中國沿海寄生性病原血卵渦鞭蟲(Hematodinium sp.)的遺傳多樣性研究*

肖 潔 張學(xué)雷① 劉瑞娟 李才文

(1. 國家海洋局第一海洋研究所 青島 266061; 2. 海洋生態(tài)環(huán)境科學(xué)與工程國家海洋局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266061;3. 中國科學(xué)院海洋研究所 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071)

血卵渦鞭蟲(Hematodinium sp.)是一類感染蟹、蝦等海洋甲殼動(dòng)物中的寄生性甲藻(parasitic dinoflagellate);該寄生性甲藻能夠在宿主的血淋巴和心臟、肝胰腺等器官的血腔內(nèi)大量繁殖, 進(jìn)而導(dǎo)致宿主呼吸、代謝等機(jī)體功能紊亂直至死亡(Stentiford et al, 2005)。自20世紀(jì)30年代, 法國科學(xué)家Chatton等(1931)首次在法國近海的綠蟹(Carcinus maenas)和港口蟹(Liocarcinus depurator)中發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了該類寄生性甲藻以來, 研究人員相繼在歐洲英吉利海峽和大西洋沿岸、美國東部沿海、阿拉斯加沿岸和加拿大西海岸, 以及澳大利亞等海域的40多種甲殼動(dòng)物宿主發(fā)現(xiàn)該寄生性甲藻感染 (Shields, 1994; 李才文等,2014)。血卵渦鞭蟲在多種重要的海洋經(jīng)濟(jì)甲殼動(dòng)物中的大規(guī)模流行, 造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失(Field et al,1992; Messick et al, 2000; Sheppard et al, 2003;Stentiford et al, 2005)。2004年, 許文軍等(2007a, b)在我國浙江沿海的養(yǎng)殖三疣梭子蟹以及廣東汕頭海域的青蟹中發(fā)現(xiàn)了血卵渦鞭蟲感染, 并發(fā)現(xiàn)該寄生性病原是造成養(yǎng)殖三疣梭子蟹“牛奶病”和青蟹“黃水病”的主要病原之一。隨后, 研究人員在我國沿海其他地區(qū)的養(yǎng)殖蝦蟹類中發(fā)現(xiàn)和報(bào)道了這類寄生性甲藻的流行(Li et al, 2008, 2013; 吳清洋等, 2010; Xu et al, 2010; 劉順等, 2014)。

近年來, 基于 DNA序列的分子標(biāo)記為鑒定和診斷該寄生性甲藻提供了新的技術(shù)手段; 并且, 隨著國際基因數(shù)據(jù)庫(Genbank)中Hematodinium相關(guān)基因序列數(shù)據(jù)日益增多, 一些種間或株系間的遺傳差異逐漸被發(fā)現(xiàn)。Hudson等(1996)最早發(fā)現(xiàn)不同宿主中的Hematodiniumspp.有著較大的遺傳差異; 隨后, 研究人員通過對 ITS1和 SSU這兩個(gè)位點(diǎn)的測序和分析,發(fā)現(xiàn)不同宿主和不同地區(qū)的株系在這兩個(gè)位點(diǎn)上有一定的堿基序列差異(Hamiltonet al, 2010; Jensenet al, 2010; Smallet al, 2012)。

已有研究和報(bào)道表明, 在我國發(fā)現(xiàn)的這種血卵渦鞭蟲的發(fā)生、流行與其他國家和地區(qū)相比存在明顯差異。例如: 在廣東汕頭牛田洋養(yǎng)殖基地感染青蟹的血卵渦鞭蟲株系發(fā)生在低鹽水體中(＜9ppt), 這與國際上普遍認(rèn)為的Hematodiniumspp.流行于高鹽水體中(＞18ppt)有明顯分歧。另外, Xu等(2010)首次在對蝦中發(fā)現(xiàn)了該寄生性甲藻感染, 初步研究表明其與感染該區(qū)域梭子蟹和青蟹的血卵渦鞭蟲具有相近的遺傳關(guān)系(相似度為99%)。隨后, Li等(2013)發(fā)現(xiàn)山東沿海的株系存在一定的遺傳多態(tài)性, 且在我國沿海流行的這種血卵渦鞭蟲(Hematodiniumsp.)與寄生于美國東海岸蘭蟹(Callinectes sapidus)中的株系遺傳關(guān)系比較接近。然而, 以上研究中涉及的遺傳信息有限,相關(guān)分析尚不足以闡明我國發(fā)現(xiàn)的血卵渦鞭蟲群體是否存在遺傳多樣性以及不同地理群體間是否存在遺傳差異等問題。

