體內(nèi)藥物分析的HPLC柱切換平臺(tái)搭建與研究進(jìn)展

盛陽(yáng)昊，王 萍，劉丹琦，顏曉敏，周伯庭#（1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院藥學(xué)部，長(zhǎng)沙 410008；2.中南大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)沙 410013；3.株洲市愷德醫(yī)院藥學(xué)部，湖南株洲 412000）

20世紀(jì)70年代，Huber JFK等[1]開發(fā)了柱切換（Columnswitching）技術(shù)。首先在一級(jí)色譜柱完成被測(cè)組分與復(fù)雜基質(zhì)的初分離，并通過閥切換來改變流動(dòng)相的流向和組成，使目標(biāo)組分從一級(jí)柱流向二級(jí)柱，并在二級(jí)柱上進(jìn)行被測(cè)組分的測(cè)定，從而完成復(fù)雜樣品的分析。隨著近幾十年的發(fā)展，柱切換技術(shù)在21世紀(jì)初已基本完善，被廣泛應(yīng)用于分析化學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，如環(huán)境分析、食品檢驗(yàn)、體內(nèi)藥物分析、制劑分析等。其中，在臨床藥物分析和藥動(dòng)學(xué)中的應(yīng)用最為廣泛，因?yàn)橥ㄟ^柱切換技術(shù)可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜生物基質(zhì)經(jīng)簡(jiǎn)單處理即可進(jìn)樣或直接進(jìn)樣，自動(dòng)化操作減少了前處理過程中出錯(cuò)的可能，提高了整個(gè)分析過程的準(zhǔn)確性，縮短了時(shí)間，使復(fù)雜生物基質(zhì)中小分子藥物分析變得簡(jiǎn)便快捷。雖然柱切換技術(shù)已基本成熟，但是還沒有相應(yīng)的商品上市，這需要依靠實(shí)驗(yàn)室的搭建，因此柱切換技術(shù)在我國(guó)醫(yī)院藥學(xué)部門的應(yīng)用并不普及，國(guó)內(nèi)關(guān)于日常治療藥物檢測(cè)和藥動(dòng)學(xué)的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道也不多。柱切換高效液相色譜（HPLC）平臺(tái)搭建的關(guān)鍵是如何構(gòu)建切換閥與色譜柱構(gòu)成的色譜網(wǎng)絡(luò)，并根據(jù)醫(yī)院的具體情況選用合適的傳輸技術(shù)。為此，筆者以“Column switching”“柱切換”等為關(guān)鍵詞，檢索Elsevier、Springer、中國(guó)知網(wǎng)等數(shù)據(jù)庫(kù)，通過文獻(xiàn)分析臨床藥物柱切換平臺(tái)搭建的現(xiàn)狀與研究進(jìn)展，同時(shí)總結(jié)應(yīng)用不同的傳輸技術(shù)和色譜柱來構(gòu)建色譜網(wǎng)絡(luò)的方法，為醫(yī)院藥學(xué)部門搭建HPLC柱切換平臺(tái)、簡(jiǎn)化復(fù)雜樣品的處理過程提供參考。

1 HPLC柱切換平臺(tái)的儀器組成和搭建

HPLC柱切換平臺(tái)主要由進(jìn)樣閥、切換閥、高壓泵、色譜柱、檢測(cè)器和控制、處理系統(tǒng)構(gòu)成，可由普通HPLC加上若干切換閥和色譜柱等部件構(gòu)成。下面具體分析色譜網(wǎng)絡(luò)的搭建過程。

1.1 一級(jí)色譜柱的選擇

復(fù)雜生物基質(zhì)如血漿、血清等，其富含蛋白質(zhì)，且被測(cè)藥物濃度往往較低，經(jīng)過蛋白沉淀、液液萃取、離線的固相萃取后，一般需要揮干濃縮、復(fù)溶等一系列樣品前處理步驟。這些步驟不但耗時(shí)，而且存在操作復(fù)雜、精確性差等缺點(diǎn)。而柱切換平臺(tái)的第一級(jí)柱將直接實(shí)現(xiàn)生物基質(zhì)中的大分子與待測(cè)組分的分離，富集和凈化待測(cè)組分。一級(jí)色譜柱的選擇主要根據(jù)去蛋白的形式和藥物性質(zhì)來決定。

