牡蠣幼蟲(chóng)光照實(shí)驗(yàn)提示復(fù)雜遺傳背景下基因互作的多樣性*

徐彩麗 許 飛 王 嬌 武長(zhǎng)路 于文超 王曉通①

(1. 魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院 煙臺(tái) 264025; 2. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所 青島 266071)

長(zhǎng)牡蠣(Crassostrea gigas)在系統(tǒng)分類(lèi)學(xué)上屬軟體動(dòng)物門(mén)、雙殼綱、牡蠣目、牡蠣科、巨蠣屬, 味道鮮美, 營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高, 是人們喜食的海產(chǎn)佳肴, 素有“海中牛奶”之稱(chēng), 是一種適合我國(guó)沿海養(yǎng)殖的優(yōu)良品種, 經(jīng)濟(jì)效益顯著, 現(xiàn)已成為我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖品種(毛玉澤等, 2005)。很多研究表明, 葡萄牙牡蠣(Crassostrea angulata)也屬于軟體動(dòng)物門(mén)、雙殼綱、牡蠣目、牡蠣科、巨蠣屬, 是長(zhǎng)牡蠣的亞種, 在我國(guó)以長(zhǎng)江為界, 主要分布在南方沿海, 在外形和生活習(xí)性方面與長(zhǎng)牡蠣具有一定差異。

相對(duì)于品種之間, 亞種之間的遺傳背景差距更大, 但已有證據(jù)表明兩種牡蠣在自然條件下可以雜交, 且雜交后代具有正常的有絲分裂和減數(shù)分裂, 并且具有一定雜種優(yōu)勢(shì)(Soletchnik et al, 2002; Batista et al, 2007; 鄭懷平等, 2012)。光照是水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中的一項(xiàng)重要因素, 對(duì)于水產(chǎn)動(dòng)物的生理狀態(tài)具有一定影響, 曾有學(xué)者在室內(nèi)試驗(yàn)條件下研究了光照對(duì)硬殼蛤稚貝的潛砂活動(dòng)的影響, 結(jié)果顯示光照對(duì)其潛砂活動(dòng)有顯著影響, 光照強(qiáng)度的增加能提高稚貝潛砂的比例(王國(guó)棟等, 2008); 還有學(xué)者觀察到, 在有光照的情況下, 泥下蝸牛的攝食量會(huì)減少, 這與它一直生活在泥下環(huán)境的習(xí)性相一致(Magalh?es et al,2012); 但光照對(duì)于牡蠣幼蟲(chóng)生長(zhǎng)速度和成活率方面的研究還很少, 長(zhǎng)牡蠣與葡萄牙牡蠣雜交幼蟲(chóng)對(duì)不同光照梯度的反應(yīng), 還未見(jiàn)報(bào)道。另外, 在牡蠣的育苗實(shí)踐中, 大家仍未確定合適的光照強(qiáng)度, 還需要更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

本研究通過(guò)觀察比較不同光照強(qiáng)度下長(zhǎng)牡蠣幼蟲(chóng)及長(zhǎng)牡蠣與葡萄牙牡蠣雜交幼蟲(chóng)殼高和成活率的差異, 揭示光照是否對(duì)牡蠣幼蟲(chóng)早期的生長(zhǎng)成活率有影響、雜交牡蠣幼蟲(chóng)是否在這個(gè)時(shí)期是否表現(xiàn)出雜種優(yōu)勢(shì), 為牡蠣幼蟲(chóng)的培養(yǎng)和雜交育種提供有參考數(shù)據(jù)。同時(shí)由于本研究中雜交牡蠣幼蟲(chóng)的父母本遺傳背景差異較大, 而牡蠣本身的雜合度也很高, 基因互作的多樣性是否會(huì)體現(xiàn)為雜交幼蟲(chóng)表型上的多樣性,也需要進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

長(zhǎng)牡蠣采自山東乳山, 葡萄牙牡蠣采自福建莆田, 殼高均為8cm左右, 將牡蠣殼表面清洗干凈, 放在育苗池中暫養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

