洋蔥atp6基因的克隆與系統(tǒng)進(jìn)化分析

王振寶等

摘要：細(xì)胞質(zhì)雄性不育（CMS）在作物遺傳育種研究中占有重要地位，多種植物的細(xì)胞質(zhì)雄性不育均與線粒體基因結(jié)構(gòu)變異及新嵌合基因的產(chǎn)生有關(guān)。為探索線粒體atp6基因與洋蔥CMS的關(guān)系，以13份不育系和11份保持系為材料克隆洋蔥atp6基因編碼序列，測(cè)序結(jié)果表明不同材料atp6基因間存在一個(gè)C/A多態(tài)性位點(diǎn)，該多態(tài)性位點(diǎn)在不育系和保持系間隨機(jī)出現(xiàn)，而不是不育系與保持系的特征差異。蛋白質(zhì)分析表明這一多態(tài)性位點(diǎn)的變異并未改變atp6蛋白跨膜結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步的蛋白比對(duì)分析揭示了atp6蛋白在物種間有一定的保守性，特別是第IV跨膜結(jié)構(gòu)域的Arg在所有物種中是高度保守的，也是H+轉(zhuǎn)運(yùn)所必需的?；赼tp6蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示細(xì)菌和病毒位于樹(shù)的基部，其次是真菌、低等藻類(lèi)以及原生生物，然后高等藻類(lèi)、苔蘚和蕨類(lèi)，高等綠色開(kāi)花植物處于樹(shù)的頂端，單子葉植物處于樹(shù)的最頂端。

關(guān)鍵詞：洋蔥；雄性不育；atp6基因；系統(tǒng)進(jìn)化

中圖分類(lèi)號(hào)：Q785文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2014）01-0010-05

洋蔥（AlliumcepaL.）又名玉蔥、圓蔥、蔥頭等，起源于亞洲西部，屬于百合科蔥蒜屬二年生蔬菜，廣泛種植于世界各地。洋蔥于近代傳入我國(guó)，由于具有適應(yīng)性強(qiáng)、耐貯藏和運(yùn)輸?shù)奶攸c(diǎn)，發(fā)展迅速。洋蔥是類(lèi)黃酮的重要食物來(lái)源之一，對(duì)人體的健康有很大的影響，它具有廣泛的生物活性和重要的藥用價(jià)值，在防止心血管疾病、抗腫瘤、抗自由基、抗氧化、抗過(guò)敏、消炎、抗病毒等方面有重要作用[1]。

洋蔥是最早利用雄性不育系育種的蔬菜作物之一，雄性不育的產(chǎn)生通常是由于線粒體基因的插入、缺失、重排等造成的基因突變以及形成新的嵌合基因[2]。在以往的研究中，此類(lèi)基因主要為能量代謝相關(guān)蛋白（ATP、Cob、Cox和NAD/NADP）基因[3]。atp6基因是重要的線粒體功能基因，編碼F1F0-ATP合成酶系統(tǒng)中F0部分最大亞基——A亞基[4]。目前已知水稻、油菜、蘿卜、大豆的雄性不育與atp6基因的突變有關(guān)[5～8]。前人的研究表明，在S（Sterile）型細(xì)胞質(zhì)與N/T（Normal）型細(xì)胞質(zhì)之間，atp6基因的編碼序列存在一個(gè)堿基的突變[9，10]，該突變是否是導(dǎo)致雄性不育的原因目前尚無(wú)定論。本研究克隆了洋蔥13個(gè)不育系與11個(gè)保持系的atp6基因，對(duì)其核酸和編碼蛋白序列進(jìn)行了生物信息學(xué)及進(jìn)化樹(shù)分析，以期通過(guò)單倍型的分布和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，探究atp6基因是否是導(dǎo)致洋蔥雄性不育的直接原因。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

以13份雄性不育系（110，118，502，503，101，117-5，117-11-1，117-10-1，117-10-2，117-10-3，L701，L702和L703）和11份保持系（210，218，602，603，202，217-5，217-11-1，217-10-1，217-10-2，217-10-3和L801）為材料進(jìn)行基因克隆[11]。洋蔥新鮮葉片采自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所試驗(yàn)基地，取樣后迅速放入液氮中冷凍，于-80°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2洋蔥基因組總DNA的提取