1.1.1 離線去蛋白 離線去蛋白一般采用強(qiáng)酸或有機(jī)溶劑，將渦旋離心后的上清液直接大體積進(jìn)樣。一級(jí)柱一般選用小粒徑（5、10 μm）反相ODS或C8填料，可防止大體積進(jìn)樣的峰展寬，柱子長(zhǎng)短皆可；且由于去蛋白后的樣品較干凈，可有效延長(zhǎng)一級(jí)柱的壽命。

1.1.2 在線去蛋白 使用在線去蛋白，一般選用兩種類型的柱子。第一類是粒徑較大（20～50 μm）鍵合鏈烴的柱子（也叫貫流色譜柱，Turbulent flow chromatography column），比如C18、C8、C2，也可鍵合其他類型的基團(tuán)，如氰基[2]、氨基[3]。通過以水為主的一級(jí)流動(dòng)相的洗脫，大分子蛋白質(zhì)和一些親水物質(zhì)被洗脫，被測(cè)組分被吸附而留在柱子中。此類柱子的優(yōu)點(diǎn)是粒徑大，可使用高流速分析，縮短分析時(shí)間。但需注意的是，柱壓會(huì)隨著進(jìn)樣次數(shù)的增多而顯著升高，粒徑越小越明顯，這時(shí)一級(jí)柱的再生清洗和流動(dòng)相的選擇就非常重要。郭平等[4]用0.2 mol/L的乙酸作為清洗液，采用25～40 μm的大粒徑一級(jí)柱，進(jìn)樣次數(shù)可達(dá)到800次以上，這可能與乙酸具有溶解蛋白并阻止在一級(jí)柱上沉積的作用有關(guān)。劉皋林等[5]發(fā)現(xiàn)，先用含有不同比例的水的甲醇溶液沖洗分析柱，后用純甲醇沖洗，可避免柱內(nèi)的磷酸鹽析出或使柱內(nèi)殘余的血漿蛋白凝固粘聚于柱內(nèi)，由此延長(zhǎng)柱的使用壽命。

第二類是20世紀(jì)80年代末發(fā)展起來的RAM（Restricted access media）柱，又稱為通道限制性填料柱。其分離的機(jī)制為分子排阻兼反相分離；當(dāng)生物樣品通過限制性填料時(shí)，親水層對(duì)蛋白質(zhì)無吸附作用，蛋白質(zhì)被先洗脫；而疏水層對(duì)藥物等小分子物質(zhì)有保留作用，再通過選擇適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)相，將小分子物質(zhì)洗脫下來，從而實(shí)現(xiàn)組分的分離。RAM填料有不同的種類，在臨床藥物分析中應(yīng)用較多的是內(nèi)表面反相填料、烷基二醇硅膠和混合功能填料。張曉惠等[6]用內(nèi)表面反相填料考察對(duì)鹽酸貝那普利的在線富集性能，發(fā)現(xiàn)RAM柱對(duì)鹽酸貝那普利具有良好的富集作用，能夠有效提高HPLC的靈敏度。Yu Z等[7]、樊鵬程等[8]均用Lichrospher ADS作為一級(jí)柱，在分析過程中，柱切換系統(tǒng)預(yù)柱及分析柱柱壓始終未發(fā)生較大增加，系統(tǒng)穩(wěn)定性良好。郭志強(qiáng)等[9]通過自制裝填的混合功能RAM柱作為一級(jí)柱，以柱切換系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)血漿樣品中替米沙坦的直接進(jìn)樣含量測(cè)定。Friedrich G等[10]用Biotrap柱實(shí)現(xiàn)了血漿和尿中雙氫麥角隱亭的含量測(cè)定，結(jié)果回收率達(dá)99%，且精密度良好，線性范圍為25～1 000 pg/ml。