因此, 本研究采用核糖體基因中突變頻率相對較高的分子標(biāo)記(5.8S、ITS1和ITS2核糖體間區(qū)序列),研究我國沿海不同地理群體和不同宿主群體的血卵渦鞭蟲種下水平的遺傳差異, 并進(jìn)一步分析了我國沿海血卵渦鞭蟲群體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu), 及其與其他國家和地區(qū)血卵渦鞭蟲群體的遺傳關(guān)系,以期為明確我國沿海血卵渦鞕蟲株系的分類地位提供一定的科學(xué)依據(jù), 并為漁業(yè)生產(chǎn)中預(yù)防和控制該病害的發(fā)生提供理論指導(dǎo)。

表1 本研究所用rDNA序列來源、宿主及樣本數(shù)量Tab. 1 Sources, hosts, and sample sizes of rDNA sequences used in this study

1 材料與方法

1.1 血卵渦鞭蟲DNA樣品采集

感染血卵渦鞭蟲的三疣梭子蟹(Portunus Trituberculatus)和擬穴青蟹(Scylla paramamosain, 曾用名鋸緣青蟹S. Serrata[林琪, 2008])樣本, 于2012年 6—9間分別采自山東省、浙江省、廣東省沿海的養(yǎng)殖池塘(表 1); 美國得克薩斯沿岸的蘭蟹樣本由德克薩斯農(nóng)工大學(xué)(Texas A&M University) J. Gain博士采集。采集的螃蟹樣本經(jīng)血淋巴中性紅染色方法(Stentifordet al, 2005)確認(rèn)感染后, 用無菌注射器抽取病蟹血淋巴于95%酒精固定, 冷藏保存。提取DNA時(shí), 取200μL酒精固定的血淋巴, 低速(約8000r/min)離心3分鐘后棄上清; 加500μL雙蒸水洗滌沉淀, 再低速離心3分鐘, 棄上清; 然后加定量裂解液, 根據(jù)E.Z.N.ATM動(dòng)物組織 DNA提取試劑盒 (Omega Bio-Tek, USA)說明書提取樣品基因組DNA。

1.2 分子標(biāo)記目標(biāo)片段擴(kuò)增和測序

利用特異性引物(正向: 5′-CCTGGCTCGATAGA GTTG-3′; 反向: 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′;Hamiltonet al, 2010)擴(kuò)增血卵渦鞭蟲核糖體 5.8S rDNA基因和核糖體間區(qū)1、2基因(ITS1, ITS2)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系包括: 1×PCR反應(yīng)緩沖液, 終濃度為1.5mmol/L的MgCl2, 0.4mmol/L的dNTPs, 0.1mg/mL BSA, 0.02U/μL Taq酶(TaKaRa, 中國大連), 引物終濃度各為 0.5pmol/μL, 1μL DNA 模板(約 50ng)。PCR 反應(yīng)循環(huán): 95°C預(yù)變性2分鐘, 然后94°C變性30秒、57°C退火45秒、72°C延伸30秒、共35個(gè)循環(huán), 最后72°C延伸10分鐘。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳, 溴化乙啶(EtBr)染色后, 于紫外燈下觀察并成像。

用 E.Z.N.A.TM割膠回收試劑盒(Omega Bio-Tek,USA), 將目標(biāo)片段(約 1.2 kb)割膠回收。然后利用TaKaRa T載體鏈接試劑盒將回收的目標(biāo)片段連接至pMDTM19 T-Vector, 并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α。重組子經(jīng)含有 X-Gal和 IPTG的平板藍(lán)白斑篩選后, 選擇含有目標(biāo)片段的菌落進(jìn)行測序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。

1.3 基因序列比對和遺傳關(guān)系分析

為比較我國發(fā)現(xiàn)的血卵渦鞭蟲(Hematodinium sp.)與其他國家、地區(qū)株系的遺傳差異, 從NCBI基因數(shù)據(jù)庫(www.nlm.nih.gov)中下載同時(shí)包含有 ITS1和ITS2的代表性序列(表1), 其中包括2條來自中國的序列(Accession nos. JQ928405, JQ692310), 20條歐洲的序列(DQ871209—DQ871213, EF675760—EF675765,EU096214—EU096225), 和 1條來自美國的序列(JQ815886)。用MacVector 13.0軟件包(MacVector Inc.,美國)中的Muscle方法(Edgar, 2004)對下載序列以及本研究所得序列進(jìn)行比對分析。