主要包括充氣泵、照度計(jì)、顯微鏡、水桶、光源、螺絲刀、洗瓶、燒杯、胚胎觀察皿、碘酊等。

1.3 牡蠣雌雄的鑒別

用牡蠣刀將暫養(yǎng) 3d后的牡蠣的閉殼肌割斷, 撬掉其右殼, 用消過(guò)毒的牙簽在其性腺部位扎一下, 然后將牙簽在事先準(zhǔn)備好的滴在載玻片上的一滴清水中搖晃幾下, 之后將載玻片放在顯微鏡下觀察, 辨別牡蠣的性別。

1.4 受精

分別挑選出雄性長(zhǎng)牡蠣、雌性長(zhǎng)牡蠣和雌性葡萄牙牡蠣, 用牙簽分別劃破三種牡蠣性腺表皮, 動(dòng)作要輕, 注意不要?jiǎng)澠苾?nèi)臟團(tuán), 然后用洗瓶沖洗長(zhǎng)牡蠣的精子長(zhǎng)牡蠣卵子、葡萄牙牡蠣的卵子, 并分別收集于三個(gè)水桶內(nèi), 將長(zhǎng)牡蠣的卵子和葡萄牙牡蠣的卵子中分別放入十分之一體積的精子, 使其結(jié)合受精,30min左右便可觀察受精情況, 根據(jù)觀察結(jié)果判斷是否補(bǔ)加精子或洗卵, 培養(yǎng)22h左右至受精卵發(fā)育為D型幼蟲(chóng)。

1.5 光照梯度設(shè)置與幼蟲(chóng)養(yǎng)殖

將水箱中培養(yǎng)的幼蟲(chóng)搖勻后, 用1000mL的燒杯盛取500mL含有幼蟲(chóng)的海水, 實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù), 長(zhǎng)牡蠣幼蟲(chóng)分別記為 GG1、GG2、GG3; 雜交幼蟲(chóng)分別記為GA1、GA2、GA3; 本實(shí)驗(yàn)共設(shè)置6個(gè)梯度, 分別為269、58、15、4、1.5和0 lx, 光照時(shí)間是每天早 8點(diǎn)至晚 8點(diǎn), 共 12h; 裝有長(zhǎng)牡蠣幼蟲(chóng)的燒杯分別記為 GG1-1, GG1-2, ··, GG1-6; GG2-1, GG2-2, ··,GG2-6; GG3-1, GG3-2, ··, GG3-6; 裝有雜交幼蟲(chóng)的燒 杯 分 別 記 為 GA1-1, GA1-2, ··, GA1-6; GA2-1,GA2-2, ··, GA2-6; GA3-1, GA3-2, ··, GA3-6; 將燒杯中的幼蟲(chóng)從 1日齡飼養(yǎng)到 10日齡, 每天用塑料吸管吸取1mL的小球藻喂養(yǎng), 每天喂2次, 培養(yǎng)到10日齡, 即殼頂期幼蟲(chóng)期。

1.6 測(cè)量及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

殼高的測(cè)量: 配合目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)測(cè)微尺進(jìn)行殼高的測(cè)量, 選用帶有刻度的塑料吸管吸取 1mL海水, 擠到胚胎觀察皿中, 滴加一滴碘酊以免牡蠣幼蟲(chóng)移動(dòng)而影響讀數(shù), 每個(gè)燒杯讀30個(gè)樣, 取均值。

成活率的計(jì)算: 用帶刻度的塑料吸管分別在初始燒杯內(nèi)吸取 1mL含有幼蟲(chóng)的海水, 擠到胚胎觀察皿中, 滴加一滴碘酊以免牡蠣幼蟲(chóng)移動(dòng)而影響讀數(shù),在顯微鏡下計(jì)算幼蟲(chóng)個(gè)數(shù), 測(cè)三次取平均值, 然后再乘上燒杯中液體的體積, 即是燒杯中幼蟲(chóng)的初始總個(gè)數(shù); 到第10天時(shí), 按照同樣的方法計(jì)算出第10天每個(gè)燒杯中幼蟲(chóng)的個(gè)數(shù), 第 10天燒杯中幼蟲(chóng)的總個(gè)數(shù)與燒杯中幼蟲(chóng)的初始總個(gè)數(shù)的比值即為成活率;取樣之前, 用塑料吸管多次吹打燒杯中的海水, 從而保證幼蟲(chóng)分布均勻。

