解淀粉芽胞桿菌NCPSJ7對(duì)采后蘋果輪紋病的生物防治作用

黃玲玲 ，裘紀(jì)瑩，唐 琳，陳相艷，劉孝永，周慶新，王永慧，陳蕾蕾

(1山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所，濟(jì)南 250100;2山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南 250014;3山東省臨沂市河?xùn)|區(qū)農(nóng)業(yè)局，山東臨沂 276034)

采后腐爛是水果采后需要預(yù)防的一個(gè)重要問(wèn)題，發(fā)達(dá)國(guó)家10%—30%的水果是損失于采后腐爛，在發(fā)展中國(guó)家損失率更大［1］。果蔬采后腐爛主要是真菌病害［2］，而蘋果的采后損失主要由輪紋病和炭疽病引起。蘋果輪紋病菌通過(guò)危害蘋果樹的枝干和果實(shí)，引起采前和采后蘋果輪紋病的發(fā)生［3］。目前控制蘋果輪紋病的方法仍然以化學(xué)藥劑為主，尤其是果園蘋果輪紋病的防治中長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥，造成果園的污染［4］，同時(shí)病菌抗藥性的產(chǎn)生導(dǎo)致傳統(tǒng)化學(xué)藥劑的防效降低［5，6］，應(yīng)該加以重視。采后蘋果輪紋病的防治也多采用化學(xué)藥劑浸泡的方法，如采用500 倍復(fù)方多菌靈預(yù)先浸泡1min，再自然晾干貯藏［7］。由于使用化學(xué)農(nóng)藥的種種危害，目前科學(xué)界在不斷地尋找一些新型低毒可替代化學(xué)殺菌劑。鄒宗峰等［8］開展了新型農(nóng)藥60.00%唑醚·代森聯(lián)(百泰)WG 和25.00%吡唑醚菌酯(凱潤(rùn))EC 防治蘋果輪紋病的試驗(yàn)，結(jié)果顯示這兩種新型農(nóng)藥的防治效果比較理想。王芳芳［9］研究了水楊酸對(duì)采后蘋果果實(shí)輪紋病的抑制效果，還有一些研究者利用生物防治的方法抑制采后蘋果輪紋病，比如某些地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、木霉、熒光假單胞菌等菌體及其代謝產(chǎn)物的單種或復(fù)合生物防治都有一定的效果［10-12］。

解淀粉芽孢桿菌屬于芽胞桿菌屬，是一種與枯草芽孢桿菌具有很高親緣性并且具有廣泛抑菌譜的細(xì)菌，其菌體及一系列代謝產(chǎn)物可以抑制細(xì)菌以及真菌的生長(zhǎng)［13-15］，并且毒性較低［16］，是一類很有前途的生防制劑來(lái)源。目前已經(jīng)開發(fā)出以解淀粉芽孢桿菌為活性成分的微生物殺菌劑，并獲得了生產(chǎn)許可［17］。同時(shí)，目前文獻(xiàn)報(bào)道的解淀粉芽孢桿菌抗菌代謝產(chǎn)物有伊枯草菌素、桿菌霉素D、表面活性素等脂肽類抗生素［18-21］以及抗菌蛋白等［22，23］。本研究通過(guò)探討解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7 菌體及其抗菌蛋白對(duì)蘋果輪紋病菌LW182 的抑制作用以及對(duì)采后蘋果輪紋病的生物防治作用，以期更深入地了解解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7 的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果:市售紅富士;解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7 由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定、保存;輪紋病菌LW182 由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所惠贈(zèng)。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基［24］用于拮抗菌的培養(yǎng)和保存;PDA 培養(yǎng)基［24］用于病原菌的培養(yǎng)、保存和牛津杯法測(cè)定抑菌效果;發(fā)酵培養(yǎng)基［25］用于拮抗菌胞外抗菌蛋白的發(fā)酵，具體配方為:葡萄糖5g，酵母浸膏7.5g，蛋白胨7.5g，(NH4)2SO45g，NaCl 5g，蒸餾水1 000mL，pH 7.0;納他霉素購(gòu)自上海耐今實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CR22GⅢ高速冷凍離心機(jī)，日本日立公司;Stirred Cell Model 8400 超濾裝置(配有3000u 超濾膜和氮?dú)夤?，美國(guó)Millipore;霉菌培養(yǎng)箱，韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司;PQX-430D 智能人工氣候箱，寧波東南儀器有限公司。

1.3 牛津杯法測(cè)定抑菌效果

1.3.1 病原菌孢子菌懸液的制備

將蘋果輪紋病菌LW182 接種于PDA 平板，28℃培養(yǎng)7d，即為病原菌平板。無(wú)菌條件下用直徑7mm 打孔器打孔取一環(huán)放入滅菌的1.5mL EP 管中，用無(wú)菌刀片切碎并添加1mL 無(wú)菌水混勻，制備病原菌孢子菌懸液，4℃保存，備用。