比對后的序列導(dǎo)入PAUP 4.0(Swofford, 2002)軟件, 計(jì)算遺傳距離, 并用鄰接法(Neighbor-joining, NJ)和最大似然法(Maximum-likelihood, ML)構(gòu)建分子系統(tǒng)樹, 并進(jìn)行 1000次自舉分析(bootstrapping)檢驗(yàn)系統(tǒng)樹的可信度。

另外, 選取來源于我國的血卵渦鞭蟲的代表性序列, 依據(jù)統(tǒng)計(jì)簡約法(Statistical Parsimony Network,SPN)原理, 用TCS軟件(Clement et al, 2000)構(gòu)建序列的單倍型(Haplotype)網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 血卵渦鞭蟲基因型和出現(xiàn)頻率

利用特異性PCR擴(kuò)增, 從56個(gè)來自我國沿海的感染血卵渦鞭蟲的螃蟹樣本中共獲得 96條序列; 獲得的特異性片段總長 1203—1208bp (不包括引物),其中包含ITS1約427bp, ITS2約393bp。從美國蘭蟹樣本擴(kuò)增產(chǎn)生 18條序列, 片段總長為 1218—1221bp。通過序列比對, 本研究得的中國株血卵渦鞭蟲的序列與施慧等(Shi et al, unpubl.)提交GenBank的兩條序列(JQ928405, JQ692310)相似度達(dá) 99.1%—99.9%; 而本研究所得的美國株血卵渦鞭蟲的序列與Hanif等從美國東海岸環(huán)境樣品中測得的序列(JQ815886; Hanif et al, 2013)基本一致(相似度為99.8%—99.9%)。統(tǒng)計(jì)分析顯示, 來自我國沿海的血卵渦鞭蟲序列可以分成 14個(gè)單倍型(Haplotype); 其中單倍型ST041a有45條序列, 在我國沿海的出現(xiàn)頻率為45.9%, 單倍型060922和ST030分別有15條和13條, 發(fā)生頻率為 15.3%和13.3%, 其他的出現(xiàn)頻率較低(＜10%)。

根據(jù)樣本采集的不同地理位置, 將本研究獲得的序列分成山東(SD)、浙江(ZJ)和廣東(GD)三個(gè)群體,結(jié)果表明: 山東群體的序列多態(tài)性最低, 總共只發(fā)現(xiàn)3種單倍型, 其中單倍型 ST041a出現(xiàn)頻率最高, 達(dá)52.6%; 浙江群體共有 8個(gè)單倍型, 出現(xiàn)頻率最高的兩個(gè)單倍型為ST041a和060922, 頻率分別為24.2%和45.5%; 廣東群體共有 5個(gè)單倍型, 出現(xiàn)頻率最高的是ST041a和ST030, 頻率分別為58.7%和28.3%。按宿主種類不同, 將這些序列分成三疣梭子蟹(Pt)和擬穴青蟹(Sp)兩個(gè)群體。寄生于三疣梭子蟹的血卵渦鞭蟲序列中共發(fā)現(xiàn) 10個(gè)不同的單倍型, 其中單倍型ST041a和 060922出現(xiàn)頻率較高, 分別為 22.7%和34.1%; 而宿主為青蟹的群體中, 共有 5個(gè)單倍型,其中 ST030和 ST041a的出現(xiàn)頻率最高, 分別為24.1%和 64.8%(表 2)。

2.2 單倍型網(wǎng)絡(luò)圖

單倍型網(wǎng)絡(luò)圖(圖 1)明確顯示了在我國沿海發(fā)現(xiàn)的14個(gè)血卵渦鞭蟲單倍型之間的堿基差異(1個(gè)節(jié)點(diǎn)代表1個(gè)堿基差異)。常見單倍型ST041a處于網(wǎng)絡(luò)中心位置 。另外, 這些單倍型的變異順序沒有呈現(xiàn)明顯的規(guī)律, 即來源于同一地理群體或宿主的單倍型隨機(jī)分布于單倍型網(wǎng)絡(luò)中, 沒有集中于某一或某幾個(gè)分支中; 而且, 單倍型 ST041a在各個(gè)地理群體和宿主群體中均有出現(xiàn)。

