動(dòng)物源腸外致病性大腸桿菌毒力因子研究進(jìn)展

郭 霞，孔令聰，劉樹(shù)明，馬紅霞,2*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130118)

動(dòng)物源腸外致病性大腸桿菌(Extraintestinal pathogenic Escherichia coli，ExPEC)是一種能夠引起動(dòng)物腸道外嚴(yán)重感染的病原體，包括新生兒腦膜炎致病性E.coli(Neonatal meningitis E.coli，NMEC)，尿道致病性E.coli(Uropathogenic E.coli，UPEC)，敗血癥E.coli(如禽致病性E.coli，Avian pathogenic E.coli，APEC)，乳腺炎致病性E.coli(Mammary pathogenic E.coli，MPEC)，子宮內(nèi)膜致病性E.coli(Endometrial pathogenic E.coli，EnPEC)，肺炎致病性E.coli(Pneumonia pathogenic E.coli，PPEC)等腸外致病性E.coli，其引發(fā)的疾病已給畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。動(dòng)物源ExPEC 具有人畜共患的特性，也給人類(lèi)的健康造成了潛在的威脅[1]。

動(dòng)物源ExPEC 通過(guò)相關(guān)毒力因子定植于宿主粘膜表面，逃避或破壞宿主局部和全身的免疫系統(tǒng)，從而導(dǎo)致宿主發(fā)病。研究認(rèn)為動(dòng)物源ExPEC 的毒力因子主要包括粘附因子、免疫逃避相關(guān)毒力因子和代謝相關(guān)毒力因子。本文就其主要毒力因子及其調(diào)控子的研究進(jìn)展做以綜述。

1 粘附因子

粘附是微生物在宿主表面成功定植的第一步，ExPEC在宿主定植過(guò)程中產(chǎn)生多種粘附素，包括菌毛粘附素和非菌毛粘附素。菌毛粘附素包括Ⅰ型菌毛粘附素、P 菌毛粘附素和卷曲菌毛粘附素；非菌毛粘附素包括非菌毛粘附物質(zhì)、溫度敏感凝集素、自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白粘附素和其他粘附素。目前，已知?jiǎng)游镌碋xPEC 的粘附素有7 種，其編碼基因、特異性粘附受體和體內(nèi)外感染模型如表1 所示：

1.1 Ⅰ型菌毛粘附素 1984 年Naveh 等首次報(bào)道了Ⅰ型菌毛在APEC 感染中的致病作用，并通過(guò)體內(nèi)和體外粘附實(shí)驗(yàn)證明其能夠粘附于雞氣管上皮細(xì)胞[2]。之后，Krogfelt等研究證明了Ⅰ型菌毛的粘附作用均由亞基fim H 介導(dǎo)，并且證明Ⅰ型菌毛粘附素為甘露糖受體特異性粘附素[3]。Krekeler 等進(jìn)一步構(gòu)建犬子宮內(nèi)膜致病E.coliⅠ型菌毛粘附素fim H 亞基突變株，并通過(guò)子宮活檢對(duì)比判定突變株與野生株結(jié)合犬子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的能力，定量與定性地表明了犬子宮內(nèi)膜E.coliⅠ型菌毛fim H 亞基在粘附犬子宮內(nèi)膜過(guò)程中起重要作用[4]。隨后他們還構(gòu)建了引起犬子宮蓄膿E.coli 的fim H、papG III 和sfa 單個(gè)、兩個(gè)和3 個(gè)粘附素基因缺失株，結(jié)果顯示，單個(gè)或者兩個(gè)粘附素缺失株與野生株粘附子宮內(nèi)膜的能力無(wú)顯著差異，而3 個(gè)粘附素缺失株的粘附能力卻顯著下降，表明Ⅰ型菌毛粘附素與其他菌毛粘附素之間具有相互補(bǔ)償?shù)哪芰5]。