1.7 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

使用 SAS軟件的單因素最小二乘分析(GLM)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 利用R軟件的heatmap和pca程序?qū)Ω骷蚁颠M(jìn)行聚類(lèi)分析和主成分分析并制圖。

2 結(jié)果

2.1 長(zhǎng)牡蠣及雜交各家系幼蟲(chóng)在不同光照強(qiáng)度下的生長(zhǎng)與成活情況

不同光照強(qiáng)度對(duì)長(zhǎng)牡蠣和雜交牡蠣各家系的影響見(jiàn)表1和表2, 通過(guò)SAS軟件的單因素最小二乘分析, 發(fā)現(xiàn)是長(zhǎng)牡蠣各家系還是雜交牡蠣各家系, 各個(gè)光照梯度下第 10天的殼高均沒(méi)有顯著差異(P＞0.05),而長(zhǎng)牡蠣幼蟲(chóng)和雜交牡蠣幼蟲(chóng)均58 lx的光照強(qiáng)度下,表現(xiàn)出最高的成活率(卡方檢驗(yàn), P＜0.05)。

2.2 不同光照強(qiáng)度對(duì)長(zhǎng)牡蠣及雜交牡蠣各家系幼蟲(chóng)生長(zhǎng)成活率影響的比較

將長(zhǎng)牡蠣幼蟲(chóng)和雜交牡蠣幼蟲(chóng)在不同光照梯度下的殼高和成活率分別進(jìn)行比較, 如圖1和圖2所示,長(zhǎng)牡蠣幼蟲(chóng)和雜交牡蠣幼蟲(chóng)在各個(gè)光照梯度下的殼高均沒(méi)有顯著差異(P＜0.05), 但雜交牡蠣幼蟲(chóng)的成活率在269 lx和58 lx兩個(gè)光照梯度下均極顯著的高于長(zhǎng)牡蠣幼蟲(chóng)(P＜0.01)。

表1 不同光照強(qiáng)度對(duì)長(zhǎng)牡蠣生長(zhǎng)和成活率的影響Tab.1 The shell height and survival rate of the Pacific oyster larvae under different illuminance levels

表2 不同光照強(qiáng)度對(duì)雜交牡蠣生長(zhǎng)和成活率的影響Tab.2 The shell height and survival rate of the hybrid larvae from Pacific oyster and Portuguese oyster under different illuminance levels

圖1 不同光照強(qiáng)度對(duì)長(zhǎng)牡蠣及雜交牡蠣各家系幼蟲(chóng)生長(zhǎng)速度影響的比較Fig.1 Comparison of the shell height between the Pacific oyster and the hybrid larvae from Pacific oyster and Portuguese oyster under different illuminance levels

圖2 不同光照強(qiáng)度對(duì)長(zhǎng)牡蠣及雜交牡蠣各家系幼蟲(chóng)成活率影響的比較Fig.2 Comparison of the survival rate between the Pacific oyster and the hybrid larvae from Pacific oyster and Portuguese oyster under different illuminance levels

2.3 幼蟲(chóng)殼高與成活率相關(guān)性分析

為了驗(yàn)證是否因?yàn)轲D料不足而造成殼高與成活率之間負(fù)相關(guān), 我們將長(zhǎng)牡蠣與雜交牡蠣的殼高與成活率合并在一起, 進(jìn)行了相關(guān)性分析。如圖3所示,R2=0.08遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于 1, 表明殼高與成活率之間沒(méi)有相關(guān)性, 殼高與成活率這兩個(gè)指標(biāo)各自獨(dú)立, 不會(huì)對(duì)本文的分析結(jié)果造成不良影響。

圖3 幼蟲(chóng)殼高與成活率相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis of the shell height and the survival rate in all larvae