1.2 傳輸技術(shù)及色譜網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在臨床治療藥物濃度監(jiān)測(cè)和藥動(dòng)學(xué)分析中，絕大部分藥物只有1～2種相應(yīng)的物質(zhì)需要檢測(cè)，可選擇中心切割技術(shù)（Heart-cut）和反沖傳遞技術(shù)（Back-flush）來實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確的分離。其中，中心切割技術(shù)包含直接傳輸和間接傳輸兩種形式，而反沖傳遞技術(shù)包含反向傳輸形式。由于醫(yī)院臨床送檢樣品通量大，應(yīng)用在線去蛋白時(shí)，可在基本傳輸技術(shù)的基礎(chǔ)上使用反沖清洗技術(shù)及時(shí)清洗一級(jí)柱，延長(zhǎng)其使用壽命。

1.2.1 直接/間接傳輸 直接傳輸（見圖1）較多用于離線去蛋白。當(dāng)六通閥處于OFF狀態(tài)（見圖1A）時(shí)，通過高壓泵將樣品泵入一級(jí)柱，用一級(jí)流動(dòng)相（預(yù)處理流動(dòng)）完成初次分離和富集樣品；同時(shí)，二級(jí)柱用二級(jí)流動(dòng)相（分析流動(dòng)相）完成最后分離。當(dāng)直接進(jìn)樣傳輸中切換閥處于ON狀態(tài)（見圖1B）時(shí)，通過一級(jí)流動(dòng)相將富集的或初分離的組分送至二級(jí)柱；在二級(jí)柱用二級(jí)流動(dòng)相分離的時(shí)候，一級(jí)柱可完成柱子的再平衡并再次進(jìn)樣。

圖1 直接傳輸

間接傳輸在線去蛋白（見圖2B）和離線蛋白（見圖2A）都可應(yīng)用。間接傳輸流路變換和具體過程與直接傳遞基本一致；與直接傳遞不同的是，從一級(jí)柱到二級(jí)柱，用的是不同流動(dòng)相來洗脫被測(cè)物。

1.2.2 反向傳輸形式 反相傳輸見圖3。當(dāng)六通閥處于OFF狀態(tài)（見圖3A）時(shí)，通過高壓泵將樣品泵入一級(jí)柱，一級(jí)流動(dòng)相（預(yù)處理流動(dòng)）將內(nèi)源性基質(zhì)洗脫，待測(cè)組分保留在柱端；同時(shí)，二級(jí)柱用二級(jí)流動(dòng)相（分析流動(dòng)相）完成最后分離。當(dāng)切換閥處于ON狀態(tài)（見圖3B）時(shí)，通過二級(jí)流動(dòng)相將富集在柱端的組分送至二級(jí)柱，同直接/間接傳輸不同的是，兩次流動(dòng)相經(jīng)過一級(jí)柱中的流向相反。此種反向傳輸，組分保留在一級(jí)柱端，可有效減少峰展寬。

圖2 間接傳輸

圖3 反向傳輸

1.2.3 反沖清洗技術(shù) 反沖清洗見圖4。當(dāng)六通閥處于OFF狀態(tài)（見圖4A）時(shí)，樣品通過色譜柱進(jìn)入后面的檢測(cè)器或色譜柱。當(dāng)六通閥處于ON狀態(tài)（見圖4B）時(shí)，清洗流動(dòng)相反沖柱子，起到凈化柱子的作用，在復(fù)雜生物基質(zhì)直接進(jìn)樣清洗一級(jí)柱中應(yīng)用較多。Huber JF等[11]在反向傳輸形式的基本骨架上構(gòu)建了應(yīng)用反沖清洗技術(shù)的色譜網(wǎng)絡(luò)，并用梯度洗脫來沖洗一級(jí)分析預(yù)柱，延長(zhǎng)了5 μm小粒徑一級(jí)柱的使用壽命。

