仿刺參(Apostichopus japonicus)和海地瓜(Acaudina leucoprocta)體壁多肽的響應(yīng)面法酶解和N末端測(cè)序*

李妍妍 戴 娟 胡玲萍 江振洲 尚 靖 張陸勇①

(1. 國(guó)家南京新藥篩選中心 中國(guó)藥科大學(xué) 南京 210009; 2. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院 寧波 315211)

海參是棘皮動(dòng)物門(mén)、海參綱動(dòng)物的通稱, 為重要的海洋無(wú)脊椎動(dòng)物, 分布于世界各海洋中。仿刺參(Apostichopus japonicus), 又名 Stichopus japonicus,也稱刺參, 屬棘皮動(dòng)物門(mén)(Echinodermata)、海參綱(Holothuroidea)、楯手目(Aspidochirotida)、刺參科(Stichopodidae)、仿刺參屬(Apostichopus)動(dòng)物。海地瓜俗稱香參, 也稱白參、茄參、海茄子, 屬棘皮動(dòng)物門(mén)、海參綱、芋參目(Molpadida)、尻參科(Caudinidae)、海地瓜屬(Acaudina)動(dòng)物。該屬有兩個(gè)種——白肛海地瓜(Acaudina leucoprocta)和海地瓜(Acaudina molpadioides), 廣泛分布于我國(guó)東南沿海。海地瓜盛產(chǎn)于亞熱帶沙質(zhì)海區(qū), 在我國(guó)浙江、福建、廣東、海南等沿海區(qū)域均有分布, 蘊(yùn)藏量十分豐富(張鳳瀛等,1964; 侯付景等, 2010a)。

海參是海洋中重要的食物和藥物資源。含有海參多糖、海參皂苷、膠原和脂肪酸等多種生理活性物質(zhì)(崔鳳霞等, 2006; 趙芹等, 2008; 佟長(zhǎng)青等, 2013)。海參的營(yíng)養(yǎng)十分豐富, 位于海產(chǎn)品“八珍之首”, 是滋補(bǔ)強(qiáng)身的名貴佳品及防治一些疾病的良藥。清朝趙學(xué)敏編的《本草綱目拾遺》有這樣的敘述:“海參性溫補(bǔ), 足敵人參, 故名海參; 味甘咸, 補(bǔ)腎經(jīng), 益精髓,消痰延, 攝小便, 壯陽(yáng)療痿, 殺瘡蟲(chóng)”, 以及“生百脈血, 治本息痢”。臨床上先后有中醫(yī)提出以海參單用或組方治療腫瘤、再生障礙行貧血和糖尿病取得良好效果的報(bào)告, 此外在慢性腎炎、高血壓、肺結(jié)核、神經(jīng)衰弱、慢性乙型肝炎、等常見(jiàn)病治療和用于病后或產(chǎn)后康復(fù)過(guò)程中的各種藥膳中頻繁出現(xiàn)(閆冰等,2004; 邢湘臣, 2006; 肖楓等, 2006)。海參體壁是主要的食用或藥用部位。不同種類和來(lái)源的海參, 由于生活的海域、環(huán)境不同, 所攝食物各異, 其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功效存有差異, 并且為了深入研究海參的藥理活性及作用機(jī)制, 尋找針對(duì)不同種海參最適的多肽制備方法是必不可少的。相對(duì)于化學(xué)法, 酶解法獲得的產(chǎn)物活性更高, 且更為方便、易控制, 但是酶解的最適條件還未見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)選擇仿刺參和海地瓜為實(shí)驗(yàn)材料, 在單因素實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上, 利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)得到復(fù)合蛋白酶(傅玉穎等, 2009; 于平等, 2013)水解海參體壁的最優(yōu)水解條件, 水解液離心、超濾后冷凍干燥得到樣品后, 通過(guò)反相高效液相色譜(RP-HPLC)分離純化,利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF)鑒定, 再用蛋白測(cè)序儀分析氨基酸組成, 為進(jìn)一步研究這些海參的活性成分的生理功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