2.3 遺傳距離與系統(tǒng)進(jìn)化樹

遺傳距離分析表明, 我國沿海的血卵渦鞭蟲株(CH)與美國株(US)遺傳上較為相近, 遺傳距離(D)為0.027; 而歐洲冷水株(EU)與中美兩個(gè)群體的遺傳差異較大, 遺傳距離分別為0.236和0.259, 約為中美之間的十倍; 相較而言, 三個(gè)群體內(nèi)部的遺傳距離明顯較小, 只有 0.001—0.003, 遠(yuǎn)小于中國群體與美國或歐洲群體之間遺傳距離(表3)。

對于我國沿海三個(gè)群體(SD、ZJ和GD)的進(jìn)一步分析后發(fā)現(xiàn)(表 3), 這三個(gè)群體之間的遺傳距離(0.001—0.003)與三個(gè)群體內(nèi)部的遺傳距離(0.001—0.004)無明顯差異; 另外, 按宿主群體劃分后的進(jìn)一步分析結(jié)果表明, 三疣梭子蟹(Pt)和青蟹(Sp)兩個(gè)群體之間的遺傳差異(0.002)與各自群體內(nèi)部的(0.001—0.003)遺傳差異也沒有明顯不同。

本研究中用最大似然法(ML)和鄰接法(NL)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹基本一致, 都可以將所有血卵渦鞭蟲序列分成三個(gè)獨(dú)立的類群; 其中, 來源于歐洲的序列組成一支, 來源于中國和美國的序列各組成親緣關(guān)系較近的姊妹支(圖2)。然而, 來源于不同宿主的序列無明顯聚類規(guī)律, 例如, 歐洲分支中來源于四種不同宿主(挪威龍蝦、黃道蟹、寄居蟹和綠蟹)的序列相互交叉, 沒有進(jìn)一步分化聚類(圖2)。

表2 14個(gè)單倍型在不同群體中的發(fā)生頻率Tab. 2 The frequencies of 14 haplotype in all geographic and host populations

圖1 14個(gè)在中國沿海發(fā)現(xiàn)的rDNA基因單倍型的TCS網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 1 The TCS network of the 14 rDNA haplotypes observed along Chinese coast

3 討論

本研究對我國山東、浙江和廣東三地感染不同宿主的血卵渦鞭蟲樣本進(jìn)行rDNA測序和遺傳分析。結(jié)果表明, 我國沿海不同地理群體和侵染不同宿主的血卵渦鞭蟲不存在明顯的遺傳差異, 應(yīng)來源于同一自然群體; 我國沿海的血卵渦鞭蟲群體為一獨(dú)立的遺傳株系, 與寄生于美國蘭蟹的H.perezi基因型Ⅲ有顯著的遺傳差異(遺傳距離D=0.027), 而與寄生于蘇格蘭龍蝦和阿拉斯加雪蟹等冷水型動(dòng)物中的株系遺傳差異更大(D=0.236)。根據(jù) Small等的分類體系(Smalletal2013), 我國沿海養(yǎng)殖蟹類中的血卵渦鞭蟲可暫定為H.perezi基因型Ⅱ, 這與前人的研究結(jié)果一致(許文軍等, 2007a; Xuet al, 2010; Liet al,2013)。

然而, 目前國際上對于血卵渦鞭蟲的系統(tǒng)分類還存在一定的分歧。如前所述,H.perezi種下的三個(gè)基因型群體存在明顯的遺傳差異, 核糖體基因序列的差異高達(dá)2.7%—4.3% (Hudsonet al, 1996; Jensenet al, 2010; Smalletal, 2013), 與甲藻綱中眾多常見種之間的遺傳差異相當(dāng)(Litakeretal, 2007; Sternetal,2012)。Small等人根據(jù)宿主類型、地理分布和遺傳差異, 曾一度建議將感染美國蘭蟹的血卵渦鞭蟲定為獨(dú)立的種, 不同于來源于歐洲黃道蟹的模式種H.perezi(基因型Ⅰ), 但終因缺少形態(tài)、生活史等方面的證據(jù), 而將其定義為H.perezi種下的一個(gè)基因型(H.perezi基因型Ⅲ; Smallet al, 2012; Small, 2013)。Jesen等(2010)也發(fā)現(xiàn)感染阿拉斯加雪蟹的H.sp., 在核糖體小亞基基因的保守區(qū)核酸序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)上,與感染蘇格蘭龍蝦的類似, 而與來自溫帶地區(qū)的兩個(gè)基因型(H.perezi基因型Ⅰ和Ⅲ)存在明顯的區(qū)別,暗示著流行于這些冷水地區(qū)的血卵渦鞭蟲可能是不同于H.perezi的新種或類型。然而,Hematodinium屬和H.perezi種下的確切分類地位, 還有待于在形態(tài)學(xué)、生活史和交叉感染實(shí)驗(yàn)等方面的進(jìn)一步研究。在生活史研究方面, 僅有寄生于蘇格蘭龍蝦和美國蘭蟹中的株系完成了連續(xù)體外培養(yǎng), 也發(fā)現(xiàn)了一些生活史階段的差異(Appletonet al, 1998; Liet al, 2011)。對我國株系的研究, 以及與H.perezi另外兩個(gè)基因型(Ⅰ和Ⅲ)的對比研究, 將有助于明確這幾個(gè)基因型是否存在遺傳信息以外的差異; 另外, 交叉感染實(shí)驗(yàn)可以研究這些地理株系是否存在明顯的生殖隔離, 從而探討這些群體的遺傳差異的起因。這些研究可以為Hematodinium屬下種或基因型的界定提供一定的依據(jù)和幫助。