圖4 反沖清洗

1.3 檢測(cè)器的選擇

從成本和醫(yī)院開展的日常治療藥物血藥濃度監(jiān)測(cè)項(xiàng)目來考慮，紫外檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器可滿足大部分藥物的線性范圍檢測(cè)要求，并可保持長(zhǎng)期穩(wěn)定，但對(duì)藥動(dòng)學(xué)中一些濃度很低的代謝物分析卻無能為力。質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度高、分析速度快、選擇性高，而且經(jīng)過柱切換分離的組分，成分純度相對(duì)較高、基質(zhì)效應(yīng)較小，但缺點(diǎn)是檢測(cè)器購(gòu)置費(fèi)和日常維護(hù)費(fèi)較高。

1.4 色譜網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析與討論

醫(yī)院藥學(xué)部門的藥物分析柱切換平臺(tái)搭建與一般科研院所實(shí)驗(yàn)室有所不同，必須根據(jù)醫(yī)院藥學(xué)部門的實(shí)際情況，重點(diǎn)考察耐久度、經(jīng)濟(jì)性、時(shí)間復(fù)雜度3個(gè)重要評(píng)估要素來構(gòu)建柱切換平臺(tái)。下面結(jié)合前文“1.1”“1.2”項(xiàng)中給出的兩種去蛋白形式和兩種傳遞技術(shù)來討論色譜網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建策略。

在線去蛋白因?yàn)橹苯印⒑?jiǎn)便、準(zhǔn)確，減少了人為干預(yù)程度，逐漸成為復(fù)雜生物基質(zhì)中小分子測(cè)定技術(shù)發(fā)展的趨勢(shì)；與其相適應(yīng)的一級(jí)柱為大粒徑反向柱（20～50 μm）和RAM柱。采用大粒徑反向柱，因粒徑較大，一般選擇反沖模式，被測(cè)物強(qiáng)保留在柱端，可有效控制峰展寬。但也有少數(shù)文獻(xiàn)采用中心切割模式[5，12]，但從文獻(xiàn)中的色譜圖可看出峰展寬控制明顯不佳，導(dǎo)致積分誤差增大、準(zhǔn)確性降低。RAM柱相對(duì)于大粒徑柱則無此問題[6，13]?？筛鶕?jù)被測(cè)物在一級(jí)柱上的保留情況，選擇具體的傳遞技術(shù)。

雖然在線去蛋白與反沖傳遞技術(shù)被大部分HPLC柱切換文獻(xiàn)所采用[14-15]，但此種組合的缺點(diǎn)是反沖使柱頭上的物質(zhì)沖入分析柱，造成二級(jí)柱壓力升高，降低柱耐用性；同時(shí)反沖模式去雜質(zhì)能力較中心切割模式差，容易將強(qiáng)保留物質(zhì)沖入分析柱，也會(huì)增加二級(jí)柱的分離難度以及增加二級(jí)柱的負(fù)載，減少柱使用壽命。此外，不管是RAM柱還是大粒徑一級(jí)柱，隨著直接進(jìn)樣次數(shù)增加，雜質(zhì)堵塞色譜柱，會(huì)導(dǎo)致壓力升高，色譜柱耐久性差，需經(jīng)常更換。所以，結(jié)合耐久度、經(jīng)濟(jì)性來評(píng)估，此種組合并不適合臨床大通量的日常檢測(cè)；如果臨床樣品量較少，則可優(yōu)先考慮此種組合。

離線去蛋白后進(jìn)樣，樣品相對(duì)干凈，一級(jí)柱為小粒徑反向柱（5、10 μm），峰展寬控制較好，搭配上中心切割模式，二級(jí)柱負(fù)載小，壽命大大延長(zhǎng)，可獲得極好的耐久性，經(jīng)濟(jì)性同時(shí)也得到提高，更適合于臨床大通量藥物分析。