仿刺參取于寧波奉化博旺水產(chǎn)養(yǎng)殖公司。海地瓜取自浙江象山隅山島海域。復(fù)合蛋白酶(1.0×105U/g)購(gòu)于廣西南寧龐博生物工程有限公司。乙腈、甲醇為色譜級(jí), 均購(gòu)于寧波奧博科學(xué)儀器有限公司; 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品、衍生化試劑購(gòu)于 SIGMA公司, 三氟乙酸(TFA)、聚凝胺(Polybrene)等試劑均為市售, 分析純;玻璃纖維膜、PTFE濾膜(日本島津公司)。

Agilent1200液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技公司),Agilent 7890氣相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技公司),MALDI-TOF-Target(美國(guó)Bruker Daltonics公司), Zip TipC4(美國(guó) Millipore公司), 蛋白測(cè)序 PPSQ-31A(日本島津公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 取新鮮海參洗凈后解剖, 去除內(nèi)臟和內(nèi)壁肌肉層, 剩余體壁切成碎塊。加入一定量的水和復(fù)合蛋白酶在一定條件下進(jìn)行水解, 水解液于 95°C, 滅酶 5min, 冷卻至室溫后, 12000r/min,4°C冷凍離心10min。取部分上清液檢測(cè)相關(guān)指標(biāo),另一部分上清依次用分子量為 5kDa、1kDa的Milipore超濾膜抽濾, 濾液冷凍干燥得到凍干粉用于進(jìn)一步分析(魏廣東等, 2005; 劉程惠等, 2008;Wu et al, 2012)。

1.2.2 測(cè)定方法

(1) 氨基態(tài)氮的測(cè)定 甲醛滴定法, 稱取相同的兩份樣品溶于50mL去離子水中, 一瓶加入2滴中性紅指示劑, 用0.100 mol/L NaOH溶液滴定終點(diǎn)(由紅色變?yōu)殓晟?, 記錄堿用量 V1, 另一份加入麝香草酚酞3滴及中興甲醛20mL, 搖勻, 用0.100 mol/L NaOH溶液滴定至淡藍(lán)色, 記錄堿用量V2(魏廣東等,2005; 侯付景等, 2010b)。按下述公式計(jì)算:

氨基態(tài)氮(%) = {[N×(V2－V1)×0.014] / W}×100式中, N為標(biāo)準(zhǔn)堿液當(dāng)量濃度; W為樣品的重量(g)。

(2) 總氮的測(cè)定 凱氏定氮法(魏廣東等,2005)。水解度的計(jì)算:

DH(%) = (水解液中氨基態(tài)氮 / 樣品總氮量)×100

1.2.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì) 本實(shí)驗(yàn)使用復(fù)合蛋白酶, 在不同條件下水解海參制得水解液, 以水解度為指標(biāo)優(yōu)化水解條件。實(shí)驗(yàn)因素包括時(shí)間(60, 120, 180min)、溫度(45, 55, 65°C)和加酶量(0.5%, 1.5%, 2.5%)。采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)(王霞等, 2010; 羅紅宇等,2013; 孫靜等, 2013; 李云濤等, 2014)。

1.2.4 酶解產(chǎn)物分析

(1) RP-HPLC分離純化 取超濾分離所得的仿刺參和海地瓜的凍干粉各5mg溶于1mL蒸餾水(含0.1% TFA), 配制成5mg/mL的樣品。經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后, 進(jìn)行RP-HPLC分離純化。重復(fù)進(jìn)樣, 收集單一主要組分峰流出液, 冷凍干燥后－20°C保存,用于質(zhì)譜分析(胡文婷等, 2006)。

色譜柱: Zorbax 300SB-C18 (4.6×250mm, 5μm);流速0.8 mL/min; 進(jìn)樣量100μL; 流動(dòng)相A為水, 流動(dòng)相 B為乙腈(0.1% TFA), 洗脫梯度: 0%—50% B,32min; 50%—100% B, 2min; 100%—100% B, 3min。檢測(cè)波長(zhǎng): 280nm/254nm/214nm (Silva et al, 2007;Mant et al, 2009)。