表3 不同群體之間的遺傳距離(D)Tab.3 The pairwise genetic distances (D) among populations from different geographic locations and hosts

我國的血卵渦鞭蟲株系可以感染多種甲殼類宿主。本研究發(fā)現(xiàn)取自各個(gè)地理群體或宿主群體的株系,遺傳相似度達(dá) 99.7%—99.9%, 遠(yuǎn)高于中國群體與美國或歐洲群體之間的相似度(分別為 97.3%、76.4%),表明我國養(yǎng)殖蟹類中的血卵渦鞭蟲群體遺傳差異較小, 屬于同一個(gè)群體。我們進(jìn)一步分析了我國血卵渦鞭蟲群體單倍型遺傳關(guān)系及發(fā)生頻率, 發(fā)現(xiàn)該群體存在一定的遺傳多態(tài)性, 總共發(fā)現(xiàn)了 14個(gè)不同的單倍型, 其中單倍型 ST041a在各個(gè)群體中都有出現(xiàn),且頻率較高。然而, 根據(jù)這些單倍型的變異順序(圖1)以及在各個(gè)群體的發(fā)生頻率(表 2), 發(fā)現(xiàn)這些單倍型的變異和分布, 沒有明顯的規(guī)律。因此, 可推斷我國沿海三地和不同宿主中的Hematodinium群體未發(fā)生明顯的遺傳隔離, 應(yīng)為同一株系、同一群體。與此類似, Pagenkopp Lohan等(2012; 2013)發(fā)現(xiàn)流行于美國東海岸蘭蟹中的Hematodinium株(即H.perezi,Genotype Ⅲ), 分布南至得克薩斯、北至麻塞諸塞州沿岸, 能夠感染寄居蟹、橈足類等其它 7種甲殼類,而且無明顯遺傳差異; 另外, 在歐洲大西洋沿岸也發(fā)現(xiàn)報(bào)道了能侵染多種宿主的Hematodinium株系(Hamiltonet al, 2010)。由此, 有學(xué)者認(rèn)為血卵渦鞭蟲是一類“泛宿主(host generalist)” 寄生性病原(Hamiltonet al, 2010; Pagenkopp Lohanet al, 2012)。另外, 國外其它地區(qū)的Hematodiniumspp.普遍流行于高鹽度水體環(huán)境中(＞18ppt; Stentifordet al, 2005),而我國發(fā)現(xiàn)的血卵渦鞭蟲株能夠在低鹽水域(＜9ppt)流行(Liet al, 2008)。我國發(fā)現(xiàn)的這類寄生性甲藻病原為何對鹽度有如此廣泛的適應(yīng)性, 以及這類病原如何規(guī)避不同種類甲殼動(dòng)物宿主的免疫機(jī)制而導(dǎo)致感染等, 都值得進(jìn)一步探討。相關(guān)科學(xué)問題的闡釋有助于針對現(xiàn)行養(yǎng)殖模式提出合理建議, 進(jìn)而避免這類“泛宿主”型流行性病原在不同種類養(yǎng)殖動(dòng)物中進(jìn)一步傳播擴(kuò)散。

圖2 基于rDNA序列構(gòu)建的Hematodinium spp.系統(tǒng)進(jìn)化樹。Fig.2 Phylogenetic analysis on Hematodinium spp. in rDNA sequence

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