時(shí)間復(fù)雜度（指單次分析時(shí)間，時(shí)間長(zhǎng)即復(fù)雜度高）也是進(jìn)行大通量臨床藥物分析時(shí)一個(gè)重要的考慮因素。大粒徑的反向柱粒徑大，可使用高流速來載樣萃取，使時(shí)間復(fù)雜度有效降低。如Ynddal L等[16]測(cè)定美沙芬及其代謝物時(shí)，使用大粒徑一級(jí)柱，流速可達(dá)5 ml/min，載樣及清洗只需0.5 min。在不同的傳輸形式中使用雙泵的另外一個(gè)意義是進(jìn)樣“雙工”，即在分析的同時(shí)使一級(jí)柱進(jìn)行清洗并完成下一次進(jìn)樣，這樣可減少時(shí)間復(fù)雜度，但這種“雙工”需要手動(dòng)實(shí)現(xiàn)，不適合醫(yī)院藥學(xué)部門的大通量日常檢測(cè)。要實(shí)現(xiàn)在自動(dòng)進(jìn)樣器的基礎(chǔ)上全自動(dòng)“雙工”，必須在基本色譜骨架上并聯(lián)修改。Ong VS等[17]比較了一根普通小粒徑反向一級(jí)柱與兩根大粒徑反向一級(jí)柱并聯(lián)組成的進(jìn)樣“雙工”系統(tǒng)的分析速度，發(fā)現(xiàn)后者速度比前者快1倍左右，一次分析僅為2 min，耗費(fèi)時(shí)間大幅縮短。Cass RT等[18]在反向傳輸形式的基本色譜骨架上，加上額外的一根二級(jí)柱和一個(gè)用于二級(jí)柱的平衡泵，實(shí)現(xiàn)了分析“雙工”：在一根二級(jí)柱分析的同時(shí)，另一根二級(jí)柱完成平衡，被測(cè)藥物的一次分析循環(huán)時(shí)間為3.3 min。如果醫(yī)院藥學(xué)部門每天檢測(cè)樣品較少，可采取單泵雙柱的直接傳輸來構(gòu)建色譜網(wǎng)絡(luò)，這種模式比上述的雙泵雙柱的直接傳輸減少了一個(gè)泵，減少了系統(tǒng)復(fù)雜度，提高了經(jīng)濟(jì)性，但同樣的會(huì)增加單次進(jìn)樣循環(huán)的時(shí)間。高申等[19]用單泵雙柱、直接傳輸形式來構(gòu)造色譜網(wǎng)絡(luò)測(cè)定苯妥英和卡馬西平，不需要專門控制設(shè)備，靈活、經(jīng)濟(jì)，相對(duì)于其他傳輸形式系統(tǒng)的復(fù)雜性較低，利于推廣應(yīng)用。

2 柱切換存在的問題

2.1 峰展寬

峰展寬在液相中由進(jìn)樣量、柱外效應(yīng)和被測(cè)物在柱子中展寬引起。在柱切換HPLC中，管路長(zhǎng)度比普通HPLC大大增加，柱外效應(yīng)也隨之提高。另外，在一級(jí)柱中，被測(cè)組分峰已經(jīng)發(fā)生展寬；再加上被測(cè)組分需從一級(jí)柱中洗脫到二級(jí)柱中，相當(dāng)于二級(jí)柱進(jìn)樣體積超載，從而引起了峰展寬問題，降低了靈敏度和分離度。Schill G等[20]提出了柱切換系統(tǒng)峰展寬體積公式：

其中，Ve為從一級(jí)柱到二級(jí)柱的有效注入體積，Vi為在一級(jí)柱上洗脫到二級(jí)柱上的被測(cè)組分體積，Ks為被測(cè)組分用一級(jí)流動(dòng)相在二級(jí)柱的保留因子，Vi又可寫成：

其中，x為被測(cè)組分在一級(jí)柱中的移行距離與柱子長(zhǎng)度的比值，V0為一級(jí)柱死體積，Kp為被測(cè)組分用二級(jí)流動(dòng)相在一級(jí)柱上的保留因子。將式（2）代入式（1），其中Ks遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于1，可得：

