雞傳染性喉氣管炎病毒LJS09株致病性的研究

蔣 露，李慧昕，韓宗璽，孔憲剛，劉勝旺

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/禽呼吸道病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，黑龍江 哈爾濱 150001)

雞傳染性喉氣管炎病毒(Infectious larygotracheitis virus，ILTV)為皰疹病毒科、α-皰疹病毒亞科、傳染性喉氣管炎病毒屬成員，也稱禽皰疹病毒1型(Gallid herpesvirus1)[1]，由該病毒引起的雞傳染性喉氣管炎(ILT)是一種以急性上呼吸道癥狀為主的高度接觸性傳染病[2]。該病主要感染雞，以呼吸困難、喘息、流鼻涕、結(jié)膜炎、咳出帶血分泌物，剖檢可見(jiàn)喉頭和氣管粘膜腫脹出血，氣管內(nèi)有干酪性分泌物堵塞為特征[3]。發(fā)病雞出現(xiàn)體重及產(chǎn)蛋下降，并伴有不同程度的死亡，給養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。

從上世紀(jì)50年代以來(lái)我國(guó)大部分地區(qū)有不斷發(fā)生該病的報(bào)道，1992年以后在我國(guó)一些地區(qū)呈地方流行[4]。對(duì)于我國(guó)分離的一些病毒株如王崗株、煙臺(tái)株、安徽株和河北株等，已有關(guān)于其致病性的相關(guān)報(bào)道[5]。由于ILTV LJS09分離株分離自現(xiàn)地死亡率較高ILTV感染雞群，因此為了解該分離株的致病能力，本研究以人工感染SPF雞的方式通過(guò)各項(xiàng)指標(biāo)評(píng)價(jià)其致病性。通過(guò)對(duì)ILTV LJS09分離株致病性的研究，為其他ILTV流行株致病能力的研究提供了參考。

1 材料和方法

1.1 病毒株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ILTV LJS09分離株由本實(shí)驗(yàn)室分離自江蘇省某未經(jīng)免疫的雞場(chǎng)；4周齡40只SPF雞由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑 ExTaqDNA聚合酶、pM18-T載體和SYBR Green qPCR Kit購(gòu)自TaKaRa公司；DNA GelExtractionKit購(gòu)自O(shè)MEGA公司；PlasmidMiniprep Kit及DNA AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit購(gòu)自AxyGen公司；ILTV抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自百測(cè)公司。

1.3 EID50的測(cè)定 將ILTV LJS09株進(jìn)行10倍倍比稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋度經(jīng)尿囊膜途徑接種5枚9日齡SPF雞胚，37℃孵育4 d后，觀察尿囊膜水腫和雞胚變化，并PCR檢測(cè)病毒，采用Reed-Muench的方法測(cè)定病毒的EID50，測(cè)定的病毒效價(jià)為10-3.7EID50。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及人工感染 將40只4周齡SPF雞隨機(jī)分為感染組和對(duì)照組，每組20只。感染組以102EID50/只接種ILTV LJS09株，接種途徑為滴鼻點(diǎn)眼；對(duì)照組以滴鼻點(diǎn)眼途徑每只接種相同劑量的正常雞胚尿囊液。于人工感染后第5 d隨機(jī)迫殺10只，每只采集18個(gè)組織樣品(喉頭、氣管、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺、胰腺、腺胃、十二指腸、小腸、大腸、盲腸、盲腸扁桃體、法氏囊、腦、哈德氏腺和骨髓)，并觀察剖檢變化。剩余10只雞，于人工感染后每天觀察癥狀，連續(xù)觀察20 d，并給予臨床評(píng)分(評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：正常=0分，輕度=1分，重度=2分，死亡=3分)。計(jì)算臨床指數(shù)(總得分/總雞數(shù))、發(fā)病率(發(fā)病雞數(shù)/總雞數(shù))、死亡率(死亡雞數(shù)/總雞數(shù))。

1.5 嗜性器官病理組織學(xué)觀察 根據(jù)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果，選取病毒載量較高的組織，包括喉頭、氣管、腦、肺臟、盲腸、腺胃、大腸和腎臟組織樣品，病理組織學(xué)檢查由本所診斷中心病理組檢測(cè)，按常規(guī)進(jìn)行組織切片制作與觀察。