洋蔥基因組總DNA的提取采用快捷型植物基因組DNA提取試劑盒（Tiangen，北京），方法參照操作說(shuō)明書(shū)。

1.3洋蔥atp6基因克隆

本研究所用的上游引物P1：5′-ATGAGTGCTGAAAGTAGGAAAGAGTA-3′，下游引物P2：5′-TCAATGTTGATATGACTCATTTTGATG-3′，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

PCR反應(yīng)總體積為25μl，其中模板（基因組DNA）1μl，2.5mmol/LdNTPs4μl，10×LATaqbuffer2.5μl，引物各1μl，TaKaRaLATaq0.25μl，用滅菌蒸餾水補(bǔ)齊至25μl。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃保溫10min，4℃保存。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)上檢測(cè)并拍照記錄。目的條帶用凝膠回收試劑盒（Tiangen，北京）回收，與克隆載體pMD18-T（寶生物，大連）連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Escherichiacoli）DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選、菌液PCR鑒定后，將陽(yáng)性克隆送博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4序列分析

利用DNAMAN和Blast（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi）進(jìn)行序列比對(duì)；SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）、TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）用于蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析；MEGA5用于系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析。

2結(jié)果與分析

2.1洋蔥atp6基因的克隆與序列特征

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果（圖1）顯示，擴(kuò)增片段大小約為800bp，與預(yù)期片段大小相吻合。將陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定及分析后發(fā)現(xiàn)，24個(gè)洋蔥育種系的atp6基因間存在一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)C/A，且該多態(tài)性位點(diǎn)在不育系內(nèi)、保持系內(nèi)以及不育系和保持系間均隨機(jī)出現(xiàn)（表1）。這一結(jié)果表明，C/A多態(tài)性位點(diǎn)的突變并不是不育系或者保持系所特有的共性突變。

洋蔥atp6基因編碼蛋白序列與已報(bào)道其他物種同源序列相似度從40%到90%不等，相似度最高的物種為海棗（Phoenixdactylifera），最低的為印度洋大洋桿菌（Oceanibaculumindicum）。其中第IV跨膜結(jié)構(gòu)域的Arg在所有物種中是高度保守的，也是H+轉(zhuǎn)運(yùn)所必需的。

為進(jìn)一步了解atp6蛋白的進(jìn)化、分類(lèi)以及作為系統(tǒng)進(jìn)化研究材料的可能性，對(duì)101條來(lái)自不同物種的atp6蛋白序列進(jìn)行序列聯(lián)配，并用ML法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)化樹(shù)直觀地顯示了高等綠色植物、藻類(lèi)、真菌、細(xì)菌和病毒之間的親緣關(guān)系（圖3）。細(xì)菌和病毒位于樹(shù)的基部，其次是真菌、原生生物以及綠藻，然后是高等植物。在高等綠色開(kāi)花植物分支內(nèi)部，所有的雙子葉植物均處于一個(gè)大的分支上，單子葉植物存在多個(gè)分支，且單子葉植物處于樹(shù)的最頂端。

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)以13份雄性不育系和11份保持系為材料克隆了洋蔥atp6基因，序列分析表明，不同材料的洋蔥atp6基因在92bp處存在一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)C/A，這個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)在不育系內(nèi)、保持系內(nèi)以及不育系和保持系之間隨機(jī)出現(xiàn)。該多態(tài)性位點(diǎn)堿基的突變（C-A）使得第31位Ser突變?yōu)門(mén)yr，然而第一跨膜結(jié)構(gòu)域起始位點(diǎn)為第34位，并未引起atp6跨膜結(jié)構(gòu)域的變化，說(shuō)明洋蔥atp6基因在該多態(tài)性位點(diǎn)的變異，并不是造成洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育的直接原因。

