金黃色葡萄球菌CP8-FnBPB-ClfA偶聯(lián)蛋白對金黃色葡萄球菌性奶牛乳房炎的免疫效果研究

楊 嵐，郝永清，何 焱，潘海婷，許金朋，于自民

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 微生物與免疫學(xué)實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

奶牛乳房炎(Bovine mastitis)是一種影響奶牛業(yè)發(fā)展的常見、多發(fā)疾病，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟損失，并對公共衛(wèi)生和人類健康造成危害。奶牛乳房炎由多種微生物感染引起，其中最主要為金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[1]。

S.aureus 的毒力因子主要有粘附素、莢膜多糖、毒素和酶[2]，其對乳腺上皮細(xì)胞的粘附和定植被認(rèn)為是S.aureus 性乳房炎的致病機制之一[3]。在感染的早期，只有當(dāng)S.aureus 粘附到宿主細(xì)胞上時，莢膜和毒素才能開始表達(dá)，因此粘附是感染的關(guān)鍵。范鑫等研究表明，粘附素的纖連素結(jié)合蛋白(FnBPs)和凝集因子A(ClfA)在研制S.aureus 性乳房炎疫苗時具有重要意義[4]。而CPs 能夠干擾中性粒細(xì)胞對S.aureus 的吞噬作用，逃避宿主的免疫防御系統(tǒng)，導(dǎo)致S.aureus 易于感染乳腺組織[5]。研究表明，將免疫原性較好的FnBPB-ClfA 融合蛋白作為載體和CP 偶聯(lián)免疫小鼠可以產(chǎn)生良好的免疫效果[6]。

脂質(zhì)體(Liposome)、氫氧化鋁(ALUM)及大腸桿菌不耐熱腸毒素B(LTB)均為有效的疫苗佐劑[7-10]。關(guān)于針對奶牛S.aureus 毒力因子的疫苗研究大多只進(jìn)行了實驗動物免疫保護(hù)試驗，本實驗將脂質(zhì)體包被的CP8-FnBPB-ClfA、ALUM 乳化的CP8-FnBPBClfA，及ALUM 乳化CP8-FnBPB-ClfA 后與LTB 混合分別免疫泌乳期奶牛，檢測免疫后不同期血清中IgG 和IgA、乳汁中IgG 含量、體細(xì)胞數(shù)(Somatic cell count，SCC)，以評價其對S.aureus 性奶牛乳房炎的免疫效果。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料 牛源血清IgG ELISA 試劑盒、牛源血清IgA ELISA 試劑盒、牛源牛乳IgG ELISA試劑盒購自R&D SYSTEMS 公司；SCC 檢測試劑盒及ADAM-SCC 檢測儀購自Digital Bio Technology 公司；快速革蘭氏染色液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；24 頭健康的同齡(2 歲～3 歲)同胎次并且生產(chǎn)時間差30 d 以內(nèi)的泌乳期荷斯坦奶牛由內(nèi)蒙古呼和浩特市和林格爾縣恩和牧場提供。

1.2 抗原的制備

1.2.1 CP8-FnBPB-ClfA 的制備 按照文獻(xiàn)[6]的方法，將已純化濃度為72.94 %的CP8 通過EDC 法與FnBPB-ClfA 偶聯(lián)，制備CP8-FnBPB-ClfA 偶聯(lián)物，使用BCA 試劑盒測定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度至0.81 mg/mL 進(jìn)行免疫抗原的制備。

1.2.2 脂質(zhì)體佐劑抗原的制備 將卵磷脂、膽固醇和磷脂酰乙醇胺按質(zhì)量比7∶3∶2 溶于體積比為2∶1 的三氯乙烷、甲醇混合溶液中，0.45 μm 濾膜過濾，45 ℃水浴后抽真空干燥。將干燥后所得磷脂片層每100 mg 加入5 mL CP8-FnBPB-ClfA，振蕩混勻，制成脂質(zhì)體佐劑抗原。