表1 動(dòng)物源ExPEC 粘附素編碼基因、特異性受體及相關(guān)感染模型

1.2 P菌毛粘附素 P 菌毛最初發(fā)現(xiàn)于人UPEC 中，其尖端的粘附分子papG 可介導(dǎo)其對(duì)尿道上皮細(xì)胞的粘附。根據(jù)受體差異可將papG 分為papGⅠ、pap GⅡ和pap GⅢ。pap GⅡ在所有的等位基因中分布廣泛，并且papGⅡ和papGⅢ也與哺乳動(dòng)物源(包括人)的papGⅡ和papGⅢ(相應(yīng)的)papG 序列具有高度同源性[6]。Lillington 等發(fā)現(xiàn)在菌毛裝配過(guò)程中，p 菌毛大亞基pap A 亞基較Ⅰ型菌毛大亞基fim A 亞基與引座子的親和性較小，而且papG 粘附素和fim H 粘附素相比雖然與宿主是較弱的滑動(dòng)結(jié)合方式，卻更適合于在更多日常沖刷下的腎臟組織生存，從而加強(qiáng)了細(xì)菌在體內(nèi)的生存能力[7]。筆者所在實(shí)驗(yàn)室對(duì)從豬肺炎E.coli 進(jìn)行基因組測(cè)序結(jié)果表明其攜帶有pap GⅡ，并且與人腦炎E.coli 該基因的同源性高達(dá)99 %，但其在粘附過(guò)程中是否發(fā)揮作用還有待于進(jìn)一步研究。

1.3 卷曲菌毛粘附素 卷曲菌毛是E.coli 在體外處于特定條件下表達(dá)的淀粉樣纖維，最早發(fā)現(xiàn)于牛MPEC[8]。其可以結(jié)合纖連蛋白，引發(fā)細(xì)菌自動(dòng)聚集和生物膜形成，還可增強(qiáng)細(xì)菌粘附、侵襲和定植，并可能與細(xì)菌引發(fā)的敗血癥相關(guān)[9]。Ragione 等發(fā)現(xiàn)卷曲菌毛能增強(qiáng)APEC 的粘附和定植能力，如果卷曲菌毛的表達(dá)受到抑制則APEC 存活能力也隨之下降[10]。其還可以與纖連蛋白結(jié)合并粘附到宿主細(xì)胞表面，介導(dǎo)APEC 對(duì)真核細(xì)胞侵入以及其被真核細(xì)胞內(nèi)化[11]。同時(shí)，采用X 射線對(duì)促進(jìn)E.coli 卷曲菌毛分泌的關(guān)鍵亞基csgG 蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示，該蛋白是閉塞的、無(wú)選擇性的蛋白分泌通道[12]。此外，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)一株豬源ExPEC 全基因組進(jìn)行高通量測(cè)序，結(jié)果顯示，其攜帶有編碼卷曲菌毛粘附素的基因，但其是否與豬源ExPEC 在肺部定植感染相關(guān)有待證實(shí)。

2 免疫逃避相關(guān)毒力因子

2.1 莢 膜 莢膜是E.coli 引起腸道外感染的重要因素。當(dāng)敲除了與莢膜多糖輸出相關(guān)的kpsM 基因后，豬腦炎PCN033 突變株的粘附、抗吞噬作用和抗補(bǔ)體介導(dǎo)的血清殺菌能力均顯著下降[13]?，F(xiàn)已證實(shí)，新生兒腦膜炎E.coli的K1 莢膜在免疫逃避中起著至關(guān)重要的作用，K1 莢膜能夠增強(qiáng)新生兒腦膜炎E.coli 在人微血管內(nèi)皮的細(xì)胞內(nèi)存活能力，并能調(diào)節(jié)含液泡的新生兒腦膜炎E.coli 的成熟并且能阻止溶酶體的融合，因而可穿過(guò)血腦屏障而使宿主致病[14]。