1.3.2 處理液的制備

將拮抗菌NCPSJ7 接種于牛肉膏蛋白胨平板，37℃培養(yǎng)24h。挑取單菌落于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37℃，180r/min 搖床培養(yǎng)24h，按3%接種量將已活化好的拮抗菌接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，180r/min 搖床培養(yǎng)6d，既得供試發(fā)酵液。發(fā)酵液于4℃，10 000r/min 離心20min，取出上清液，菌體沉淀加無(wú)菌水清洗再離心，最后調(diào)節(jié)菌濃度約為105個(gè)/mL，既得供試菌懸液。發(fā)酵上清液經(jīng)超濾杯用截留分子量為5KDa 的膜超濾，濃縮5 倍，并用0.22μm 濾膜過(guò)濾除菌，即為供試胞外抗菌蛋白粗提液。

1.3.3 抑菌圈試驗(yàn)

取100μL 病原菌孢子菌懸液于空白平皿中，倒入PDA 培養(yǎng)基混勻，待凝固后，每個(gè)平板放入1 個(gè)牛津杯，分別添加菌懸液、發(fā)酵液及不同濃度的胞外抗菌蛋白粗提液100μL，于28℃培養(yǎng)7d 后觀察牛津杯周圍的抑菌圈直徑，并以無(wú)菌水作為空白對(duì)照。

1.4 果實(shí)打孔接種法試驗(yàn)抑菌效果

1.4.1 果實(shí)預(yù)處理

分別選擇無(wú)病害、無(wú)傷口、成熟度和大小一致的市售紅富士蘋果，用2%NaClO 浸泡2min，再用自來(lái)水沖洗干凈，自然晾干。

1.4.2 果實(shí)打孔接種法試驗(yàn)

在果實(shí)表面用7mm 打孔器打直徑7mm，深5mm 的孔，在傷口處接種20μL 病原菌孢子菌懸液以檢測(cè)病原菌果實(shí)致病性，將果實(shí)放入保鮮盒，置于相對(duì)濕度95%左右，28℃的恒溫培養(yǎng)箱，定期觀察梨果實(shí)腐爛情況。在每個(gè)傷口接種20μL 病原菌孢子菌懸液，并且分別接種40μL NCPSJ7 發(fā)酵液、菌懸液和抗菌蛋白粗提液來(lái)檢驗(yàn)NCPSJ7 對(duì)接種蘋果的輪紋病菌的抑制效果。以單獨(dú)接種病原菌孢子菌懸液和無(wú)菌水的果實(shí)為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。每次處理3 個(gè)果實(shí)，重復(fù)3 次。

1.5 果實(shí)防腐試驗(yàn)

分別將NCPSJ7 發(fā)酵液、抗菌蛋白粗提液和那他霉素(3mg/mL)與病原菌孢子菌懸液以2∶1 的比例混勻，均勻噴灑在處理好的蘋果表面，待蘋果自然晾干后用保鮮盒分裝，并置于相對(duì)濕度90%，28℃的人工氣候箱中，定期觀察記錄果實(shí)腐爛情況。分別以單獨(dú)噴灑病原菌和無(wú)菌水的果實(shí)為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。每組處理10 個(gè)蘋果。壞果率計(jì)算:壞果率/%=壞果數(shù)(個(gè))/果實(shí)總數(shù)(個(gè)) ×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 牛津杯法測(cè)定抑菌效果

首先考察NCPSJ7 菌懸液、發(fā)酵液及胞外抗菌蛋白粗提液對(duì)蘋果輪紋病病原菌LW182 的平皿抑制效果(表1)。結(jié)果顯示，各處理液對(duì)蘋果輪紋病菌LW182 均有一定的抑制作用，其中菌懸液的抑制效果最好，其次是發(fā)酵液，但是兩者差異不是特別明顯。胞外抗菌蛋白粗提液和菌懸液、發(fā)酵液相比，效果略差，但是抑菌效果也比較明顯。

表1 不同處理液對(duì)病原菌蘋果輪紋病菌LW182 的抑制作用

2.2 果實(shí)打孔接種法試驗(yàn)抑菌效果

首先驗(yàn)證蘋果輪紋病病原菌LW182 對(duì)蘋果果實(shí)的致病性，從附圖可見，采用打孔法接種的LW182 具有很強(qiáng)的侵染蘋果果實(shí)的能力，主要表現(xiàn)為:整個(gè)蘋果腐爛，蘋果表面輪紋狀斑紋、變色和出水比較嚴(yán)重，接種區(qū)域有明顯的病原菌菌絲生長(zhǎng)。可見，LW182 可以作為蘋果輪紋病侵染蘋果的指示菌。

附圖 LW182 侵染蘋果試驗(yàn)