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，atp6基因編碼蛋白在整體上是根據(jù)物種類(lèi)型聚類(lèi)的，可以明顯的劃分為四類(lèi)，細(xì)菌和病毒，真菌、低等藻類(lèi)和原生生物，高等藻類(lèi)、苔蘚和蕨類(lèi)，及高等綠色開(kāi)花植物。細(xì)菌和病毒位于樹(shù)的基部，說(shuō)明其在進(jìn)化地位上是最原始的類(lèi)型，其次是真菌、原生生物以及低等藻類(lèi)，然后是高等藻類(lèi)、苔蘚和蕨類(lèi)，高等植物處于樹(shù)的頂端，且單子葉植物處于樹(shù)的最頂端，這個(gè)結(jié)果符合生物起源與進(jìn)化的關(guān)系[12]。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的分析結(jié)果也支持高等綠色植物和現(xiàn)代藻類(lèi)均與Mesostigmaviride（原始綠藻）具有共同祖先的觀點(diǎn)[13]。在高等綠色開(kāi)花植物分支內(nèi)部，單子葉植物的洋蔥、海棗和雙子葉植物處于一個(gè)分支，單子葉植物內(nèi)部也存在多個(gè)不同起源，這說(shuō)明在單、雙子葉植物分化以前atp6基因已經(jīng)產(chǎn)生了分化，或者是單、雙子葉植物存在不同的起源[12]，因此，atp6基因在一定程度上能夠反映物種進(jìn)化的先后順序，但atp6基因的進(jìn)化與物種的進(jìn)化并不是完全同時(shí)發(fā)生的。

參考文獻(xiàn)：

[1]霍鳳梅，繆軍，吳雄，等.洋蔥查爾酮合成酶基因的分子克隆和表達(dá)分析[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，5：1-4.

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[8]韓利濤，楊守萍，喻德躍，等.大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育系與保持系atp6基因的RNA編輯比較研究[J].大豆科學(xué)，2010，29（3）：361-365.

[9]趙婷，朱騰義.煙草線粒體基因atp6的SNP及其與CMS的相關(guān)性[J].作物學(xué)報(bào)，2009，35（9）：1655-1661.

[10]周曉娟，趙瑞，王永勤.洋蔥異源胞質(zhì)雄性不育候選基因atp6的克隆與表達(dá)分析[J].沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，43（2）：148-152.

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[12]CronquistA.Anintegratedsystemofclassificationoffloweringplants[M].NewYork：ColumbiaUniv.Press，1981.

[13]BhattacharyaD，WeberK，AnSS，etal.ActinphylogenyidentifiesMesostigmavirideasaflagellateancestorofthelandplants[J].MolecularBiologyandEvolution，1998，47（5）：544-553.

為進(jìn)一步了解atp6蛋白的進(jìn)化、分類(lèi)以及作為系統(tǒng)進(jìn)化研究材料的可能性，對(duì)101條來(lái)自不同物種的atp6蛋白序列進(jìn)行序列聯(lián)配，并用ML法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)化樹(shù)直觀地顯示了高等綠色植物、藻類(lèi)、真菌、細(xì)菌和病毒之間的親緣關(guān)系（圖3）。細(xì)菌和病毒位于樹(shù)的基部，其次是真菌、原生生物以及綠藻，然后是高等植物。在高等綠色開(kāi)花植物分支內(nèi)部，所有的雙子葉植物均處于一個(gè)大的分支上，單子葉植物存在多個(gè)分支，且單子葉植物處于樹(shù)的最頂端。

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)以13份雄性不育系和11份保持系為材料克隆了洋蔥atp6基因，序列分析表明，不同材料的洋蔥atp6基因在92bp處存在一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)C/A，這個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)在不育系內(nèi)、保持系內(nèi)以及不育系和保持系之間隨機(jī)出現(xiàn)。該多態(tài)性位點(diǎn)堿基的突變（C-A）使得第31位Ser突變?yōu)門(mén)yr，然而第一跨膜結(jié)構(gòu)域起始位點(diǎn)為第34位，并未引起atp6跨膜結(jié)構(gòu)域的變化，說(shuō)明洋蔥atp6基因在該多態(tài)性位點(diǎn)的變異，并不是造成洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育的直接原因。