1.6 血清抗體水平檢測(cè) 分別于病毒接種后第4 d、8 d、12 d、16 d和20 d采集接種組和對(duì)照組雞血清樣品，按照ILTV抗體檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)血清抗體水平，在405 nm～410 nm波長(zhǎng)讀值，并計(jì)算S/P值，按試劑盒標(biāo)準(zhǔn)，S/P值>0.5判為陽(yáng)性，S/P值≤0.5判為陰性。

1.7 熒光定量P C R檢測(cè)病毒組織分布 熒光定量PCR參考文獻(xiàn)[6]所設(shè)計(jì)的引物和探針，引物序列為：5'-CCTTGCGTTTGAATTTTTCTGT-3'/5'-TTCGT GGGTTAGAGGTCTGT-3'；特異探針為：5'-FAM-CA GCTCGGTGACCCCATTCTA-BHQ-1-3'。 利 用 DNA提取試劑盒提取ILTV雞胚尿囊液的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增103 bp的DNA片段，回收擴(kuò)增片段，克隆于pMD18-T載體中作為重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品純度為1.86，濃度為54.1 ng/μL，換算結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)品為4.79×1011拷貝/μL。在100 mg采集的組織樣品中加入1 mL DEPC水，研磨成勻漿后按DNA提取試劑盒提取其總DNA作為模板，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)各組織中的病毒載量。熒光定量PCR方法經(jīng)優(yōu)化確定20 μL反應(yīng)體系為：2×premix ExTaq10.0 μL，模板 DNA 2 μL，上下游引物各0.4 μL(10 pmol/μL)， 探 針 0.4 μL(10 pmol/μL)，ddH2O 6.8 μL，反應(yīng)條件為：預(yù)變性 95℃ 30 s；PCR反應(yīng)95℃ 5 s，退火60℃ 20 s，40循環(huán)。退火延伸時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)。以最佳反應(yīng)模式進(jìn)行熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線建立，標(biāo)準(zhǔn)品濃度從108拷貝/μL～101拷貝 /μL具有良好的線性關(guān)系(擴(kuò)增效率E=1.902，直線斜率為-3.583，截距為46.36。即標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=-3.583X+46.36)。利用上述體系檢測(cè)感染組雞各組織器官中的病毒載量。

2 結(jié) 果

2.1 臨床癥狀、臨床得分、臨床指數(shù)、發(fā)病率和死亡率 人工感染組雞于4 dpi～6 dpi，出現(xiàn)呼吸困難癥狀，表現(xiàn)為張口呼吸、伸頸、甩頭；結(jié)膜炎癥狀表現(xiàn)為流淚、眼瞼發(fā)紅及腫脹等。根據(jù)臨床評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)發(fā)病雞進(jìn)行打分并繪制臨床得分曲線(圖1)。其中，急性癥狀主要出現(xiàn)在4 dpi～6 dpi，隨后癥狀表現(xiàn)溫和，僅表現(xiàn)為輕度的呼吸困難，結(jié)膜炎癥狀于7 dpi逐漸消失。按此評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算臨床指數(shù)為1.4(總得分/總雞數(shù))。此外，感染雞的發(fā)病率和死亡率分別為80%和10%(表1)，對(duì)照組雞未出現(xiàn)任何臨床癥狀。

圖1 人工感染組感染后1 d～20 d平均臨床得分分布圖Fig.1 The average clinical score of artificially infected chickens from 1 to 20 dpi

表1 感染組臨床指數(shù)、發(fā)病率和死亡率Table 1 The clinical index,morbidity and mortality of the chicken in the infected group

2.2 剖檢變化 于5 dpi，隨機(jī)迫殺10只雞。病雞剖檢顯示喉頭和氣管粘膜充血、出血，喉部粘膜腫脹，有多量的粘液，粘液中混有血絲，肺部有實(shí)質(zhì)性病變。對(duì)照組雞未見(jiàn)任何剖檢變化。