進(jìn)一步研究NCPSJ7 對(duì)打孔法接種蘋果的輪紋病菌LW182 的抑制效果，結(jié)果如表2 所示。和陽(yáng)性對(duì)照相比，供試的NCPSJ7 各處理液對(duì)接種果實(shí)的輪紋病菌LW182 均有很好的抑制作用，主要表現(xiàn)為:果實(shí)病斑直徑明顯變小，而且具有比較明顯的抑制病原菌菌絲生長(zhǎng)和防止果實(shí)變色作用。同時(shí)抑制效果的差異較大，3 種處理液中以抗菌蛋白粗提液效果最好。用抗菌蛋白粗提液處理后的果實(shí)病斑直徑小，接種區(qū)域無(wú)菌絲生長(zhǎng)，果實(shí)表面不變色。

表2 NCPSJ7 處理液對(duì)接種蘋果病原菌的抑制

2.3 果實(shí)防腐試驗(yàn)

采用發(fā)酵液和抗菌蛋白粗提液進(jìn)行蘋果防腐保藏試驗(yàn)，結(jié)果如表3、表4 所示。從表3 來(lái)看，噴灑NCPSJ7發(fā)酵液及其稀釋液的3 個(gè)試驗(yàn)組中，保藏前期的壞果率隨發(fā)酵液濃度的降低而降低，保藏后期的壞果率隨發(fā)酵液濃度降低而增加。和陽(yáng)性對(duì)照相比，發(fā)酵液原液組前期壞果率比陽(yáng)性對(duì)照高，后期比陽(yáng)性對(duì)照略低。分析可能的原因是輪紋病菌LW182 侵染蘋果有一定的潛伏期，前期侵染能力不強(qiáng)，但潛伏期后的侵染迅猛。而果實(shí)保藏前期濃度較高的拮抗菌會(huì)侵染損傷果加速其腐爛，導(dǎo)致保藏前期的壞果率高。發(fā)酵液的10 倍和100 倍稀釋液組可以延緩果實(shí)腐爛，但保藏后期作用不明顯，可能是濃度較低的拮抗菌不足以發(fā)揮其防腐作用。

表3 發(fā)酵液的蘋果防腐保藏試驗(yàn)結(jié)果(壞果率，%)

從表4 來(lái)看，采用胞外抗菌蛋白處理蘋果，陽(yáng)性對(duì)照組于7d 后開始腐爛，而胞外抗菌蛋白處理組12d 才開始腐爛。尤其是20d 以后，陽(yáng)性對(duì)照組腐爛迅速，而胞外抗菌蛋白處理組的壞果率明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組，并且效果與那他霉素相當(dāng)?？梢姡琋CPSJ7 胞外抗菌蛋白處理能有效降低LW182 對(duì)蘋果的侵染，從而降低壞果率，延長(zhǎng)保藏期。

表4 胞外抗菌蛋白的蘋果保藏試驗(yàn)結(jié)果(壞果率，%)

3 結(jié)論

本文采用平板牛津杯法、果實(shí)打孔接種法研究解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7 菌懸液、發(fā)酵液和抗菌蛋白粗提液對(duì)蘋果輪紋病菌LW182 的抑制作用，采用果實(shí)防腐試驗(yàn)研究發(fā)酵液和抗菌蛋白粗提液在采后蘋果輪紋病生物防治中的應(yīng)用價(jià)值。牛津杯法的結(jié)果顯示菌懸液對(duì)LW182 的抑制效果最好，其次是發(fā)酵液，抗菌蛋白粗提液的效果略差，但是抑菌效果也比較明顯。果實(shí)打孔接種法顯示抗菌蛋白粗提液的抑制效果非常好，可明顯減小果實(shí)病斑直徑，抑制接種區(qū)域病原菌菌絲生長(zhǎng)及果實(shí)變色，發(fā)酵液和菌懸液的效果略差，但和陽(yáng)性對(duì)照相比，抑制作用也比較明顯?？梢姡┰嚨? 種處理液對(duì)蘋果輪紋病菌LW182 都有很好的抑制作用，但是采用上述兩種方法得到的結(jié)果也有不一致之處，供試處理液對(duì)病原菌的抑制效果受載體的影響很大。采用發(fā)酵液和抗菌蛋白粗提液噴灑蘋果表面進(jìn)行防腐保藏效果的研究，結(jié)果抗菌蛋白粗提液對(duì)同時(shí)噴灑蘋果輪紋病菌的果實(shí)具有非常明顯的防治作用，效果和納他霉素相當(dāng)，但發(fā)酵液的效果不明顯。這和我們前期進(jìn)行的梨青霉病生物防治的結(jié)果類似?？梢姡獾矸垩挎邨U菌NCPSJ7 主要是通過(guò)分泌抗菌蛋白來(lái)抑制蘋果輪紋病菌，而且NCPSJ7 菌體可能對(duì)蘋果果實(shí)產(chǎn)生一些危害。所以，NCPSJ7 抗菌蛋白適合用于防治蘋果輪紋病，但直接利用該菌株的菌體進(jìn)行生物防治的構(gòu)想是不現(xiàn)實(shí)的。下一步我們將對(duì)解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7 胞外抗菌蛋白的噴霧干燥工藝及與其它防腐劑、保鮮劑的復(fù)配等開展進(jìn)一步的研究。

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