2.2 血清抗性蛋白 APEC 的血清抗性蛋白能夠幫助該菌避免與血清中的補(bǔ)體結(jié)合，可介導(dǎo)APEC 的免疫逃避。APEC 的血清抗性主要依靠來(lái)自質(zhì)粒的traT(表面排斥分子)和iss(增加血清生存基因簇)，前者能夠在細(xì)胞表面暴露的情況下防止細(xì)胞裂解，增加APEC 的血清抗性，但其功能特異性位點(diǎn)未知[15]；而后者最初發(fā)現(xiàn)于人敗血癥E.coli 分離株中，能夠顯著增強(qiáng)人敗血癥E.coli 的補(bǔ)體結(jié)合抗性。APEC 的iss 和traT 缺失株均能導(dǎo)致其在血清的存活能力下降，但其在E.coli χ7122 卻不具有抗血清作用[16]。Johnson 等鑒定iss 基因有3 種亞型，其中1 型iss 在APEC 和NMEC 中流行廣泛，但在UPEC 中卻少見(jiàn)[17]。

2.3 外膜蛋白 外膜蛋白(Outermembraneprotein，OMPs)是外膜的主要組成成份，包括錨定脂蛋白和跨膜貝塔折疊蛋白，可以介導(dǎo)細(xì)菌定植、侵襲和免疫逃避。如腦膜炎E.coli OmpA 通過(guò)結(jié)合補(bǔ)體C4b，介導(dǎo)其血清抗性，并且其對(duì)數(shù)期菌體通過(guò)促進(jìn)補(bǔ)體C4b 介導(dǎo)的補(bǔ)體C3b 和C4b的降解避免血清殺傷作用[18]。Liu 等發(fā)現(xiàn)豬源ExPEC 腦炎株P(guān)CN033 OmpC 和OmpF 蛋白抗血清能介導(dǎo)補(bǔ)體依賴(lài)的調(diào)理吞噬作用[19]。此外，通過(guò)構(gòu)建ExPEC O42 株外膜蛋白TolC 基因缺失株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與親本株相比其被膜形成能力顯著下降，而且喪失了產(chǎn)生卷曲菌毛的能力[20]。

3 代謝相關(guān)毒力因子

動(dòng)物宿主組織中可用的可溶性鐵離子很有限。ExPEC能夠在低鐵壓力下使宿主致病，主要是通過(guò)以下3 種策略：(1)位于內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)SitABCD 作為ATP 離子泵將宿主周質(zhì)中的二價(jià)鐵離子運(yùn)輸至細(xì)胞內(nèi)。(2)通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)-ChuA 和Hma 從宿主和細(xì)胞外的血紅素?cái)z取鐵。(3)通過(guò)鐵載體外膜受體蛋白-IroN、IreA、IutA 等從宿主的乳鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白中得到鐵。已知ExPEC 可以合成4 種不同的鐵載體：即氣桿菌素、沙門(mén)菌素、葉爾森桿菌素和腸桿菌素，鐵載體與ExPEC 的侵襲、內(nèi)化和系統(tǒng)感染如敗血癥有關(guān)。潘海珠通過(guò)分別構(gòu)建氣桿菌素合成基因iucC 和其外膜蛋白受體iutA 的基因缺失株，證實(shí)iucC 基因在APEC E058 株氣桿菌素合成中發(fā)揮重要作用，而iutA 的缺失不影響氣桿菌素的合成，但缺失株的雞胚死亡率低于野生株[21]。沙門(mén)菌素受體IroN 在UTI CP9 與侵襲尿路上皮細(xì)胞有關(guān)[22]。葉爾森桿菌素能夠在宿主體內(nèi)攝取鐵，并能夠在人尿道促進(jìn)生物膜的形成[23]。由于鐵載體外膜蛋白是ExPEC 保持完整毒力必須的鐵載體的外膜蛋白，因此ExPEC 外膜蛋白受體有望成為治療ExPEC 感染的新靶點(diǎn)。

4 毒力因子調(diào)控系統(tǒng)