1.2.3 ALUM 佐劑抗原的制備 250 mL 5%Al2(SO4)3溶液與100 mL 5 % NaOH 溶液混合，強烈攪拌，生理鹽水離心洗滌沉淀2 次，在沉淀中再次加入20 mL生理鹽水，使沉淀懸浮成為懸濁液，即得ALUM 佐劑，將其與CP8-FnBPB-ClfA 1∶1(v/v)混合，使用漩渦混合器，以3 000 r/min 的速度振蕩30 min，充分混勻，即為ALUM 佐劑抗原。

1.2.4 LTB 佐劑抗原的制備 將LTB 與1.2.3 中ALUM 乳化抗原直接混合，使LTB 終濃度為40μg/mL，制成LTB 佐劑抗原。

1.3 動物分組及實驗設(shè)計 30 頭奶牛隨機分為5組，分組及處理情況見表1。

表1 實驗動物免疫分組Table 1 Immunization groups of laboratory animals

用不同佐劑抗原進(jìn)行免疫接種，采取臀部肌肉注射方式，每21 d 免疫一次，共免疫3 次。免疫劑量以抗原量計算，5 mg/頭。

1.4 牛乳中SCC測定 采集各時段乳汁樣品，采樣時棄前3 把乳，每天每次分別在早、中、晚采集，將這3 次取得的乳汁樣品均勻混合，吸取中間液面的混合乳汁樣品100 μL，與染液1∶1(v/v)混合，上下顛倒混勻，吸取10 μL 至SCC 檢測芯片孔道，通過SCC 計數(shù)儀進(jìn)行檢測。

1.5 牛血清中CP8-FnBPB-ClfA抗體水平測定采用ELISA 法對牛血清中CP8-FnBPB-ClfA 抗體進(jìn)行測定。以CP8-FnBPB-ClfA 包被酶標(biāo)板，分別以免疫牛和對照牛的待測血清為一抗，兔抗牛IgG-HRP為二抗(1∶2 000)，TMB 顯色，測定OD490nm值。

1.6 牛血清中總IgG、IgA含量及牛乳中IgG含量測定 使用牛源血清IgG ELISA 試劑盒和牛源血清IgA ELISA 試劑盒檢測血清中的IgG、IgA 含量，采用牛源牛乳IgG ELISA 試劑盒檢測牛乳中的IgG 含量，試驗步驟參見試劑盒說明書。

1.7 數(shù)據(jù)分析 采用SAS 9.0 統(tǒng)計學(xué)軟件(SAS Institute Inc，Cary，NC)分析實驗數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 牛乳中SCC測定 使用SCC 計數(shù)儀對實驗組和對照組免疫前后不同時間乳汁樣品中的SCC 進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，各免疫組奶牛乳汁中SCC 保持穩(wěn)定，低于50 萬個/mL，與對照組相比差異極顯著(p<0.01)，而對照組SCC 呈現(xiàn)波動狀態(tài)，均高于50萬個/mL，伴有患乳房炎的可能；在免疫期間，3、4 組奶牛乳汁中的SCC 低于1、2 組，與之相比差異顯著(p<0.05)，但3、4 組間差異不顯著(p>0.05)(圖1)。

圖1 免疫期內(nèi)SCC 數(shù)動態(tài)變化Fig.1 The dynamic changes of SCC in immunity period milk

2.2 牛血清中CP8-FnBPB-ClfA抗體測定 采用間接ELISA 法，分別對免疫組及對照組牛血清進(jìn)行CP8-FnBPB-ClfA 抗體測定。結(jié)果顯示，免疫14 d后，各免疫組奶牛血清中CP8-FnBPB-ClfA 抗體水平升高，與對照組相比差異極顯著(p<0.01)；2 組抗體水平升高，與其他各免疫組相比差異極顯著(p<0.01)，但其水平隨時間延長而下降；免疫21 d 后，3、4組抗體水平高于其他各免疫組，與各免疫組相比差異顯著(p<0.05)，3、4 組間差異不顯著(p>0.05)(圖2)。

2.3 牛血清中IgG及IgA含量測定 使用牛源IgG ELISA 試劑盒和牛源IgA ELISA 試劑盒對各組奶牛血清中的IgG 及IgA 含量進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，免疫14 d 后，各免疫組奶牛血清中IgG 及IgA 水平升高，與對照組相比差異極顯著(p<0.01)；2 組中IgG及IgA 含量升高，與其他免疫組相比差異極顯著(p<0.01)，但其含量隨時間的延長而下降；免疫21 d后3、4 組奶牛血清中IgG 及IgA 水平高于其他各免疫組，與各免疫組相比差異極顯著(p<0.01)，3、4組間差異不顯著(p>0.05)(圖3)。