(2) MALDI-TOF質(zhì)譜檢測(cè) 經(jīng)兩步RP-HPLC分離純化后所得單一活性峰凍干粉, 用蒸餾水(含0.1% TFA)溶解。基質(zhì)溶液為含有5mg/mLα-氰基-4-羥基肉桂酸(4-HCCA)及0.1% TFA的50%乙腈(ACN)溶液。取樣品溶液和基質(zhì)溶液各1mL混合均勻, 采用ZIP TIP C4槍頭吸取樣品10μL, 脫鹽濃縮后, 用1μL TA液(0.1% TFA的50% CAN)洗出樣品, 直接點(diǎn)在樣品靶上, 自然干燥后, 吸取 0.6μL基質(zhì)溶液覆蓋在樣品及校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品上, 室溫?fù)]干, 送入離子源中檢測(cè)(Hinke et al, 2002; Villanueva et al, 2004)。

檢測(cè)條件: N2激光器, 激光波長(zhǎng)355nm, 采用延時(shí)引出和反射的工作方式; 加速電壓 20kV, 檢測(cè)器電壓1kV, 頻率220Hz, 延遲時(shí)間190ns, 陽(yáng)離子方式檢測(cè), 圖形疊加100次單次掃描信號(hào)得到質(zhì)譜圖。

(3) 多肽 N端測(cè)序 利用混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品(PTH-AA), 建立標(biāo)準(zhǔn)氨基酸圖譜。取15μL聚凝胺加至玻璃纖維膜上, 氮?dú)獯蹈? 上機(jī)運(yùn)行5個(gè)循環(huán)。再將足量樣品點(diǎn)加到玻璃纖維膜上, 氮?dú)獯蹈?。將加好樣品的玻璃纖維膜用 PTFE濾膜封置于蛋白測(cè)序儀PPSQ-31A的反應(yīng)器里, 設(shè)定檢測(cè)氨基酸數(shù)及其它參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面法優(yōu)化

應(yīng)用響應(yīng)面設(shè)計(jì), 水解度為指標(biāo), 建立數(shù)學(xué)模型。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)考慮了溫度、時(shí)間和加酶量3個(gè)因素。采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì), 共設(shè)計(jì)15個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn), 分為析因點(diǎn)和零點(diǎn)。其中析因點(diǎn)為自變量取值在 A、B、C 所構(gòu)成的三維頂點(diǎn), 零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)(見(jiàn)表1)。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案和實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Design and experimental results of RSM (respond surface methodology)

表2 響應(yīng)面回歸方程的方差分析結(jié)果Tab.2 Analysis of variance results for response surface quadratic model

2.2 模型建立和顯著性分析

根據(jù)表2的結(jié)果, 用軟件Design Expert 8.0設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方案, 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合, 得到回歸方程:DH1(%) = 80.18 + 5.53A + 2.83B + 10.09C – 5.90AB +0.95AC – 0.13BC – 9.99A2– 7.85B2– 11.09C2DH2(%) = 63.44 – 0.78A + 0.73B + 1.95C + 0.91AB –0.97AC – 0.83BC – 5.16A2– 5.44B2– 5.14C2式中, A、B、C 均為編碼值。

據(jù)表 2對(duì)回歸線方程(沈懋文, 2010; 孫靜等,2013)進(jìn)行顯著性分析, 仿刺參水解度回歸方程的顯著性檢驗(yàn)P=0.0395 (P＜0.05), 海地瓜水解度回歸方程的顯著性檢驗(yàn)P=0.0025 (P＜0.05), 說(shuō)明這兩種海參水解度回歸模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值都非常吻合, 模型顯著; 模型失擬項(xiàng)表示模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值不擬合的概率, 仿刺參回歸方程的失擬項(xiàng)檢驗(yàn) P=4.07(P＞0.05), 海地瓜水解度回歸方程的失擬項(xiàng)檢驗(yàn)P=0.0622 (P＞0.05), 說(shuō)明兩個(gè)方程對(duì)實(shí)驗(yàn)的擬合度均較好, 因此所選的二次回歸模型有效, 可用這兩個(gè)模型分析和預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

圖1 仿刺參體壁水解條件對(duì)DH1(%)影響的響應(yīng)面圖Fig.1 3-D surface and contour plots showing the effect of hydrolysis conditions on DH1

圖2 海地瓜水解條件對(duì)DH2(%)影響的響應(yīng)面圖Fig.2 3-D surface and contour plots showing the effect of hydrolysis conditions on DH2

