張棟棟,付亞杰,陳小蕓,魯永婷,范 維,郭鈺珍
(1.蘭州大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科學(xué)專業(yè) 730000;2.山東省桓臺縣人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科256400;3.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院婦科 730000;4.山東省淄博市婦幼保健院 255000)
異甘草素 (isoliquiritigenin,ISL)是一種黃酮類化合物,是甘草中重要的活性成分之一,具有多種藥理活性,諸如抗腫瘤、抗病毒、抗自由基、松弛血管、抑制脂質(zhì)過氧化等。其中抗腫瘤作用是近年來的研究熱點[1-3]。研究證明ISL對多種腫瘤細胞具有明顯的體外抑制作用,但對卵巢癌細胞的影響尚未見報道。本試驗初步觀察ISL對人卵巢癌細胞株SKOV3增殖的影響,探討其可能的抗腫瘤的作用機制,為ISL的臨床應(yīng)用提供試驗依據(jù)。
1.1 材料 人卵巢癌細胞株SKOV3由蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院惠贈;ISL為天津馬克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品[高效液相色譜法(HPLC)≥98%,批號:GC-20120203];胎牛血清購自杭州四季青公司;DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司;二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑藍(MTT)購自Sigma公司;Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購于南京凱基;兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體、兔抗人Bax抗體、兔抗人Bcl-2抗體、兔抗人Beclin1抗體、兔抗人LC3抗體均購自美國Cell Signaling Technology(CST)公司,HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自美國Santa Cruz公司。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液在37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),胰酶消化傳代,取對數(shù)生長期的細胞用于試驗。
1.2.2 MTT法檢測細胞生長情況 取對數(shù)生長期的SKOV3細胞,以1×104個/孔加入96孔板,待細胞過夜貼壁后,試驗組分別加入不同濃度的ISL,使其終濃度分別為5、10、20 μg/mL,陰性對照組加入0.01%的DMSO,空白對照組加入等體積的DMEM培養(yǎng)液,每組設(shè)5個復(fù)孔,于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)6、12、24、48h后,每孔加入20μL濃度為5 mg/mL的 MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4h,棄上清液,然后每孔再加入150μL DMSO,振蕩3min,使結(jié)晶溶解,用酶標(biāo)儀于490nm處檢測吸光度A值,以A490nm值的大小反映活細胞的多少。細胞抑制率=(1-試驗組A值/空白對照組A值)×100%。試驗重復(fù)3次,取平均值。
1.2.3 形態(tài)學(xué)觀察 倒置光學(xué)顯微鏡觀察不同濃度ISL(0、5、10、20μg/mL)作用48h后,SKOV3形態(tài)學(xué)變化。吖啶橙/溴化乙錠雙熒光染色后,再次觀察細胞形態(tài)學(xué)變化,并拍照。
1.2.4 Annexin V FITC/PI雙染色檢測細胞凋亡率 收集不同濃度ISL(0、5、10、20μg/mL)作用48h后的細胞,用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化,收集細胞,1 500r/min離心5min,棄上清液,PBS洗2遍(1 500r/min離心5min)。500 μL緩沖液重懸細胞,加入5μL Annexin V FITC和5μL PI,混勻后避光孵育5min,1h內(nèi)上流式細胞儀(FCM)檢測細胞凋亡率。
1.2.5 Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax及自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3的表達變化 取對數(shù)生長期的SKOV3細胞,以1×105個/孔接種于6孔板,24h細胞貼壁后換液,加入不同濃度的ISL,使其終濃度分別為0、5、10、20μg/mL,繼續(xù)培養(yǎng)48h,棄上清液,PBS清洗3遍,用干凈濾紙吸凈PBS,RIPA(含cocktail)裂解液冰上裂解細胞提取蛋白,蛋白質(zhì)定量試劑盒BCA法蛋白定量,蛋白變性,十二烷基酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),轉(zhuǎn)膜到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。轉(zhuǎn)膜成功后,50g/L脫脂奶封閉2h,分別加入一抗Bcl-2、Bax、GAPDH、Beclin1、LC3[均為兔抗原,50g/L 牛血清清蛋白(BSA)1∶1 000稀釋],4℃條件下孵育過夜,洗膜,二抗(1∶5 000稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔)孵育1h,洗膜,滴加ECL超敏化學(xué)發(fā)光劑,暗盒曝光顯影,采用ImageJ軟件進行定量分析。
