改性粘土對滸苔(Ulva prolifera)微觀繁殖體去除效果及萌發(fā)的影響*

李 靖 孫 雷 宋秀賢 俞志明

(1. 中國科學(xué)院海洋研究所海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點實驗室 青島 266071; 2. 中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049;3. 中國海洋大學(xué) 青島 266003)

2007年以來由滸苔引發(fā)的綠潮在中國黃海沿岸連年暴發(fā), 引起了世界媒體包括海洋科學(xué)界的高度關(guān)注(喬方利等, 2011)。2008年7月中旬第29屆奧運會開幕前夕, 600km2的綠潮在青島沿岸爆發(fā), 地方政府動用萬余人清除在關(guān)鍵海域漂浮及在海岸堆積的綠藻, 清除量約為80萬噸(喬方利等, 2008)。2013年6月 26日國家海洋局北海分局在黃海中南部海域(119°11′—124°0′E, 34°23′—36°42′N)發(fā)現(xiàn)綠潮, 總覆蓋面積約 710km2, 總分布面積約 25700km2(a)。2014年 06 月 23 日, 在(119°16'—122°8'E, 32°48'— 36°40'N)海域發(fā)現(xiàn)綠潮, 覆蓋面積約 481km2, 分布面積約37530km2(b)。

綠潮是大型海洋綠藻在潮間帶和淺海海域大量繁殖造成生物量積累的現(xiàn)象(Anderson et al, 2002)。形成綠潮的藻類通常包括石莼屬(Ulva)、硬毛藻屬(Chaetomorpha)、剛毛藻屬(Cladophora)的一些種類。在過去的三十年中, 綠潮在全世界的近海、河口等區(qū)域時有暴發(fā), 美國(Nelson et al, 2008)、法國(Charlier et al, 2007)、日本(Hiraoka et al, 2004)、菲律賓(Largo et al, 2004)、南非(Anderson et al, 1996)等國均有報道,而且其暴發(fā)規(guī)模和頻率均有逐漸上升的趨勢(Liu et al, 2013) , 大規(guī)模綠藻的暴發(fā)正在演化成為一種持久性的海洋生態(tài)災(zāi)害。綠潮發(fā)生會造成其他生物生物量的減少、降低海草床(seagrass beds)的重建能力。同時,綠藻死亡、沉降和分解時會消耗培養(yǎng)液中大量溶解氧,將導(dǎo)致或加劇低氧區(qū)的形成(Ye et al, 2011), 造成區(qū)域內(nèi)生物多樣性降低以及無脊椎動物、魚類甚至海洋哺乳動物的死亡。此外, 綠潮的暴發(fā)也給當?shù)氐穆糜螛I(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)、漁業(yè)、航海安全等海洋產(chǎn)業(yè)在不同程度上造成損失。

近年來, 發(fā)生在我國黃海的大規(guī)模綠潮引起政府部門、公眾和有關(guān)研究者的關(guān)注, 其中漂浮聚集到青島近海的綠藻經(jīng)鑒定為綠藻門、石莼目、石莼科、石莼屬的滸苔(Ulva prolifera)(Wang et al, 2010, Zhao et al, 2013)。目前, 對滸苔的研究多集中于其生活史、黃海綠潮成因等方面, 對控制滸苔快速繁殖、防止或降低綠潮災(zāi)害發(fā)生的方法研究未見報道。

改性粘土技術(shù)是一種成本低、快速有效、對環(huán)境無負面影響的有害藻華應(yīng)急消除方法(Anderson,1997; Anderson et al, 2001), 在我國已成功應(yīng)用于2005年全運會、2008年奧帆賽、2011年世界大運會等諸多重要國內(nèi)外賽事水域的藻華應(yīng)急處置中(張雅琪等, 2013)。滸苔的繁殖方式復(fù)雜多樣, 其生活史有孢子體和配子體兩個世代(王建偉等, 2006; 王曉坤等,2007; Lin et al, 2008), 不同世代繁殖過程中釋放出的雌雄配子、孢子以及配子接合形成的合子體積微小且近似, 長 6.5—12μm, 寬 2.5—5.3μm(王曉坤等, 2007),被通稱為微觀繁殖體(Callow et al, 1997)。本研究中將滸苔微觀繁殖體視為一種球形微藻, 考察了改性粘土對其絮凝去除效果以及萌發(fā)率的影響, 研究結(jié)果將對有效防控綠潮災(zāi)害具有重要指導(dǎo)意義和應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

改性粘土的制備參見文獻(俞志明等, 1994)。滸苔樣品采集自青島第一海水浴場潮間帶。取回的滸苔用滅菌海水沖洗后, 放入經(jīng)高壓滅菌天然海水配制的 f/2培養(yǎng)液中暫養(yǎng), 培養(yǎng)溫度 20±1°C, 光照度3000lx左右, 光暗比L∶D=12h∶12h。滸苔微觀繁殖體的誘導(dǎo)方法參見文獻(張曉紅, 2011)。