2.3 響應(yīng)面分析

根據(jù)三維立體圖可對(duì)任何兩個(gè)因素的交互作用及各因素對(duì)響應(yīng)值的影響進(jìn)行分析, 確定最佳因素水平。圖1的a、b、c分別表示時(shí)間和溫度、時(shí)間和加酶量、溫度和加酶量三組因素對(duì)水解度的影響。通過(guò)響應(yīng)面三維圖的等高線圖的形狀則可以直觀地反映兩因素交互作用的強(qiáng)弱, 橢圓表示交互作用顯著,越接近圓形表示兩因素交互作用越弱。

由圖 1可知, 等高線呈橢圓形, 表示溫度和時(shí)間、時(shí)間和加酶量、溫度和加酶量的交互作用均比較明顯。隨著加酶量的增加, 水解度呈先上升后下降的趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)加酶量較低時(shí)等高線排列密集, 間距較窄, 對(duì)仿刺參水解度影響較大, 反之, 影響較小。溫度和時(shí)間曲線比較平緩, 在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)對(duì)仿刺參水解度影響不明顯。

由圖2可知, 等高線呈近似圓形, 說(shuō)明各圖中的兩因素交互作用均不明顯。隨著加酶量的增加, 海地瓜水解度先上升后下降。因?yàn)槊钢挥信c底物結(jié)合, 才能起到催化作用, 當(dāng)?shù)孜镆欢〞r(shí), 加酶量增大, 底物與酶完全結(jié)合, 從而加速降解。隨著時(shí)間的增加, 海地瓜水解度出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)?？赡苁怯捎跁r(shí)間過(guò)長(zhǎng), 部分產(chǎn)物進(jìn)一步降解導(dǎo)致的。隨著溫度的升高, 水解度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)?？赡苁且?yàn)槊傅幕钚噪S溫度升高而逐漸增強(qiáng), 當(dāng)超過(guò)一定范圍內(nèi)反而使部分酶失活。

對(duì)響應(yīng)面結(jié)果利用軟件進(jìn)行優(yōu)化分析, 確定仿刺參水解的最優(yōu)條件: 時(shí)間為 136.8min, 溫度為55.7°C, 加酶量為1.97%, 響應(yīng)面預(yù)測(cè)的DH1最大值為83.41%。海地瓜水解的最優(yōu)條件: 時(shí)間為115.6min,溫度 55.4°C, 加酶量 1.70%。在此條件下, 響應(yīng)面預(yù)測(cè)的DH2最大值為63.68%。用上述優(yōu)化條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn), 得到的DH1和DH2分別為83.39%、63.69%, 與理論值基本相符。

2.4 RP-HPLC分離純化

將超濾分離后的仿刺參多肽組分S和海地瓜多肽組分 A 的凍干粉溶于蒸餾水(含 0.1% TFA)配成5mg/mL的樣品, 上 RP- HPLC分離純化。經(jīng)第一步RP-HPLC分離, 組分 S被分離成 42個(gè)組分(圖 3a, 圖3b), 組分A也被分離成42個(gè)組分(圖4c)。從色譜圖可以看出, 經(jīng)二次 RP-HPLC再次純化, 在上述色譜條件下, 仿刺參和海地瓜酶解肽段得到基線分離, 酶解肽段分離是較成功。另外從三批酶解肽段的色譜圖譜 (圖譜沒(méi)有給出), 各批間的肽譜大致相同。組分S被分離成26個(gè)組分(圖3d)和12個(gè)組分(圖3e), 組分A被分離成18個(gè)組分。重復(fù)進(jìn)樣, 合并主要單一組分峰(S1、S2、A1、A2)收集起來(lái), 冷凍干燥, 將得到的凍干樣品用于MALDI-TOF質(zhì)譜分析, 進(jìn)而對(duì)主要肽段序列進(jìn)行鑒定。

