京大戟中大戟二烯醇對照品的制備研究Δ

葛秀允，孫立立，張樂林（山東省中醫(yī)藥研究院/國家中醫(yī)藥管理局中藥蜜制和制炭炮制技術(shù)與原理重點研究室，濟南 250014）

京大戟系大戟科植物大戟Euphorbia pekinensisRupr.的干燥根，是臨床常用的有毒中藥，具有瀉水逐飲、消腫散結(jié)的作用。為了分析京大戟的活性成分，本課題組對京大戟化學(xué)成分和毒性藥效作用進行了系統(tǒng)的研究。有研究發(fā)現(xiàn)，京大戟中三萜類成分是其利尿作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[1]。其中，大戟二烯醇的含量較大，質(zhì)量分數(shù)約占1%。2010 年版《中國藥典》（一部）京大戟藥材質(zhì)量標準只收載了顯微、化學(xué)法鑒別等方法。為此，本試驗以京大戟為原料，采用硅膠柱色譜、凝膠色譜、重結(jié)晶等分離方法制備大戟二烯醇化學(xué)對照品并進行標準物質(zhì)研究，以期為京大戟藥材和含京大戟的成方制劑的質(zhì)量控制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

XT-4 型雙目顯微熔點測定儀（北京泰克儀器有限公司）；500 MHz核磁共振波譜儀（瑞士Bruker 公司，以四甲基硅烷為內(nèi)標）；2020 型液質(zhì)聯(lián)用儀，包括LC-20 AD 高壓二元泵、SPD-M20A 型二級管陣列檢測器、SIL-20 AC 型自動進樣器、CTO-20 AC 型柱溫箱、LC-MS 2020 型單級四極桿質(zhì)譜、LC-Solution 工作站（日本島津公司）；1100 型高效液相色譜（HPLC）儀，包括G1361型高壓二元泵、G1365 B型多波長檢測器（美國Agilent公司）。

大戟二烯醇對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111866-201001，純度：98.6%）；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇（天津市富宇精細化工有限公司，分析純，批號分別為20140304、20140226、20140423），乙腈（天津市德恩化學(xué)試劑有限公司，色譜純，批號：20140217），水為超純水。色譜柱及薄層色譜（TLC）用硅膠（青島海洋化工廠）；聚酰胺板（浙江黃巖化工廠）；C18薄層色譜板及色譜柱用C18（40～63 μm）（德國Merck 公司）。

京大戟藥材采自山東省淄博市，經(jīng)山東省中醫(yī)藥研究院林慧彬研究員鑒定為大戟科植物大戟E.pekinensisRupr.的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 原料處理

取京大戟藥材10 kg，粉碎成粗粉，加入10 倍量的95%乙醇，浸泡0.5 h，水浴回流提取1.5 h；后加入10 倍量的95%乙醇，浸泡0.5 h，水浴回流提取1 h；后再加入10 倍量的95%乙醇，浸泡0.5 h，水浴回流提取0.5 h；合并醇提液，減壓濃縮至浸膏狀，加水溶解，分別用石油醚、乙酸乙酯及正丁醇萃??；取石油醚部位濃縮成浸膏（260 g），加硅膠拌樣，上樣于硅膠柱（200～300 目），以石油醚-乙酸乙酯（95∶5～70∶30，V/V）梯度洗脫；取洗脫流份（9∶1，V/V），用TLC法進行鑒別。以石油醚-乙酸乙酯（9∶1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以硫酸乙醇溶液顯色，105 ℃加熱5 min，結(jié)果顯示，京大戟藥材中含大戟二烯醇成分。合并大戟二烯醇富集流份，減壓回收至干，得大戟二烯醇粗品（560 mg，純度約78%）。

2.2 對照品的純化

取大戟二烯醇粗品適量，加甲醇溶解，常溫條件下反復(fù)重結(jié)晶，得到無色針狀晶體，減壓回收至干后置于恒溫干燥箱（60 ℃）干燥24 h，得到無色針狀晶體（120 mg）。

2.3 樣品的檢測

2.3.1 TLC鑒別 取“2.2”項下（共2批）大戟二烯醇自制品10 mg，加入甲醇5 ml，制成質(zhì)量濃度為2 mg/ml的溶液，作為供試品溶液。另取大戟二烯醇對照品（批號：111866-201001）適量，加甲醇制成每1 ml含2 mg大戟二烯醇的溶液，作為對照品溶液。吸取上述溶液各5 μl，分別點于同一硅膠G 薄層色譜板上，以石油醚-乙酸乙酯（9∶1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，以硫酸乙醇溶液為顯色劑，105 ℃加熱5 min，置于日光下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，與對照品色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點，其余雜質(zhì)無干擾。TLC圖見圖1。