1.2 去除實驗

通過誘導(dǎo)獲取密度為4.8×105cell/mL的滸苔微觀繁殖體培養(yǎng)液, 分別取50mL上述培養(yǎng)液加入8支具塞比色管中。配制濃度為 50g/L的改性粘土儲備液,分別取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、2.0mL改性粘土儲備液加入比色管, 并迅速混勻, 使其在培養(yǎng)液中的最終濃度依次為 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、2.0g/L。加入改性粘土后的15min、30min、1h、2h、3h、4h, 從各比色管中上層取1mL培養(yǎng)液至離心管中,加入10μL盧戈氏液固定, 用血球計數(shù)板計數(shù)。

1.3 萌發(fā)實驗

去除實驗結(jié)束后, 首先從每個比色管的上層取適量體積培養(yǎng)液至 24孔板中, 然后將比色管中上層培養(yǎng)液和沉降后的絮體重新混合, 再取出適當體積至 24孔板中。為方便萌發(fā)后的計數(shù), 每個樣品設(shè)置不稀釋、稀釋 10倍、稀釋 100倍三種濃度梯度, 培養(yǎng)溫度(20±1)°C, 光照度3000lx左右, 光暗比L∶D=12h∶12h, 3d后觀察滸苔微觀繁殖體的萌發(fā)情況。

萌發(fā)率(Germination rate, R)的計算公式為:

其中, x為顯微鏡下多個視野中觀察到的萌發(fā)數(shù)目; n為觀察的視野個數(shù); D為培養(yǎng)皿的底面直徑; d為顯微鏡下一個視野的直徑, 等于目鏡視場數(shù)/物鏡倍率; N為每毫升培養(yǎng)液中微觀繁殖體的個數(shù); V為每個培養(yǎng)皿中所加入的培養(yǎng)液體積(mL)。

2 結(jié)果與討論

2.1 改性粘土去除滸苔微觀繁殖體的動力學(xué)變化規(guī)律

本實驗誘導(dǎo)收集到的滸苔微觀繁殖體密度為4.8×105cell/mL。結(jié)果顯示, 添加改性粘土 1h內(nèi)滸苔微觀繁殖體密度快速降低, 之后趨于平緩, 4h內(nèi)絮凝沉降基本完成。

添加改性粘土后滸苔微觀繁殖體密度和去除率隨時間的變化情況如圖1所示。由于滸苔微觀繁殖體附著和自然沉降的存在, 未添加改性粘土的對照組3h時其在培養(yǎng)液中的密度降為4.0×105cell/mL, 微觀繁殖體密度下降比率為16.7%。添加0.5g/L改性粘土濃度組, 1h時微觀繁殖體密度降至2.0×105cell/mL, 1h去除率為 58.3%; 3h時微觀繁殖體密度降至 0.6×105cell/mL, 3h去除率為87.5%。添加1.0g/L改性粘土組, 1h時微觀繁殖體密度迅速降至0.5×105cell/mL,1h去除率為 89.6%; 3h后微觀繁殖體密度降至了0.15×105cell/mL, 3h去除率為96.9%。

從圖1中各曲線的斜率可以直觀的看出, 隨著改性粘土濃度的提高, 不同時間點滸苔微觀繁殖體的去除速率都有所提高。本研究中將滸苔微觀繁殖體看成一種球形微藻, 根據(jù)以往的研究(俞志明等, 1995)可知粘土/改性粘土顆粒與赤潮生物的絮凝作用及絮凝速率受控于單位體積中粘土-細胞絮凝物、微藻生物和粘土顆粒的數(shù)目及生成絮凝物的有效碰撞所占總碰撞次數(shù)的比例, 通過提高改性粘土的濃度即可提高絮凝速率, 本研究中圖1結(jié)果即驗證了該結(jié)論。此外, 隨著絮凝過程的繼續(xù), 培養(yǎng)液中的滸苔微觀繁殖體及改性粘土顆粒相應(yīng)減少, 從而絮凝速率也會減慢, 最終趨于在低水平保持穩(wěn)定。

不同時間段內(nèi)改性粘土對滸苔微觀繁殖體的去除率見圖 2。不添加改性粘土?xí)r, 滸苔微觀繁殖體具有一定的自沉降/固著速率, 此速率在不同的時間段內(nèi)均維持在較低水平。添加不同濃度改性粘土后, 1h內(nèi)去除率均顯著高于 1—2h、2—3h及 3—4h(P＜0.05)。2—3h與3—4h內(nèi)去除率無顯著差異, 且與未添加改性粘土的對照組十分接近, 說明 4h內(nèi)絮凝沉降已基本完成, 因此, 本研究中選取添加改性粘土后 4h考察其對滸苔微觀繁殖體的去除效果。