ExPEC 與腸內(nèi)E.coli 侵染部位和生存環(huán)境有所不同，其如何根據(jù)不同的外界信號(hào)刺激表達(dá)不同的毒力因子，促進(jìn)其在不同的組織內(nèi)生存已成為目前研究熱點(diǎn)之一。毒力因子調(diào)控系統(tǒng)包括二元信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)(TCSTS)、群體感應(yīng)系統(tǒng)(Quorum sensing，QS)和毒素-抗毒素系統(tǒng)(Toxin-antitoxin，TA)等。

4.1 TCSTS 該系統(tǒng)是細(xì)菌內(nèi)的主要信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，能夠使病原體對(duì)環(huán)境誘因進(jìn)行感知并調(diào)節(jié)病原菌的代謝，使其適應(yīng)環(huán)境的改變，從而侵襲宿主。經(jīng)典的TCSTS 由兩個(gè)相互作用的蛋白組成(例如BarA/UvrY 和EnvZ/OmpR等)，可以通過(guò)磷酸化過(guò)程調(diào)控靶基因的表達(dá)。Herren 等通過(guò)體內(nèi)和體外試驗(yàn)證明，BarA/UvrY 可能是APEC 的全局調(diào)控子，影響了多種毒力因子的表達(dá)，BarA/UvrY 的缺失導(dǎo)致APEC 的Ⅰ型菌毛和P 菌毛的表達(dá)量下調(diào)，減弱胞外多糖的產(chǎn)生，增加對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性[24]。但Palaniyandi 等發(fā)現(xiàn)BarA-UvrY 缺失的UPEC 突變株的溶血素、脂多糖、炎性細(xì)胞因子(TNF-α 和IL-6)和趨化因子(IL-8)的表達(dá)量顯著下降[25]。BarA/UvrY 在不同源的ExPEC 中調(diào)控的靶基因有所不同，筆者認(rèn)為這可能與感染部位的環(huán)境差異有關(guān)。此外，Rentschler 等發(fā)現(xiàn)UPEC 的EnvZ/OmpR 中ompR 調(diào)控子能感受低pH/高滲透壓，特別是在高滲透壓下能降低fimB 的轉(zhuǎn)錄水平，導(dǎo)致Ⅰ型菌毛的表達(dá)減少，降低了以Ⅰ型菌毛為靶位的吞噬細(xì)胞吞噬的可能性，從而更適應(yīng)宿主環(huán)境[26]。但動(dòng)物源ExPEC 的二元調(diào)控子的靶基因及調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4.2 QS系統(tǒng) 該系統(tǒng)是細(xì)菌間細(xì)胞-細(xì)胞交流的通訊系統(tǒng)，能夠合成、釋放和探測(cè)細(xì)胞外信號(hào)分子-自體誘導(dǎo)物，使細(xì)菌在密度依賴(lài)的模式中調(diào)控基因的表達(dá)。QS 在一些物理狀態(tài)下，與生物體發(fā)光、被膜形成、毒力、抗生素生成以及與其他細(xì)菌的競(jìng)爭(zhēng)生存等相關(guān)。Han 等研究發(fā)現(xiàn)，QS 的調(diào)控子LuxS 缺失的APEC 的粘附、侵襲和致病性明顯降低，其IucD、FyuA、Vat、OmpA、Iss、FimC 和Tsh 的表達(dá)水平也降低[27]。隨后，Palaniyandi 等通過(guò)同樣的方法構(gòu)建了APEC LuxS 缺失株，也發(fā)現(xiàn)其致病性顯著降低，大多數(shù)缺失株O-抗原消失并且脂多糖含量下降了至少2 倍，其逃避雞巨噬細(xì)胞的吞噬能力和侵襲雞成纖維細(xì)胞的能力也顯著下降[28]。Chaudhari 等利用不同濃度的群體感應(yīng)QseC 重組蛋白刺激禽巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞，并將其與APEC O78 共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)刺激后生長(zhǎng)速度變慢，生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)間延長(zhǎng)，AufA、FliC、FimH、FyuA、IucC、IutA、MsbB 和Vat 的表達(dá)水平顯著下調(diào)；同時(shí)QseC 刺激禽巨噬細(xì)胞能夠有效誘導(dǎo)IFN-γ、TLR-4 和TLR-15 的表達(dá)，這些蛋白具有免疫原性，并誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫反應(yīng)，這提示QseC 有望成為抗APEC 感染的潛在疫苗靶位[29]。

