雙波長HPLC法測定益心舒膠囊中4種成分的含量Δ

王紹志，張熙潔，付連浩，劉曉紅（唐山市工人醫(yī)院，河北唐山 063000）

益心舒膠囊是由人參、麥冬、五味子、黃芪、丹參、川芎、山楂等七味中藥組成的復方制劑，該制劑組方以生脈飲方為基礎(chǔ)，增加了黃芪、丹參、川芎、山楂四味藥，提高了益氣復脈、養(yǎng)陰生津的功效，增加了活血化瘀的作用。因此，藥理作用較生脈飲方更勝一籌，是目前治療缺血性心血管疾病、心律失常及抗休克的中成藥。該藥已收錄于2010年版《中國藥典》（一部）成方制劑部分[1]，目前其質(zhì)控定量標準已有采用高效液相色譜（HPLC）法測定1～3種成分[2-8]，以及對益心舒片的脂溶性成分測定[9-10]的報道。為更好地控制本制劑內(nèi)在質(zhì)量，筆者參考了相關(guān)文獻[11-12]，采用雙波長HPLC-二極管陣列檢測（DAD）法，建立了測定益心舒膠囊中4 種水溶性有效成分（丹參素、原兒茶醛、阿魏酸、丹酚酸B）的定量分析方法，并對3 個批次藥品進行含量測定。

1 材料

1200 系列HPLC 儀，包括G1315D DAD 器、G1311A 四元泵、G1329A 自動進樣器、G1316A 柱溫箱、G1322A 脫氣機、化學工作站B.03.02版（美國Agilent公司）；細胞型1810D摩爾純水機（上海摩勒科學儀器有限公司）；CP225D 型電子天平（德國Sartorius 公司）；80-2 型離心沉淀機（上海手術(shù)器械廠）；FS-150N型超聲波處理器（上海生析超聲儀器有限公司）。

益心舒膠囊（貴州信邦制藥股份有限公司，批號：20120211、20121110、20121209，規(guī)格：0.4 g×36 粒/盒）；丹參素、原兒茶醛、阿魏酸、丹酚酸B對照品（均購于中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110855-200507、110810-200205、0773-9910、111562-201212，純度均為100%）；甲醇、乙腈均為色譜純，甲酸、冰醋酸、磷酸均為分析純，水為超純水（摩爾純水機自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Eclipse XDB-C18（150 mm ×4.6 mm，5μm）；流動相：0.5%磷酸水溶液（A）-甲醇（B）-乙腈（C），梯度洗脫（洗脫程序詳見表1）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：280 nm（丹參素、原兒茶醛和丹酚酸B）、320 nm（阿魏酸）；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μl。

2.2 溶液的制備

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取丹參素、原兒茶醛、阿魏酸、丹酚酸B對照品適量，置于同一10 ml量瓶中，用75%甲醇溶解定容，經(jīng)0.45 μm 有機膜濾過，即得含各成分質(zhì)量濃度分別為0.212、0.35、0.2、3 mg/ml的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取益心舒膠囊約0.3 g，精密稱定，置于10 ml 量瓶中，加75%甲醇稀釋至刻度，超聲（功率：80 W，頻率：20 kHz）處理30 min 后，冷卻，再用75%甲醇補足減失的質(zhì)量，以半徑為5 cm、3 500 r/min 離心10 min，吸取上清液，經(jīng)0.45 μm有機膜濾過，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液 按益心舒膠囊組方工藝分別制成不含丹參、川芎的兩種陰性對照制劑，再按“2.2.2”項下方法制成陰性對照溶液，即得。

2.3 專屬性試驗

分別取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μl，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可見，丹參素、原兒茶醛、阿魏酸、丹酚酸B峰形良好，保留時間分別在8、12、31、40 min 左右，理論板數(shù)均大于10 000，與其相鄰色譜峰分離度均大于1.5。對陰性對照溶液進樣分析，將所得色譜圖與供試品圖進行比較，發(fā)現(xiàn)陰性對照溶液對所測組分的測定無干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，用75%甲醇溶液倍比稀釋成系列混合對照品標準溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，回歸方程和線性范圍詳見表2。

2.5 最低檢測限

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，逐倍稀釋，精密吸取10 μl，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以信噪比為3計算丹參素、原兒茶醛、阿魏酸、丹酚酸B 的最低檢測限分別為1.06、0.10、0.03、150 ng/ml。

2.6 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果，丹參素、原兒茶醛、阿魏酸、丹酚酸B 峰面積的RSD 分別為0.74%、1.70%、0.85%、1.50%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液（批號：20120211）適量，分別于放置1、2、4、8、10、12 h 時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，丹參素、原兒茶醛、阿魏酸、丹酚酸B 峰面積的RSD 分別為0.97%、0.89%、1.30%、1.60%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復性試驗

圖1 高效液相色譜圖A.混合對照品；B.供試品；C.缺丹參的陰性對照品；D.缺川芎的陰性對照品；1.丹參素；2.原兒茶醛；3.阿魏酸；4.丹酚酸BFig 1 HPLC chromatogramsA.mixed reference substance；B.test sample；C.negative sample without Salvia miltiorrhiza；D.negative sample without Ligusticum chuanxiong；1.tanshinol；2.protocatechuic aldehyde；3.ferulic acid；4.salvianolic acid B

表2 回歸方程和線性范圍Tab 2 Regression equations and linear ranges

取同一批樣品（批號：20120211）6 份，每份約0.3 g，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，丹參素、原兒茶醛、阿魏酸、丹酚酸B 峰面積的RSD 分別為1.10%、1.30%、0.82%、1.90%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量的益心舒膠囊（批號：20120211）9 份，每份約0.15 g，精密稱定，平行分組，每組3份，分別按相當于樣品中各組分含量的80%、100%、120%的量加入混合對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab 3 Results of recovery tests（n＝9）

2.10 樣品含量測定

取3 批樣品各約0.3 g，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定并計算樣品含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測定結(jié)果（，n＝3）Tab 4 Results of content determination of samples（，n＝3）

表4 樣品含量測定結(jié)果（，n＝3）Tab 4 Results of content determination of samples（，n＝3）

3 討論

3.1 提取方法的選擇

在提取條件的選擇上，分別對不同提取溶劑及超聲時間進行了比較，分別以水、甲醇、乙腈、甲酸、冰醋酸、磷酸進行，最終發(fā)現(xiàn)以75%甲醇萃取，超聲處理30 min 時，各組分分離度較好。

3.2 流動相的選擇

選取0.5%磷酸水溶液-甲醇-乙腈為流動相進行梯度洗脫，不僅可以得到滿意峰形以及相對較大的峰面積，而且分離效果與靈敏度均較好。

3.3 檢測波長的選擇

DAD 可以同時選擇多個波長進行檢測。本文選擇丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B 在280 nm，阿魏酸在320 nm 波長處進行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各主要成分在各自的最大吸收波長下均可得到較好分離。

綜上所述，該方法簡單易行、重復性好，可用于益心舒膠囊的質(zhì)量控制。

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