圖1 不同改性粘土濃度下培養(yǎng)液中滸苔微觀繁殖體密度隨時間的變化Fig.1 Changes in Ulva prolifera microscopic propagule density with time under different concentrations of modified clay

圖2 不同濃度的改性粘土在不同時間段對滸苔微觀繁殖體的去除速率Fig.2 Efficiency of removal on microscopic propagules with modified clay in different concentrations and time

2.2 改性粘土對滸苔微觀繁殖體的去除效果

本研究使用初始密度為4.8×105cell/mL的滸苔微觀繁殖體培養(yǎng)液進行去除實驗, 發(fā)現(xiàn)改性粘土對滸苔微觀繁殖體的去除效果與相似粒徑的球形微藻類似, 如圖 3所示, 隨著改性粘土濃度的提高, 滸苔微觀繁殖體的熒光值快速降低, 去除率逐漸提高。不添加改性粘土的對照組 4h后密度降至 3.8×105cell/mL,說明實驗中滸苔微觀繁殖體存在少量附著和自然沉降現(xiàn)象; 添加 0.4g/L改性粘土的微觀繁殖體密度由開始的4.8×105cell/mL降至8.0×104cell/mL, 去除率達到 83.3%; 添加 0.5g/L的改性粘土, 密度降至4.2×104cell/mL, 去除率達到91.3%。

改性粘土對微藻的絮凝效果主要通過靜電作用和范德華作用實現(xiàn), 與粘土的種類、濃度及改性方式有著密切的關(guān)系, 同時也與微藻的種類、大小、表面電位及胞外物質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)(俞志明等, 1994)。本實驗采用的聚合氯化鋁(PAC)改性高嶺土可高效去除微藻生物的原因, 首先是改性后粘土表面的負電位變成正電位, 與呈負電位的藻華生物細胞之間由相互排斥轉(zhuǎn)變?yōu)槲? 另外, PAC高分子量、長分子鏈的特點, 使其對藻華生物細胞的作用半徑增大, 橋聯(lián)作用也增加了粘土與藻華生物細胞之間的范德華作用(俞志明等, 1994)。以往研究表明, 一定濃度的改性粘土對裸甲藻(Gymnodinium aerucyinosum Stein)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum Bohlin)、赤潮異彎藻(Heterosigma akashiwo)、中肋骨條藻(Skeletonema costatum)、微型原甲藻(Prorocentrum minimum)、褐潮藻(Aureococcus anophagefferens)等均有良好的去除效果(俞志明等, 1994; 曹西華等, 2003; 張雅琪等,2013)。滸苔微觀繁殖體(包括孢子、配子、合子)個體長 10μm 左右, 寬 5μm 左右, 大小與微藻細胞相仿,且表面分泌的糖蛋白使其易發(fā)生附著(王建偉等,2006; 王曉坤等, 2007)。此外, 與上述幾種微藻類似,使用 Zeta電位儀測得試驗用微觀繁殖體培養(yǎng)液的電位為負值, 因此, 表面呈正電性的改性粘土對滸苔微觀繁殖體有較好的絮凝效果。

圖3 添加不同用量改性粘土4h后微觀繁殖體密度以及去除率的變化情況Fig.3 Changes in the microscopic propagule density and removal rate 4 hours after addition of modified clay

2.3 改性粘土對滸苔微觀繁殖體萌發(fā)的影響

實際應(yīng)用中, 大部分的改性粘土-微藻絮凝物沉降到海底, 有少部分可能會在海流和水團的作用下與上層水體重新混勻, 使被絮凝的微藻(本文中為滸苔微觀繁殖體)重新釋放到水中。故本研究在改性粘土去除實驗后, 分別測定了上層培養(yǎng)液中微觀繁殖體的萌發(fā)率, 以及上層培養(yǎng)液與絮凝物重新混勻的培養(yǎng)液中微觀繁殖體的萌發(fā)率(見圖 4)。實驗結(jié)果表明, 隨著改性粘土濃度從0g/L提高到1.0g/L, 上層培養(yǎng)液中滸苔微觀繁殖體的萌發(fā)率由 58%降至 1.6%;而在重新混勻的培養(yǎng)液中, 微觀繁殖體的萌發(fā)率由57%降至6.5%。可見改性粘土的使用能夠有效降低微觀繁殖體的萌發(fā)率, 重新混合之后萌發(fā)率相比上層培養(yǎng)液有所提高, 但是在改性粘土的濃度達到1.0g/L時, 依然能夠起到很好的抑制萌發(fā)的作用。