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，atp6基因編碼蛋白在整體上是根據(jù)物種類(lèi)型聚類(lèi)的，可以明顯的劃分為四類(lèi)，細(xì)菌和病毒，真菌、低等藻類(lèi)和原生生物，高等藻類(lèi)、苔蘚和蕨類(lèi)，及高等綠色開(kāi)花植物。細(xì)菌和病毒位于樹(shù)的基部，說(shuō)明其在進(jìn)化地位上是最原始的類(lèi)型，其次是真菌、原生生物以及低等藻類(lèi)，然后是高等藻類(lèi)、苔蘚和蕨類(lèi)，高等植物處于樹(shù)的頂端，且單子葉植物處于樹(shù)的最頂端，這個(gè)結(jié)果符合生物起源與進(jìn)化的關(guān)系[12]。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的分析結(jié)果也支持高等綠色植物和現(xiàn)代藻類(lèi)均與Mesostigmaviride（原始綠藻）具有共同祖先的觀點(diǎn)[13]。在高等綠色開(kāi)花植物分支內(nèi)部，單子葉植物的洋蔥、海棗和雙子葉植物處于一個(gè)分支，單子葉植物內(nèi)部也存在多個(gè)不同起源，這說(shuō)明在單、雙子葉植物分化以前atp6基因已經(jīng)產(chǎn)生了分化，或者是單、雙子葉植物存在不同的起源[12]，因此，atp6基因在一定程度上能夠反映物種進(jìn)化的先后順序，但atp6基因的進(jìn)化與物種的進(jìn)化并不是完全同時(shí)發(fā)生的。

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為進(jìn)一步了解atp6蛋白的進(jìn)化、分類(lèi)以及作為系統(tǒng)進(jìn)化研究材料的可能性，對(duì)101條來(lái)自不同物種的atp6蛋白序列進(jìn)行序列聯(lián)配，并用ML法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)化樹(shù)直觀地顯示了高等綠色植物、藻類(lèi)、真菌、細(xì)菌和病毒之間的親緣關(guān)系（圖3）。細(xì)菌和病毒位于樹(shù)的基部，其次是真菌、原生生物以及綠藻，然后是高等植物。在高等綠色開(kāi)花植物分支內(nèi)部，所有的雙子葉植物均處于一個(gè)大的分支上，單子葉植物存在多個(gè)分支，且單子葉植物處于樹(shù)的最頂端。

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)以13份雄性不育系和11份保持系為材料克隆了洋蔥atp6基因，序列分析表明，不同材料的洋蔥atp6基因在92bp處存在一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)C/A，這個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)在不育系內(nèi)、保持系內(nèi)以及不育系和保持系之間隨機(jī)出現(xiàn)。該多態(tài)性位點(diǎn)堿基的突變（C-A）使得第31位Ser突變?yōu)門(mén)yr，然而第一跨膜結(jié)構(gòu)域起始位點(diǎn)為第34位，并未引起atp6跨膜結(jié)構(gòu)域的變化，說(shuō)明洋蔥atp6基因在該多態(tài)性位點(diǎn)的變異，并不是造成洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育的直接原因。

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，atp6基因編碼蛋白在整體上是根據(jù)物種類(lèi)型聚類(lèi)的，可以明顯的劃分為四類(lèi)，細(xì)菌和病毒，真菌、低等藻類(lèi)和原生生物，高等藻類(lèi)、苔蘚和蕨類(lèi)，及高等綠色開(kāi)花植物。細(xì)菌和病毒位于樹(shù)的基部，說(shuō)明其在進(jìn)化地位上是最原始的類(lèi)型，其次是真菌、原生生物以及低等藻類(lèi)，然后是高等藻類(lèi)、苔蘚和蕨類(lèi)，高等植物處于樹(shù)的頂端，且單子葉植物處于樹(shù)的最頂端，這個(gè)結(jié)果符合生物起源與進(jìn)化的關(guān)系[12]。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的分析結(jié)果也支持高等綠色植物和現(xiàn)代藻類(lèi)均與Mesostigmaviride（原始綠藻）具有共同祖先的觀點(diǎn)[13]。在高等綠色開(kāi)花植物分支內(nèi)部，單子葉植物的洋蔥、海棗和雙子葉植物處于一個(gè)分支，單子葉植物內(nèi)部也存在多個(gè)不同起源，這說(shuō)明在單、雙子葉植物分化以前atp6基因已經(jīng)產(chǎn)生了分化，或者是單、雙子葉植物存在不同的起源[12]，因此，atp6基因在一定程度上能夠反映物種進(jìn)化的先后順序，但atp6基因的進(jìn)化與物種的進(jìn)化并不是完全同時(shí)發(fā)生的。

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