2.4 不同光照強(qiáng)度對(duì)同一母本的長(zhǎng)牡蠣幼蟲(chóng)和雜交幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育影響的比較

根據(jù)不同光照梯度下的殼高和成活率共12個(gè)指標(biāo), 對(duì)長(zhǎng)牡蠣幼蟲(chóng) 3個(gè)家系(GG1、GG2、GG3)和雜交牡蠣幼蟲(chóng) 3個(gè)家系(GA1、GA2、GA3)進(jìn)行聚類(lèi)分析和主成分分析, 其中GG1與GA1家系來(lái)源于同一個(gè)雌牡蠣, GG2與 GA2家系來(lái)源于同一個(gè)雌牡蠣,GG3與GA3家系來(lái)源于同一個(gè)雌牡蠣。如聚類(lèi)結(jié)果圖4所示, 長(zhǎng)牡蠣家系聚在一個(gè)大支上, 而雜交牡蠣家系GA1、GA2、GA3不能聚在一起, GA3位于長(zhǎng)牡蠣家系的大支上, 而GA2、GA3分別位于不同的大支,且相隔距離較遠(yuǎn)。為了更形象地展示各個(gè)家系之間的差異, 作者又進(jìn)行了主成分分析, 如圖 5所示, 長(zhǎng)牡蠣幼蟲(chóng) 3個(gè)家系(GG1、GG2、GG3)非常清晰的聚在一起, 相互之間間距不大, 而雜交牡蠣幼蟲(chóng)3個(gè)家系(GA1、GA2、GA3)很明顯的分在三個(gè)方向, 相互之間間距都很大, 有意思的是, GG1與 GA1之間的距離、GG2與GA2之間的距離、GG3與GA3之間的距離都比較小, 這應(yīng)該是因?yàn)槟副臼峭恢荒迪牭脑颉?/p>

圖4 不同光照強(qiáng)度對(duì)長(zhǎng)牡蠣及雜交牡蠣各家系幼蟲(chóng)生長(zhǎng)成活率影響的聚類(lèi)分析Fig.4 Cluster analysis of the shell height and the survival rate of the Pacific oyster and the hybrid larvae from Pacific oyster and Portuguese oyster under different illuminance levels

圖5 不同光照強(qiáng)度對(duì)長(zhǎng)牡蠣及雜交牡蠣各家系幼蟲(chóng)生長(zhǎng)成活率影響的主成分分析Fig.5 Principal component analysis of the shell height and the survival rate of the Pacific oyster and the hybrid larvae from Pacific oyster and Portuguese oyster under different illuminance levels

3 討論

光照是水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中的一項(xiàng)重要因素, 光照強(qiáng)度對(duì)水生動(dòng)物生長(zhǎng)、發(fā)育及成活率的影響光照強(qiáng)度對(duì)水生動(dòng)物生長(zhǎng)的影響因種而異, 既能促進(jìn)也能抑制(周顯青等, 1999, 2000)。北極紅點(diǎn)鮭(Satvetinus alpinus)幼體在50 lx時(shí)生長(zhǎng)最快, 死亡率較低, 高于或低于此值的光照強(qiáng)度都會(huì)使生長(zhǎng)速度減慢(Minagawa, 1994)。在本實(shí)驗(yàn)當(dāng)中也有類(lèi)似結(jié)果, 作者發(fā)現(xiàn)光照在0—269 lx范圍內(nèi)變化對(duì)牡蠣幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響, 但長(zhǎng)牡蠣幼蟲(chóng)和雜交牡蠣幼蟲(chóng)均在58 lx的光照強(qiáng)度下, 表現(xiàn)出最高的成活率, 說(shuō)明在牡蠣育苗的前10天如果保持這樣的光照強(qiáng)度則對(duì)生產(chǎn)有利, 長(zhǎng)牡蠣幼蟲(chóng)和雜交牡蠣幼蟲(chóng)的這種相似性,也支持葡萄牙牡蠣與長(zhǎng)牡蠣是一個(gè)物種的觀點(diǎn)(Wang et al, 2010; 林清等, 2014)。而雜交牡蠣幼蟲(chóng)在269 lx和58 lx兩個(gè)光照梯度下的成活率均極顯著的高于長(zhǎng)牡蠣幼蟲(chóng), 提示雜交牡蠣幼蟲(chóng)在這兩個(gè)光照強(qiáng)度下表現(xiàn)出了雜種優(yōu)勢(shì), 或許是因?yàn)殚L(zhǎng)牡蠣與葡萄牙牡蠣的遺傳背景具有較大差異但還沒(méi)有產(chǎn)生生殖隔離,正好符合雜種優(yōu)勢(shì)產(chǎn)生的遺傳條件(胡建廣等, 1999;林建麗等, 2009)。