在改性粘土的作用下, 大部分的滸苔微觀繁殖體絮凝沉降至培養(yǎng)液底層, 故上層培養(yǎng)液中含有的繁殖體數(shù)目相對較少。對比圖3和圖4可以發(fā)現(xiàn), 隨著改性粘土的提高, 上層培養(yǎng)液中滸苔微觀繁殖體的萌發(fā)率與其密度的下降趨勢基本一致。因此, 上層培養(yǎng)液中滸苔微觀繁殖體萌發(fā)率降低的主要原因,可以歸結(jié)為改性粘土通過其絮凝沉降作用去除了培養(yǎng)液中大部分的微觀繁殖體。

而對于重新混勻之后的培養(yǎng)液, 滸苔微觀繁殖體萌發(fā)率隨改性粘土濃度而變化(如圖 4)的原因與形成絮體的致密性有關(guān)。在改性粘土用量較低時, 形成的絮凝體強度、致密性較低, 在被重新混勻的過程中那些被改性粘土絮凝沉降的滸苔微觀繁殖體容易擺脫絮凝體的束縛, 重新回到培養(yǎng)液中, 繼而萌發(fā), 這可能是導(dǎo)致低濃度改性粘土添加組重新混合之后萌發(fā)率相對較高的原因。隨著改性粘土濃度的增加, 絮凝體的強度和致密性均相對提高, 被絮凝的滸苔微觀繁殖體難以脫離其束縛, 由圖4可見在改性粘土用量為1.0g/L時, 兩種取樣方法中萌發(fā)率的差異并不明顯。

此外, 大型藻類微觀繁殖體的釋放、萌發(fā)和生長受到光照、溫度、鹽度、營養(yǎng)鹽等一系列因素的影響。Sousa等(2007)的研究發(fā)現(xiàn), 微觀繁殖體的萌發(fā)率和生長速度在一定范圍內(nèi)隨著光照強度的提高而增加,與培養(yǎng)液中可溶性磷酸鹽的濃度也有明顯的正相關(guān)性。改性粘土將微觀繁殖體絮凝到實驗容器底部, 使其接受到光照的強度大大降低; 沉降絮體的再懸浮也會降低培養(yǎng)液的透光度。同時, 改性粘土對培養(yǎng)液中的營養(yǎng)鹽, 特別是可溶性磷酸鹽具有較強的吸附作用(俞志明等, 1995), 早在 1940年, Murphy(1940)就發(fā)現(xiàn)高嶺土對溶液中的磷酸鹽有很強的去除能力,在pH為7—8時, 高嶺土對磷酸鹽的吸附能力為91μg P/g(Edzwald et al, 1976), 本實驗室以往研究也表明0.4g/L的改性粘土使培養(yǎng)液中的溶解無機磷降低85%(盧光遠等, 2014)。另外, 微觀繁殖體中的配子需要結(jié)合成合子才能正常萌發(fā)成為一株滸苔(Lin et al,2008), 而改性粘土的絮凝作用降低或者消除了微觀繁殖體的活動能力, 使雌雄配子接合的幾率大大降低。綜合以上幾方面的影響, 改性粘土對滸苔微觀繁殖體的萌發(fā)起到明顯的限制作用。

圖4 上層培養(yǎng)液和重新混勻的培養(yǎng)液中滸苔微觀繁殖體的萌發(fā)率Fig.4 Rates of propagules germination in upper water column and remixed water column

3 小結(jié)

添加適當濃度的改性粘土可以在4h內(nèi)將培養(yǎng)液中大部分的滸苔微觀繁殖體沉降至容器底部, 并且明顯降低其萌發(fā)率。0.4g/L的改性粘土可以從初始密度為4.8×105cell/mL的培養(yǎng)液中去除80%以上的微觀繁殖體, 1.0g/L的改性粘土可使其萌發(fā)率由60%左右降至低于6.5%。

而以往的研究表明黃海綠潮災(zāi)害的持續(xù)爆發(fā)與滸苔以復(fù)雜的繁殖方式在海洋中散布大量的微觀繁殖體有關(guān)(Ye et al, 2011; Liu et al, 2013)。即便在非繁殖季節(jié), 藻體破裂同樣能夠造成大量孢子的產(chǎn)生和釋放(Nordby, 1977)。因此, 在相關(guān)海域觀測到滸苔微觀繁殖體集中釋放時, 如能根據(jù)其實測密度噴灑適當量的改性粘土, 此方法或可成為去除海水中的微觀繁殖體, 限制滸苔萌發(fā), 消除或者減輕綠潮災(zāi)害,保障沿海經(jīng)濟持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展的有效手段。

此外, 滸苔在萌發(fā)初期(例如 2—8細胞狀態(tài)時),個體也十分微小, 可以推測改性粘土對其亦會具有良好的去除效果, 同時限制其進一步生長, 該方面的研究仍需進一步的實驗驗證。

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