4.3 AT系統(tǒng) 該系統(tǒng)是由一個(gè)穩(wěn)定的毒素蛋白和與其共表達(dá)并且受其抑制的不穩(wěn)定抗毒素蛋白組成，如YefMYoeB、YbaJ-Hha、PasT-PasI 等，其中抗毒素蛋白是小的反義RNAs，能夠抑制毒素基因的翻譯，TA 系統(tǒng)能夠幫助細(xì)菌更好的應(yīng)對(duì)應(yīng)激環(huán)境和生存壓力。Norton 等在已經(jīng)測(cè)序的UPEC 中發(fā)現(xiàn)了3 對(duì)TA 調(diào)控子：YefM-YoeB、YbaJ-Hha、PasT-PasI，其中前兩對(duì)調(diào)控子可以促進(jìn)UPEC在膀胱中定植，第3 對(duì)能夠增強(qiáng)ExPEC 在抗生素壓力的情況下其被膜的形成，在營(yíng)養(yǎng)限制、氧壓力和硝酸化壓力的狀況下顯著增強(qiáng)病原體的耐受能力，并且證明了與pstT毒性相關(guān)的N 端區(qū)域能夠促進(jìn)細(xì)菌的持留[30]。但動(dòng)物源ExPEC TA 系統(tǒng)的其他調(diào)控子還未見(jiàn)報(bào)道。

此外，隨著對(duì)ExPEC 毒力調(diào)控系統(tǒng)研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌轉(zhuǎn)化控制系統(tǒng)和新型分泌系統(tǒng)-VI 型分泌系統(tǒng)(Type VI secretion system，T6SS)在對(duì)其毒力因子調(diào)控中發(fā)揮一定作用。Mu 等發(fā)現(xiàn)干擾APEC 轉(zhuǎn)運(yùn)RNA-小蛋白B或轉(zhuǎn)運(yùn)RNA-小RNA 能夠顯著降低其毒力，并且轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因rfaH 和莢膜輸出蛋白kpsM、鐵載體受體chuA 和血清抗性蛋白iss 的基因表達(dá)水平均顯著降低[31]。此外，T6SS 核心基因(clpV 和hcp)的缺失能夠?qū)е翧PEC SEPT362 的Ⅰ型菌毛表達(dá)量下降，粘附上皮細(xì)胞能力下降，并促進(jìn)肌動(dòng)蛋白重排[32]。趙麗麗等發(fā)現(xiàn)豬腦炎株P(guān)CN033 的T6SS 系統(tǒng)中vca-0107 的缺失可引起粘附能力的顯著下降，而毒力卻無(wú)明顯變化[33]。但T6SS 基因簇編碼的其他蛋白質(zhì)的功能研究還未見(jiàn)報(bào)道。

5 小結(jié)與展望

綜上所述，有關(guān)動(dòng)物源ExPEC 的毒力因子及調(diào)控系統(tǒng)的研究已經(jīng)較為深入，其毒力因子調(diào)控系統(tǒng)中相關(guān)毒力因子的分泌、表達(dá)機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。近年來(lái)已發(fā)現(xiàn)TCSTS、QS、TA 和T6SS 毒力因子調(diào)控系統(tǒng)與ExPEC 關(guān)鍵致病過(guò)程密切相關(guān)，為此進(jìn)一步闡明其與ExPEC 致病相關(guān)的調(diào)控機(jī)制，不但能夠?yàn)樵摬〉姆乐翁峁┮罁?jù)，而且能夠?yàn)樾滦涂股匕形坏暮Y選提供新的視角。

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