隨著保存時間的延長而增大，符合雙曲線特性。以大豆為例，延遲發(fā)光的擬合曲線呈現(xiàn)出明顯的層次性，保存年限對擬合曲線的特征影響明顯；另一個特征是保存時間長的種子趨向穩(wěn)態(tài)的時間明顯高于保存時間短的種子，即其恢復(fù)到自身發(fā)光水平所需的時間更長，表明種子的活性與保存時間在延遲發(fā)光方面有密切關(guān)聯(lián)。這種現(xiàn)象的原因可能在于種子遭受外界環(huán)境干擾時（光照），要靠自身的新陳代謝來修復(fù)，保存時間短的種子可能快速修復(fù)完畢，而保存時間長的種子仍在進行旺盛的新陳代謝來修復(fù)細胞基礎(chǔ)代謝，導(dǎo)致保存時間長的種子發(fā)光強度都比新種子強。水稻、玉米的情況亦如此，只有小麥的擬合曲線略有不同，表現(xiàn)為保存7年的種子，其延遲發(fā)光擬合曲線在開始衰減的20 s左右，略高于保存9年的種子的擬合曲線，但總趨勢與其它品種相同。進一步分析發(fā)現(xiàn)，保存1年種子的延遲發(fā)光曲線總體明顯低于其它4個保存年份，其它4個年份的延遲發(fā)光曲線趨勢區(qū)分度較好，可以推測，種子保存過程中，在短時間內(nèi)種子活性會有所降低，隨著保存時間的推移，種內(nèi)的新陳代謝等活動會達到相對穩(wěn)定的狀態(tài)，玉米、小麥、水稻亦如此。

2.4延遲發(fā)光衰減規(guī)律——雙曲線方程的修正

延遲發(fā)光擬合曲線不僅可以很好地反映種子的活力，而且還可以提供更多的信息。研究表明，植物葉片經(jīng)白熾燈光照誘導(dǎo)后的發(fā)光衰減特性接近雙曲線規(guī)律，與生物光子的相關(guān)理論相吻合，因此這一結(jié)果在超弱發(fā)光理論的爭論中有力地支持了Popp等[9]的相關(guān)理論。雙曲線衰減方程為：

Y=A+BX是一線性方程，理論上來說應(yīng)該是一條直線，但是試驗結(jié)果雖然大體上是一條直線，其前一段卻呈一開口向上的曲線，用曲線方程Y=p1e-x/p2+p3X+p4C擬合試驗數(shù)據(jù)。對曲線方程做數(shù)學(xué)處理，由Y=p1e-x/p2+p3+p4X，得：

Y=p3+p4（1+p1p4×e-x/p2X）X

式中X=ln（t-t0），對上式兩邊求e指數(shù)：

I（t）=ep3·（t-t0）p4（1+p1p4·e-x/p2X）

令p4（1+p1p4·e-x/p2X）=-1p（t）；可得出：

p（t）=B（t-t0）ln（t-t0）（t-t0）ln（t-t0）-C

所以延遲發(fā)光擬合曲線方程為

I（t）=A（t-t0）-1/p（t）

其中，生物系統(tǒng)內(nèi)部各個激發(fā)態(tài)分子之間是相互偶聯(lián)的，延遲發(fā)光衰減參數(shù)1/p表征生物體內(nèi)各個激發(fā)態(tài)偶聯(lián)程度和生物體系統(tǒng)內(nèi)相互作用的大小[16]。一個重要問題在于本課題研究的種子，不含有如葉片那樣的專門用于光吸收的分子體系（如葉綠素分子及天線色素系統(tǒng)及相關(guān)酶系）和物質(zhì)結(jié)構(gòu)（如葉綠體和類囊體等）[17]。衰減參數(shù)是否對本課題的樣品適用呢？通過擬合曲線方程，可以比較方便地求出衰減參數(shù)，作圖后發(fā)現(xiàn)保存年限也與衰減參數(shù)存在相關(guān)性，但是關(guān)系較復(fù)雜，如圖8所示。表現(xiàn)為在1～5年間衰減參數(shù)隨保存時間延長而增大，5年時達到最大，隨后減小。由于衰減參數(shù)相對于自身發(fā)光及延遲發(fā)光的測量而言，是以擬合曲線方程為前提的，經(jīng)模擬處理后，可能會造成信息的丟失，因此雖然衰減參數(shù)與保存時間并不呈現(xiàn)為簡潔的關(guān)系，但是它們之間的關(guān)聯(lián)性，使得衰減參數(shù)仍可以作為檢測種子活力的輔助參數(shù)。

由于測量樣品數(shù)量還不太豐富，同時旁證材料較少，相關(guān)的分析有待于進一步深入研究。

3結(jié)論

通過測量4種作物種子的20個樣品的自身發(fā)光和光照誘導(dǎo)條件下的延遲發(fā)光特性，用作圖和曲線擬合分析試驗數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)儲藏時間會導(dǎo)致玉米、小麥、大豆、水稻種子組織結(jié)構(gòu)及生理生化上的變化，相應(yīng)地反映在其自身發(fā)光強度和延遲發(fā)光變化上。

在自身發(fā)光（UL）方面，保存的時間越長，種子自身的發(fā)光強度越弱，體現(xiàn)了它們之間的負相關(guān)性，單位時間單粒種子的平均自發(fā)光子數(shù)，可很好地反映種子的新陳程度，這可作為無損傷檢測種子保存時間的主要指標(biāo)。

在延遲發(fā)光（DL）方面，保存時間的不同會導(dǎo)致延遲發(fā)光特性的差異。在強光激勵對種子“喚醒”后，保存時間長的種子趨向穩(wěn)態(tài)的時間要明顯高于保存時間短的種子，表明了它們之間的正相關(guān)性。這種特性可以很好地將延遲發(fā)光作為反映種子內(nèi)部新陳代謝變化的一個窗口，擬合曲線能夠很好地反映種子的活力，衰減參數(shù)也與保存時間存在關(guān)聯(lián)性，可作為無損傷檢測種子活力的輔助參數(shù)。

總之，相對于傳統(tǒng)檢測方法及其它有損傷檢測，自身發(fā)光和延遲發(fā)光方法可以很好地反映種子活力，這對于提高檢測效率，降低種子損耗，是一種有效快速簡便的方法。

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