圖2 免疫期內(nèi)牛血清中CP8-FnBPB-ClfA 抗體測定結(jié)果Fig.2 The results of test CP8-FnBPB-ClfA antibody in immunity period in bovine serum

圖3 奶牛血清中IgG(A)及IgA(B)含量測定結(jié)果Fig.3 Test results of bovine IgG(A)and IgA(B)concentration in serum

2.4 牛乳中IgG含量測定 使用牛源IgG ELISA 試劑盒對各組奶牛乳中的IgG 含量進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，免疫14 d 后，各免疫組奶牛乳汁中IgG 水平升高，與對照組相比差異極顯著(p<0.01)；2 組乳汁中IgG 水平升高，與其他免疫組相比差異極顯著(p<0.01)，但其含量隨時間的延長而下降；免疫21 d 后3、4組乳汁中IgG 水平高于其他各免疫組，與各免疫組相比差異極顯著(p<0.01)，3、4 組間差異不顯著(p>0.05)(圖4)。

3 討論

圖4 奶牛乳中IgG 含量測定結(jié)果Fig.4 Test results of bovine IgG concentration in milk

SCC 主要來自于血液的白細(xì)胞(Leucocytes)，可分為淋巴細(xì)胞和嗜中性白細(xì)胞兩種[11]。由于乳中的白細(xì)胞具有抵御外界微生物感染的作用，因此在細(xì)菌入侵乳房后，白細(xì)胞通過毛細(xì)血管內(nèi)皮間隙遷移至炎癥組織，白細(xì)胞數(shù)量升高，該乳區(qū)的SCC 也隨即增多[12]。許多國家均將SCC 作為衡量乳品質(zhì)的重要指標(biāo)。通常，國際上規(guī)定以SCC 每毫升50 萬為界定乳房炎的標(biāo)準(zhǔn)[13]。因此，SCC 可以作為監(jiān)測奶牛乳房炎的可靠指標(biāo)之一。

將包含F(xiàn)nbp 和ClfA 的DNA 疫苗免疫乳腺已感染S.aureus 的奶牛，能夠產(chǎn)生針對Fnbp 和ClfA 的抗體[14]。用CP5 免疫奶牛，可以產(chǎn)生持久的免疫學(xué)反應(yīng)[15]。因此，本實驗采用CP8-FnBPB-ClfA 免疫泌乳期奶牛具有可行性。

經(jīng)本研究證明，用CP8-FnBPB-ClfA 或CP8-FnBPB-ClfA 與不同佐劑混合免疫泌乳期奶牛，在免疫期內(nèi)，能夠有效降低奶牛乳汁中的SCC 至正常水平，或使SCC 基本維持在正常范圍內(nèi)不變，在一定程度上預(yù)防和治療S.aureus 性奶牛乳房炎，改善牛乳品質(zhì)，提高牛乳質(zhì)量。抗體含量是評價體液免疫效果的關(guān)鍵指標(biāo)，本實驗通過間接ELISA 及雙抗體夾心ELISA 法，對奶牛血清及乳汁中的抗體水平進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，以ALUM 佐劑乳化的CP8-FnBPB-ClfA 或ALUM 佐劑乳化的CP8-FnBPB-ClfA與LTB 混合后免疫泌乳期奶牛時，血清及乳汁中的抗體水平最高，持續(xù)時間最長；但ALUM 佐劑乳化抗原是否與LTB 混合，免疫效果差異不顯著(p>0.05)。以上結(jié)果表明，CP8-FnBPB-ClfA 經(jīng)ALUM 佐劑乳化免疫奶牛，可提高機體抗體水平，誘導(dǎo)奶牛的體液免疫反應(yīng)，因此ALUM 佐劑乳化的CP8-FnBPB-ClfA有望用于S.aureus 性奶牛乳房炎亞單位疫苗的進(jìn)一步研究，為S.aureus 性奶牛乳房炎的免疫防治提供實驗依據(jù)。

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