圖1 大戟二烯醇的薄層色譜圖1～2.大戟二烯醇自制品；3.大戟二烯醇對照品Fig 1 TLC identification of euphol1-2.self-made products of euphol；3.reference substance of euphol

2.3.2 HPLC-紫外（UV）法檢測 取“2.2”項下大戟二烯醇自制品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為100 μg/ml的溶液。色譜柱：Benetnach C8（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.2%磷酸（83∶17，V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：203 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μl。理論板數(shù)以大戟二烯醇峰計不得少于4 000。精密稱取大戟二烯醇對照品適量，加入甲醇制成質(zhì)量濃度為0.4 mg/ml的對照品溶液，按上述色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖2。以峰面積歸一化法計算大戟二烯醇質(zhì)量分數(shù)為99.7%，符合中藥新藥質(zhì)量標準含量測定用對照品的要求（純度為98.0%以上）。

圖2 大戟二烯醇的高效液相色譜圖1.大戟二烯醇Fig 2 HPLC chromatograms of euphol1.euphol

2.3.3 HPLC-質(zhì)譜（MS）法檢測 取“2.2”項下大戟二烯醇自制品適量，加甲醇配制成質(zhì)量濃度為100 μg/ml的溶液，精密吸取20 μl，使用液質(zhì)聯(lián)用儀進行檢測。質(zhì)譜條件：ESI 源，負離子模式，離子源電壓4.5 V，采用總離子流（TIC）監(jiān)測方式，掃描進樣物質(zhì)的TIC，掃描范圍（m/z）為50～2 000，掃描間隔0.5 s，HPLC-MS 質(zhì)量分數(shù)檢查圖譜見圖3。由圖3 可知，樣品經(jīng)HPLC 柱分離，僅產(chǎn)生一個顯著的離子峰，該離子峰經(jīng)選擇性離子監(jiān)測發(fā)現(xiàn)其為負離子m/z為426.7 的化合物，未見其他離子峰。

圖3 大戟二烯醇的離子碎片1.大戟二烯醇Fig 3 Ion fragments of euphol1.euphol

2.4 結(jié)構(gòu)鑒定

本品為無色針狀晶體，mp 115～117 ℃（甲醇）；ESI-MS分子離子峰為425[M-H]－。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：5.05（1H，t，J＝2.3 Hz，H-12）、3.23（1H，dd，J＝5.7，10.35 Hz，H-3）、1.11（6H，s，2×CH3）、0.93（3H，d，J＝6.6 Hz）、0.89（3H，s）、0.84（3H，d，J＝6.6 Hz）、0.79（3H，s）、0.76（3H，s）、0.73（3H，s）。

13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：38.03（C-1）、27.15（C-2）、79.11（C-3）、38.81（C-4）、55.56（C-5）、18.61（C-6）、32.57（C-7）、39.29（C-8）、48.12（C-9）、37.62（C-10）、23.56（C-11）、117.94（C-12）、145.48（C-13）、41.65（C-14）、25.07（C-15）、34.63（C-16）、40.06（C-17）、52.65（C-18）、22.83（C-19）、28.39（C-20）、60.12（C-21）、31.73（C-22）、28.06（C-23）、15.38（C-24）、15.28（C-25）、16.33（C-26）、22.22（C-27）、18.57（C-28）、22.50（C-29）、22.64（C-30）。

以上光譜數(shù)據(jù)經(jīng)與文獻[2]對照，確定該化合物為大戟二烯醇（C30H5O）。

3 討論

京大戟常用于胸膜炎積水、腹水型晚期血吸蟲病、肝硬化腹水及精神分裂癥等，主產(chǎn)于湖南、江蘇、山東等地，四川、福建、江西等地亦產(chǎn)[3-4]。

京大戟中主要含有三萜類、二萜類、黃酮類、生物堿、有機酸、鞣質(zhì)、樹脂膠和大戟色素體A、B、C 等成分，具有利尿、瀉下、抗炎和抗腫瘤等藥理作用。

本研究將大戟二烯醇作為京大戟的特征性指標成分并進行標準物質(zhì)研究，專屬性較強，制備方法簡單可行，符合國家食品藥品監(jiān)督管理總局頒布的“中藥新藥質(zhì)量標準用對照品研究的技術(shù)要求”的相關(guān)規(guī)定，可為京大戟藥材和含京大戟的成方制劑的質(zhì)量控制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)[2，5-9]。

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