2.5 MALDI-TOF鑒定

經(jīng)二次RP-HPLC純化得到的主要單一組分(S1、S2、A1、A2)進(jìn)行 MALDI-TOF分析, 測(cè)定其相對(duì)分子質(zhì)量。各組分的質(zhì)譜圖如圖 4(僅測(cè) Mr=1000—5000)。S1峰(圖4a)主要以3126.732為主, 摻雜部分為干擾物。S2峰(圖 4b)以 1919.789、2004.802、3141.300為主, 包含其它小峰雜質(zhì), 及其斷裂氨基酸殘基后的組分。A1峰(圖 4c)含有 3個(gè)組分, 以4370.600為主; 組分2781.575易脫落精氨酸, 產(chǎn)生以2625.412為主較穩(wěn)定的物質(zhì), 組分 3035.719與3191.550可能是峰組分中殘余的雜質(zhì)。A2 峰(圖4d)有2個(gè)組分: 2632.297和2863.417, 這兩個(gè)組分在質(zhì)譜檢測(cè)中極易丟失蘇氨酸殘基, 從而產(chǎn)生較穩(wěn)定的組分2531.243與2762.374。

圖3 多肽的RP-HPLC分析圖譜Fig.3 Analytical RP-HPLC chromatogram of polypeptide

2.6 N端測(cè)序

圖4 多肽的MALDI-TOF質(zhì)譜圖Fig.4 The MALDI-TOF spectrum of polypeptide

圖5 多肽N端測(cè)序圖Fig.5 N sequencing diagram of polypeptide

經(jīng)N端序列測(cè)定仿刺參多肽S1、S2氨基酸殘基序列分別為: Gly-Pro-Val-Gly-Ala-Ser-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Ser-Ala-Leu (圖5a)和 Trp-Pro-Pro-Gly-Asn-Ser-Gly-Ile-Gln-Gly (圖 5b)。海地瓜多肽 A1和 A2氨基酸殘基序列分別為Gly-Ala-Asn-Gly-Asn (圖 5c)和 Trp-Leu-Pro-Gly-Asp-Thr-Gly-Pro-Gln-Gly-Val-Thr-Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Ala-Gly (圖 5d)。

3 討論

海參酶解得到的多肽也較為繁多且分子量較低。在色譜分析過(guò)程中部分肽段未能得到完全的分離。反相分離中樣品保留時(shí)間受其疏水性和分子量的影響,在分子量相同的情況下, 疏水性低的分子在色譜柱中的保留時(shí)間較短; 而疏水性相同的情況下, 分子量低的組分保留時(shí)間較短。膠原蛋白水解物中存在許多分子量十分接近的肽段, 其理論疏水性差異不明顯。因此利用反相色譜完全分離這些肽段存在一定難度。另外, 肽段中含有較多的甘氨酸, 導(dǎo)致不同肽段之間紫外特征吸收差異不是很顯著。因此, 在反相分離過(guò)程中利用紫外檢測(cè)肽段之間的差異受分離度影響很大。

在質(zhì)譜分析中, 不同組分的分離度對(duì)定性研究的結(jié)果影響較小, 但受單位時(shí)間掃描次數(shù)的影響, 以盡可能多地檢測(cè)同一色譜峰中的離子。在樣品分析過(guò)程中降低了液相的流速, 同時(shí)將動(dòng)態(tài)排除的次數(shù)和動(dòng)態(tài)排除時(shí)間作了調(diào)整。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明了該方法的有效性, 不同膠原蛋白的酶法降解物中含有序列完全相同的肽段, 這些肽段不能用于膠原蛋白的類型識(shí)別, 而許多特征肽段只出現(xiàn)在特定的膠原蛋白序列中。這些特征肽段可作為膠原蛋白的類型識(shí)別的依據(jù), 因此特征肽段的識(shí)別是判斷膠原蛋白類型的關(guān)鍵。本研究證明利用酶法降解膠原蛋白可得到多種特征肽段。通過(guò) RP-HPLC/MALID-TOF質(zhì)譜識(shí)別降解產(chǎn)物的特征組分進(jìn)行膠原蛋白類型檢測(cè)及多種膠原蛋白同步檢測(cè)具有可行性。在實(shí)際操作中, 可將待測(cè)樣品熱變性和酶切處理, 利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)特征肽段進(jìn)行膠原蛋白類型別。而該方法在臨床上的應(yīng)用則需要使用更多類型的膠原蛋白進(jìn)行更為深人的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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