從式（3）峰展寬表達(dá)式中可以看出，盡可能地減少分子中的x與Kp、增大分母中的Ks，即可達(dá)到減少峰展寬的目的。據(jù)此可加強(qiáng)二級(jí)流動(dòng)相的強(qiáng)度，并適當(dāng)加大兩種流動(dòng)相的強(qiáng)度差，或使用反向傳輸形式，使被測(cè)組分保留在柱端，大大減少x，從而減少峰展寬。Yu Z等[8]通過采用上述優(yōu)化法則，選用高強(qiáng)度的二級(jí)流動(dòng)相與較低強(qiáng)度的一級(jí)流動(dòng)相，并用反向傳輸形式，使得Vi≤2 000 μl、lgKs＞3、Ve＜2 μl，可以看出取得了較好的效果。但值得注意的是，Schill G等[20]提出的峰展寬公式只考慮到進(jìn)樣量和在被測(cè)物在柱子中展寬兩個(gè)因素，并沒有涉及到柱外效應(yīng)，可以通過在組裝時(shí)盡量減小管路長(zhǎng)度來進(jìn)一步減少柱切換HPLC的死體積。另外，可選擇更有效率的二級(jí)柱[21]，以獲得更好的分離度和柱效。

2.2 系統(tǒng)峰

系統(tǒng)峰是柱切換系統(tǒng)中一個(gè)常見的問題，指的是在不進(jìn)樣情況下，切換閥空切換后，大體積一級(jí)流動(dòng)相進(jìn)入二級(jí)柱，破壞二級(jí)柱平衡，使色譜圖上有一些正峰或負(fù)峰存在，這些峰很可能干擾測(cè)定。Arvidsson T[22]指出，可調(diào)節(jié)一級(jí)流動(dòng)相的pH，使其盡量與二級(jí)流動(dòng)相的pH一致，也可改變一級(jí)流動(dòng)相所含的鹽，加入與二級(jí)流動(dòng)相相同的鹽類來避免系統(tǒng)峰。葉利民等[23]提出，當(dāng)系統(tǒng)峰對(duì)被測(cè)組分有干擾時(shí)，可考慮通過以下方法加以避免：（1）改變流動(dòng)相的組成及配比，使系統(tǒng)峰與被測(cè)組分峰分離；（2）在流動(dòng)相中盡量減少鹽和其他添加劑的加入；（3）對(duì)于某些被測(cè)組分，對(duì)檢測(cè)限要求不高時(shí)，可選擇用較長(zhǎng)波長(zhǎng)測(cè)定；（4）在某些色譜條件下，有些系統(tǒng)峰的保留時(shí)間很長(zhǎng)，可在被測(cè)樣品組分流出后，利用一級(jí)泵進(jìn)行梯度洗脫，使高保留值的系統(tǒng)峰快速出峰，防止對(duì)下次分析造成干擾。

3 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，柱切換技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)體內(nèi)藥物的直接分析，簡(jiǎn)化前處理過程，并使整個(gè)過程更加快速、出錯(cuò)的可能性減少、分離能力提高。臨床上可用于藥動(dòng)學(xué)和體內(nèi)藥物分析工作，監(jiān)測(cè)血藥濃度，指導(dǎo)臨床用藥。隨著今后不同填料的研究以及更加巧妙的色譜網(wǎng)絡(luò)的提出，必將出現(xiàn)更多的組合模式，使其在臨床藥物分析中的應(yīng)用更加廣泛。

[1]Huber JFK，Van der Linden R，Ecker E，et al.Column swithching in high-pressure liquid chromatography[J].J Chromatogr A，1973，83（29）：267.

[2]Heinig K，Bucheli F.Fast liquid chromatographic-tandem mass spectrometric（LC-MS-MS）determination of metformin in plasma samples[J].J Pharmaceut Biomed，2004，34（5）：1 005.

[3]Chao MR，Wang CJ，Yang HH，et al.Rapid and sensitive quantification of urinary N7-methylguanine by isotope-dilution liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry with on-line solid-phase extraction[J].Rapid Commun Mass Sp，2005，19（17）：2 427.

[4]郭平，李章萬，陳朝紅，等.HPLC柱切換法血漿直接進(jìn)樣測(cè)定糖腎平[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，1992，27（6）：452.

