葛根素-鍺配合物的合成及其抗炎活性研究

王鈺寧，張 擴(kuò)，姜 琦，徐亦熒，隋 兵，孫 鵬，邢志華，張秀娟,2，孫志偉

(1. 哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱 150076；2. 哈爾濱商業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，哈爾濱 150076)

葛根素-鍺配合物的合成及其抗炎活性研究

王鈺寧1，張 擴(kuò)1，姜 琦1，徐亦熒1，隋 兵1，孫 鵬1，邢志華1，張秀娟1,2，孫志偉1

(1. 哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱 150076；2. 哈爾濱商業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，哈爾濱 150076)

以葛根素和氧化鍺為原料合成葛根素-鍺配合物.采用紫外及紅外技術(shù)對(duì)配合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步表征.采用二甲苯誘導(dǎo)小鼠耳廓腫脹炎癥模型，以腫脹度和抑制率為抗炎活性指標(biāo)，測(cè)定葛根素-鍺配合物的抗炎活性.結(jié)果表明, 葛根素與鍺離子生成了配合物，與鍺發(fā)生配位的基團(tuán)是葛根素分子中B環(huán)的4′-羥基，而不是A環(huán)的7-羥基及C環(huán)的羰基.葛根素-鍺配合物的抗炎活性(抗炎腫脹度抑制率為75.91%)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于葛根素配體(抗炎腫脹度抑制率為32.49%)，也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于臨床常用的甾體抗炎藥-氫化可的松(抗炎腫脹度抑制率為48.74%).

葛根素；鍺；配合物；抗炎活性

目前，大多數(shù)炎癥治療采用可的松類(lèi)和非甾體類(lèi)抗炎藥等一類(lèi)環(huán)氧化酶抑制劑，對(duì)于減少炎癥和疼痛具有較好的療效，但長(zhǎng)期或者頻繁地使用這些藥物，易產(chǎn)生一些嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如鈉潴留、庫(kù)欣綜合征、骨質(zhì)疏松，甚至誘發(fā)精神病癥狀等.因此，發(fā)現(xiàn)可替代的、毒性較低的、天然炎癥介質(zhì)阻斷劑，具有重要的意義.葛根素是豆科植物野葛或甘葛藤中主要有效成分，具有改善微循環(huán)、抑制血小板聚集、清除氧自由基等功能，在臨床上用于治療心肌缺血、心絞痛等心腦血管等疾病[1-5].目前對(duì)于葛根素的研究，科研人員主要圍繞抗腫瘤、提高免疫、降壓、降脂、降血糖等方面，但對(duì)葛根素的抗炎作用研究很少[6-9].鍺元素不僅存在于礦石和植物中，也存在于動(dòng)物及人體內(nèi).動(dòng)物體內(nèi)的許多酶(如細(xì)胞色素氧化酶、瓜氨酸酶等)、腦皮質(zhì)、灰質(zhì)中均含有痕量鍺元素.在組織器官中，鍺分布量由多到少依次是腎、肝、脾、肺、胃、肌肉、心和腦.1967年，日本學(xué)者淺井一彥首次合成了有機(jī)鍺藥物“二氧化二羧乙基鍺”，又名Ge-132.隨后，證實(shí)鍺元素具有多種生物活性，在保健、預(yù)防及治療疾病方面越來(lái)越受到科研工作者的重視[10-14].生物無(wú)機(jī)化學(xué)研究證實(shí)，金屬配合物的生物活性大都高于其本身，但不良反應(yīng)都小于其本身.中藥配位學(xué)說(shuō)認(rèn)為，天然藥物的藥理活性，大都是其有機(jī)物成分與礦物質(zhì)之間形成配合物而產(chǎn)生的協(xié)同作用.本研究以葛根素為配體，以鍺為配位中心，通過(guò)控制反應(yīng)條件合成葛根-鍺配合物，考察葛根素及其配合物的抗炎活性.對(duì)于開(kāi)發(fā)抗炎活性高、不良反應(yīng)小的新型抗炎藥物具有重要的理論指導(dǎo)意義及實(shí)用價(jià)值.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

葛根素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%，陜西慧科植物有限公司)，二氧化鍺(分析純，上海源葉生物科技有限公司)，其他試劑均為分析純.SJH-2S數(shù)控精密恒溫水浴鍋(寧波天恒儀器廠)，ESJ205-4電子分析天平(沈陽(yáng)龍騰電子有限公司)，pHS-3C數(shù)字酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠)，JHS-1/90電子恒速攪拌器(杭州儀表電機(jī)廠)，F(xiàn)TIR-650傅立葉變換紅外光譜儀(天津港東科技發(fā)展有限公司)，TV-1901雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，DHG-9240A鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種(KM)小鼠，18～22 g，雄性，由長(zhǎng)春高新醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供.