以不同光照梯度下殼高和成活率作為指標(biāo)進(jìn)行聚類(lèi)分析和主成分分析后發(fā)現(xiàn), 雜交牡蠣幼蟲(chóng)具有靠近各自同母本長(zhǎng)牡蠣幼蟲(chóng)的趨勢(shì), 說(shuō)明同一母本遺傳背景在性狀表現(xiàn)上啟到了一定作用。但更有意思的是, 長(zhǎng)牡蠣幼蟲(chóng)各家系間的表型比較接近, 而雜交牡蠣幼蟲(chóng)各家系之間差異非常大, 如果僅僅考慮基因序列的相似度, 3個(gè)雜交牡蠣幼蟲(chóng)的表型應(yīng)該比較接近, 也應(yīng)該聚在一起, 但事實(shí)是雜交幼蟲(chóng)表型的差異非常大, 作者推測(cè)是基因互作在雜交牡蠣的表型分化上發(fā)揮了重要作用, 牡蠣基因組的高雜合性(Zhang et al, 2012)使得長(zhǎng)牡蠣和葡萄牙牡蠣各自?xún)?chǔ)備了豐富的等位基因, 同時(shí)由于地理分布上的隔離,長(zhǎng)牡蠣和葡萄牙儲(chǔ)備的等位基因并不相同, 當(dāng)兩者雜交時(shí), 兩個(gè)亞種的不同基因座位的不同等位基因進(jìn)入到了同一個(gè)個(gè)體中, 從而發(fā)生了亞種內(nèi)很難發(fā)生的基因互作, 由于等位基因很豐富, 因此互作組合的類(lèi)型也很多, 從而導(dǎo)致了表型的多樣性。曾有學(xué)者發(fā)現(xiàn)雜交種在雜合狀態(tài)下能夠激發(fā)某種機(jī)制, 表達(dá)出與父母本均不同的新的基因產(chǎn)物, 調(diào)控相關(guān)的各種生理生化反應(yīng), 從而表現(xiàn)出雜種優(yōu)勢(shì)(王章奎等,2003; Baranwal et al, 2012; Fujimoto et al, 2012;Meyer et al, 2012), 本研究的發(fā)現(xiàn)也可以這樣來(lái)解釋,只是雜種優(yōu)勢(shì)的方向可能是多樣化的。當(dāng)然, 該推測(cè)還需更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù), 比如, 可以測(cè)定各組幼蟲(chóng)的轉(zhuǎn)錄組, 觀察其對(duì)光照的反應(yīng)模式是否與基因表達(dá)模式一致, 這是在今后研究中需要考慮的問(wèn)題。

4 結(jié)論

根據(jù)長(zhǎng)牡蠣及同母本雜交牡蠣幼蟲(chóng)對(duì)光照的不同反應(yīng), 作者認(rèn)為, 58 lx的光照強(qiáng)度對(duì)前10天的牡蠣育苗生產(chǎn)有利; 葡萄牙牡蠣與長(zhǎng)牡蠣的雜交是可行的, 在幼蟲(chóng)階段就已經(jīng)表現(xiàn)出了雜種優(yōu)勢(shì); 具有高雜合度基因組并且遺傳背景差異較大群體雜交一代表型的巨大差異可能由于基因互作組合多樣化而引起。

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