[5]劉皋林，沙瑞國(guó)，高申，等.HPLC柱切換法測(cè)定血漿和尿樣中頭孢克肟濃度[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，1993，28（3）：216.

[6]張曉惠，王榮，謝華，等.通過柱切換技術(shù)與高效液相色譜聯(lián)用的限進(jìn)性柱對(duì)鹽酸貝那普利的在線富集性能[J].色譜，2013，31（5）：451.

[7]Yu Z，Westerlund D.Ion-pair chromatography of methotrexate in a column-switching system using an alkyl-diol silica precolumn for direct injection of plasma[J].J Chromatogr A，1996，742（1）：113.

[8]樊鵬程，馬駿，賈正平，等.在線柱切換RP-HPLC測(cè)定人血清中卡馬西平濃度[J].藥物分析雜志，2008，28（12）：2 033.

[9]郭志強(qiáng)，馬俊，賈正平.柱切換高效液相色譜法測(cè)定人血漿中替米沙坦?jié)舛萚J].藥物分析雜志，2006，26（8）：1 071.

[10]Friedrich G，Appel K，Rose T，et al.Determination of dihydroergocryptine in human plasma and urine samples using on-line sample extraction-column-switching reversedphase liquid chromatography-mass spectrometry[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2004，808（2）：131.

[11]Huber JF，Lamprecht G.Assay of neopterin in serum by means of two-dimensional high-performance liquid chromatography with automated column switching using three retention mechanisms[J].J Chromatogr B Biomed APPL，1995，666（2）：223.

[12]李章萬，郭平.HPLC柱切換法血漿直接進(jìn)樣測(cè)定環(huán)丙氟哌酸[J].藥物分析雜志，1994，14（2）：16.

[13]武曉玉，王榮，謝華，等.柱切換-高效液相色譜法快速監(jiān)測(cè)癲癇患者卡馬西平血藥濃度[J].藥物分析雜志，2013，33（10）：1 715.

[14]Eckert E，G?en T.Rapid determination of four short-chain alkyl mercapturic acids in human urine by column-switching liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].J Chromatog B Analyt Technol Biomed Life Sci，2014.doi：10.1016/j.jchromb.2014.06.009.

[15]Fagundes VF，Leite CP，Pianetti GA，et al.Rapid and direct analysis of statins in human plasma by columnswitching liquid chromatography with restricted-access material[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2014.doi：10.1016/j.jchromb.2013.12.002.

[16]Ynddal L，Hansen SH.On-line turbulent-flow chromatography-high-performance liquid chromatography-mass spectrometry for fast sample preparation and quantitation[J].J Chromatogr A，2003，1 020（1）：59.

[17]Ong VS，Cook KL，Kosara CM，et al.Quantitative bioanalysis：an integrated approach for drug discovery and development[J].Int J Mass Spectrom，2004，238（2）：139.

[18]Cass RT，Villa JS，Karr DE，et al.Rapid bioanalysis of vancomycin in serum and urine by high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry using online sample extraction and parallel analytical columns[J].Rapid Commun Mass Sp，2001，15（6）：406.

[19]高申，劉皋林，王世祥，等.柱切換高效液相色譜法在體內(nèi)藥物分析中的應(yīng)用研究[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1992，13（3）：265.

[20]Schill G，Ehrsson H，Vessman J，et al.Separation methods for drugs and related organic compounds[M].1st ed.Stockholm：Swedish Pharmaceutical Press，1978：313-314.

[21]Gritti F，Leonardis I，Shock D，et al.Performance of columns packed with the new shell particles，Kinetex-C18[J].J Chromatogr A，2010，1 217（10）：1 589.

[22]Arvidsson T.Effects of system peaks in a column-switching liquid chromatographic system for bioanalysis[J].J Chromatogr，1987，407：49.

[23]葉利民，李章萬，陳聰.高效液相色譜柱切換系統(tǒng)中系統(tǒng)峰受色譜條件的影響及其干擾的避免[J].色譜，2004，22（2）：1.