1.3 葛根素-鍺配合物的合成

鍺標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取二氧化鍺5.230 0 g，用50 mL1 mol/L氫氧化鈉溶液溶解，置于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，得到濃度為0.5 mol/L的鍺標(biāo)準(zhǔn)溶液100 mL，備用.

稱(chēng)取葛根素2.081 9 g加50 mL無(wú)水甲醇，攪拌溶解至澄清后，加入10 mL鍺標(biāo)準(zhǔn)溶液，用鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH值為6，65 ℃水浴回流加熱12 h，冷卻、靜止、陳化48 h后，抽濾、洗滌，55 ℃下干燥，得白色固體.

1.4 葛根素-鍺配合物的紫外光譜測(cè)定

稱(chēng)取適量的葛根素及葛根素-鍺配合物樣品，以無(wú)水乙醇為溶劑，配制成濃度為0.001 mol/L的樣品溶液，按TV-1901紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)操作方法，用無(wú)水乙醇做基線(xiàn)調(diào)整，全波長(zhǎng)掃描，測(cè)繪葛根素及葛根素-鍺配合物的紫外吸收曲線(xiàn)(吸光度介于0.2～0.7之間).

1.5 葛根素-鍺配合物的紅外光譜測(cè)定

按樣品與KBr質(zhì)量比為1∶100，分別稱(chēng)取樣品和KBr置于瑪瑙研缽中，充分研細(xì)，在紅外烘箱中120 ℃左右干燥10 min，然后用藥匙取適量混合物于壓模機(jī)內(nèi)，確信壓模的各部件裝配正確且銜接良好.加壓20MPa，停留70～75 s，卸下壓片機(jī)的壓力，小心旋開(kāi)壓模，即可得到一直徑約13 mm的透明、無(wú)裂痕的薄片，然后在4000～400 cm-1對(duì)樣品依次進(jìn)行紅外光譜掃描.

1.6 葛根素-鍺配合物的抗炎活性研究

將昆明種小鼠24只隨機(jī)分為4組，每組6只.分別為生理鹽水組(空白對(duì)照組)、氫化可的松組(陽(yáng)性對(duì)照組)、葛根素組(樣品組)、葛根素-鍺配合物組(樣品組). 現(xiàn)將各藥物(葛根素、葛根素-鍺配合物、氫化可的松注射劑)用生理鹽水配成0.15 mg/mL的溶液.按0.01 mL/g劑量腹腔注射各藥物，每日兩次，連續(xù)給藥3 d，空白對(duì)照組注射相同體積的生理鹽水.最后一次給藥30 min后將0.02 mL二甲苯致炎劑注射在小鼠右耳中心，左耳不做處理.1 h后，剪下雙耳，用打孔器分別在左右耳同一部位打下圓片，電子分析天平秤重.左右耳片重量差值為腫脹度.腫脹度抑制率按下式計(jì)算：

腫脹度抑制率=(空白對(duì)照組腫脹度-給藥組腫脹度)/空白對(duì)照組腫脹度.

2 結(jié)果與分析

2.1 葛根素-鍺配合物的紫外光譜分析

葛根素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1.葛根素、葛根素-鍺配合物的紫外吸收曲線(xiàn)見(jiàn)圖2.由圖1可知，葛根素為異黃酮類(lèi)化合物.由圖2可知，葛根素出現(xiàn)兩個(gè)吸收峰，其中211 nm處吸收峰是由苯甲酰系統(tǒng)(A環(huán)和C環(huán)共軛)引起的，252 nm處吸收峰是由肉桂酰系統(tǒng)引起的(B環(huán)和C環(huán)共軛).較之葛根素，葛根素與鍺反應(yīng)后所得配合物的紫外吸收情況發(fā)生了明顯變化.其中252 nm處的吸收峰明顯向短波方向移動(dòng)，發(fā)生藍(lán)移，藍(lán)移到221 nm處.但211 nm處的吸收峰位置幾乎沒(méi)動(dòng).說(shuō)明葛根素與鍺發(fā)生配位的基團(tuán)是B環(huán)上的4′位酚羥基，而不是A環(huán)上的7位酚羥基.這也符合葛根素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，A環(huán)中的7位酚羥基受D-吡喃葡萄糖環(huán)空間位阻的影響，不易與金屬離子配位.

圖1 葛根素的化學(xué)結(jié)構(gòu)

圖2 葛根素、葛根素-鍺配合物的紫外吸收光譜

2.2 葛根素-鍺配合物的紅外光譜分析

葛根素、葛根素-鍺配合物的紅外光吸光譜見(jiàn)

圖3.從葛根素紅外圖中可以看出，強(qiáng)且寬的峰3 401 cm-1是分子間羥基締合特征峰；1 657 cm-1處的吸收峰為羰基的伸縮振動(dòng)峰；1 511 cm-1和1 434 cm-1處的吸收峰為芳環(huán)骨架振動(dòng)特征峰；1 396 cm-1處的吸收峰為-OH面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰；和1 180 cm-1處出現(xiàn)的峰則是酚羥基的C—O伸縮振動(dòng)峰；1 056 cm-1和1 265 cm-1處出現(xiàn)的中等強(qiáng)度吸收峰是C—O—C對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)和不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)吸收峰；887 cm-1處的吸收峰為D-吡喃葡萄糖環(huán)的特征振動(dòng)峰.