2.3 病理組織學(xué)觀察 將人工感染雞喉頭、氣管、腦、肺臟、盲腸、腺胃、大腸和腎臟組織切片HE染色后進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。結(jié)果顯示：這些器官均表現(xiàn)出明顯的炎性變化，各臟器固有層中有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。并且，喉頭和氣管局部粘膜上皮細(xì)胞脫落；大腦皮質(zhì)內(nèi)廣泛性的神經(jīng)細(xì)胞萎縮、變性和脫落；肺廣泛性淤血；腺胃粘膜層粘液分泌增多，部分粘膜乳頭壞死溶解；大腸和盲腸腸絨毛上皮顯著脫落(圖2)。

2.4 感染組血清抗體檢測(cè)結(jié)果 采用ILTV ELISA抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)感染組第4 dpi、8 dpi、12 dpi、16 dpi和20 dpi血清抗體水平，結(jié)果顯示，在8 dpi血清抗體水平開(kāi)始陽(yáng)轉(zhuǎn)(30%)，20 dpi血清抗體全部轉(zhuǎn)陽(yáng)(100%)，對(duì)照組雞只血清抗體水平為陰性(圖3)。

圖2 喉頭、氣管、腦、肺臟、盲腸、腺胃、大腸和腎臟組織病理形態(tài)學(xué)觀察Fig.2 Histopathologic examination of the chicken throat,trachea,brain,lungs,cecum,proventriculus,large intestinal and kindey

圖3 人工感染后血清抗體水平檢測(cè)結(jié)果Fig.3 The serum antibody levels of artificial infected chickens

2.5 感染組雞體內(nèi)I L T V組織分布與嗜性 熒光定量PCR檢測(cè)ILTV在感染組雞體內(nèi)各組織中的分布情況，結(jié)果表明ILTV在感染雞各組織中均有分布，但各組織中的病毒載量不同。ILTV的主要嗜性器官為呼吸器官喉頭，氣管和肺臟；免疫器官哈德氏腺，骨髓和盲腸扁桃體；腦；消化器官盲腸、腺胃和大腸。而在某些組織如肝臟、脾臟、胸腺等組織中病毒載量較低(圖4)。

圖4 ILTV在感染組雞體內(nèi)各組織中分布情況Fig.4 Distribution of ILTV in the internal organs of infected chickens

3 討 論

本研究將ILTV LJS09分離株人工感染SPF雞，感染雞表現(xiàn)出呼吸困難的典型臨床癥狀；剖檢時(shí)喉頭和氣管充血、出血，分泌大量粘液并混有血絲；病理組織學(xué)檢測(cè)表明ILTV嗜性器官內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)各嗜性器官也表現(xiàn)出特異的組織病理變化；臨床指數(shù)、發(fā)病率和死亡率較高。這些指標(biāo)均與Zhao等報(bào)道相符[7]，表明了ILTV LJS09對(duì)SPF雞具有較強(qiáng)的致病性。感染雞血清抗體水平于8 dpi開(kāi)始轉(zhuǎn)陽(yáng)，20 dpi全部陽(yáng)轉(zhuǎn)。這一結(jié)果也符合Hitchner等的報(bào)道[6]。熒光定量PCR的結(jié)果表明ILTV LJS09在感染雞體內(nèi)絕大多數(shù)器官中均存在，但其嗜性器官主要是喉頭、氣管、哈德氏腺、腦、盲腸和腺胃，而在法氏囊、脾臟和胸腺中的病毒含量很少，但據(jù)Wang等的報(bào)道，ILTV GD2011在胸腺中的病毒拷貝數(shù)高[8]，而在腺胃和腦中病毒含量較少，并且根據(jù)Wei等的研究，ILTV JL0806在腎臟中病毒拷貝數(shù)較高[9]，這可能是由于不同地域不同流行病毒株的差異造成嗜性器官的差異。

本研究以人工感染的方式，通過(guò)各個(gè)指標(biāo)的評(píng)價(jià)表明，ILTV LJS09分離株具有較強(qiáng)的致病性。這些指標(biāo)為ILTV其他流行病毒株致病性的研究提供了參考和依據(jù)。

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