圖3 葛根素和葛根素-鍺配合物的紅外光譜圖

葛根素與鍺形成配合物后，羥基締合特征峰在3 432 cm-1處出現(xiàn)，并且寬度變窄，說(shuō)明葛根素的酚羥基與鍺形成配合物，使羥基的數(shù)目減少，引起了羥基締合峰強(qiáng)度變?nèi)酰瑥亩冋?羰基的伸縮振動(dòng)峰在1 652 cm-1處出現(xiàn)，與葛根素相比，未有較大變化，說(shuō)明鍺與葛根素上的羰基沒(méi)有發(fā)生配位.葛根素配合物在802 cm-1出現(xiàn)了一個(gè)新峰，應(yīng)該為Ge-O振動(dòng)峰.1 056 cm-1和1 265 cm-1處的峰基本沒(méi)變，表明C環(huán)上的氧未與金屬鍺發(fā)生配位.另外，與葡萄糖分子相關(guān)的一些峰沒(méi)有變化，說(shuō)明鍺與D-吡喃葡萄糖環(huán)上的基團(tuán)沒(méi)有發(fā)生作用.

綜合紫外和紅外圖譜的特點(diǎn)，推斷葛根素分子中的4′酚羥基與金屬鍺發(fā)生了配位.

2.3 葛根素-鍺配合物的抗炎活性

抗炎結(jié)果列于表1及圖4.由表1及圖4可知，葛根素有一定的抗炎性能，但其抗炎活性(32.49%)小于氫化可的松(48.74%).當(dāng)葛根素與鍺形成配合物后，抗炎活性大大增加，為75.91%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于氫化可的松的48.74%.

表1 葛根素-鍺配合物的抗炎活性結(jié)果

圖4 葛根素-鍺配合物的抗炎活性結(jié)果

3 結(jié) 語(yǔ)

本文以葛根素為配體，以鍺為配位中心，合成

了葛根素-鍺配合物，通過(guò)紫外及紅外技術(shù)，證實(shí)了葛根素分子中的4′酚羥基與金屬鍺發(fā)生了配位.采用小鼠耳廓腫脹法考察了葛根素-鍺配合物的抗炎活性，結(jié)果表明，配合物的抗炎活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于葛根素及臨床常用的甾體抗炎藥物-氫化可的松,該配合物有望成為新型非甾體抗炎藥物.

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Study on synthesis and anti-inflammatory activity of coordination compound of puerarin-germanium

WANG Yu-ning1,2, ZHANG Kuo1,2, JIANG Qi1,2, XU Yi-ying1,2, SUI Bing1,2, SUN Peng1,2,XING Zhi-hua1,2, ZHANG Xiu-juan1,2, SUN Zhi-wei1,2

(1. School of Pharmacy, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China; 2. Research Center on Life Sciences and Environmental Sciences, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China )

The coordination compound of puerarin-germanium (PUE-Ge) was synthesized with puerarin(PUE) and germanium oxide as raw materials. The chemical structure of PUE-Ge was determined using ultraviolet spectroscopic (UV) and fourier infrared spectroscopic (IR) technology preliminarily. With swelling degree and inhibiting rate on the swelling of mice as index, the anti-inflammatory activity of PUE-Ge was preliminarily examined on the model of mouse ear edema induced by xylene. The UV and IR characterization showed that the coordination compound of PUE-Ge was synthesized through reacting between germanium ion and 4′-phenolic hydroxyl group (B ring) instead of 7-phenolic hydroxyl group (A ring) or carbanyl group(C ring) of puerarin. The anti-inflammatory activity of PUE-Ge (the inhibiting rate on the swelling of mice was 75.91%) was far higher than puerarin (the inhibiting rate on the swelling of mice was 32.49%) and hydrocortisone, a kind of clinical steroidal anti-inflammatory drug (the inhibiting rate on the swelling of mice was 48.74%).PUE-Ge is expected to become a new type of non-steroidal anti-inflammatory drug.

puerarin; germanium; coordination compound; anti-inflammatory activity

2014-10-28.

大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201410240002)(國(guó)家級(jí))；黑龍江省教育廳科研項(xiàng)目(12531156)

王鈺寧(1994-)，女，研究方向：藥物抗炎活性研究.

邢志華(1971-)，女，博士，副教授，研究方向：藥物結(jié)構(gòu)修飾及其活性研究.

R914

A

1672-0946(2015)02-0149-04