1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,計量數(shù)據(jù)用±s表示,采用t檢驗,檢驗水準α=0.05,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 形態(tài)學(xué)觀察 各加藥組細胞經(jīng)ISL分別作用6、12、24、48h后,光鏡下均可見細胞皺縮變圓,體積縮小,細胞質(zhì)內(nèi)可見較多顆粒、空泡,胞核不清,細胞脫壁浮起并出現(xiàn)片狀無細胞生長區(qū)??瞻讓φ战M細胞則貼壁生長,幾乎無脫落,細胞完整,胞質(zhì)飽滿,胞核清晰圓潤,相鄰細胞生長融合成片,可見核分裂相。48hISL 20μg/mL組,吖啶橙/溴化乙啶雙染后在熒光顯微鏡下觀察,空白對照組活細胞,核染色質(zhì)著綠色并呈正常結(jié)構(gòu);早期凋亡細胞,核染色質(zhì)著綠色呈固縮狀或圓珠狀;晚期凋亡細胞,核染色質(zhì)為橘紅色并呈固縮狀或圓珠狀,如圖1所示。
圖1 吖啶橙/溴化乙啶雙染后觀察SKOV3細胞的形態(tài)改變(×200)
2.2 ISL對人卵巢癌SKOV3細胞體外增殖的抑制作用 5、10、20μg/mL的ISL對人卵巢癌SKOV3細胞均有明顯抑制作用,且隨著ISL濃度的增加和培養(yǎng)時間的延長,抑制作用明顯增強。20μg/mL的ISL作用48h,對細胞的抑制率可達68.07%,見表1。陰性對照組和空白對照組的A490nm值差異無統(tǒng)計學(xué)意義,提示0.01%DMSO對SKOV3細胞無抑制作用。
表1 ISL對人卵巢癌SKOV3細胞增殖的抑制作用(±s,n=3)
表1 ISL對人卵巢癌SKOV3細胞增殖的抑制作用(±s,n=3)
a:P<0.05,與ISL 0μg/mL組比較。
抑制率(%)組別6h 12h 24h 48h ISL 0μg/mL組0.27±1.16-0.68±1.52 1.16±2.06 1.59±1.31 ISL 5μg/mL組 5.32±3.93a7.19±3.86a12.32±4.99a28.48±5.07a ISL 10μg/mL組 6.77±3.52a18.42±4.37a28.01±5.04a47.95±6.31a ISL 20μg/mL組 19.37±4.28a24.92±5.06a37.56±5.86a68.07±6.17a
2.3 Annexin V FITC/PI雙標(biāo)染色流式細胞儀分析ISL對SKOV3細胞凋亡的影響 Annexin V FITC/PI雙標(biāo)染色,流式細胞儀檢測不同濃度ISL作用于SKOV3細胞48h后凋亡率變化,結(jié)果顯示ISL(5、10、20μg/mL)作用于SKOV3細胞48h后,凋亡率明顯高于ISL 0μg/mL組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且隨ISL濃度增加細胞凋亡率明顯增高。
2.4 Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax及自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3的表達變化 ISL作用于SKOV3細胞48h后,提取蛋白,Western blot檢測Bcl-2、Bax及Beclin1、LC3的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ISL處理細胞后,隨著濃度的增加,Bax、Beclin1、LC3的表達增加,Bcl-2的表達下降,ISL 5、10、20μg/mL組分別與0μg/mL組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖2。
圖2 ISL作用于SKOV3細胞株后Bax、Bcl-2、LC3、Beclin1蛋白水平變化
卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一。在美國,上皮性卵巢癌是婦科腫瘤中病死率最高的惡性腫瘤,每年大約有22 000例新發(fā)病例和16 000例死亡病例[4-6]。我國發(fā)病患者數(shù)逐年遞增。由于卵巢位于盆腔深部,早期癥狀不明顯,同時缺乏可靠的篩選方法,大多數(shù)患者在就診時已到了晚期,治愈率很低[4-6]。目前對于卵巢癌主要的處理方法是外科手術(shù),輔以鉑類藥物為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療。盡管臨床常用化療藥物抗腫瘤的作用比較明確,但存在著不良反應(yīng)大,長期應(yīng)用產(chǎn)生耐藥性等缺點。很多病例多因鉑類化療藥耐藥性的產(chǎn)生而導(dǎo)致治療失敗、癌癥復(fù)發(fā),故5年生存率僅30%~45%[4]。因此,尋找新的療效好、不良反應(yīng)小的化療藥物成為近年的研究熱點。而中藥因為具有不良反應(yīng)小、不易產(chǎn)生耐藥等優(yōu)點受到人們的關(guān)注,其中黃酮類化合物的抗腫瘤作用成為近年的研究熱點。國內(nèi)外研究表明,黃酮類化合物能抑制多種腫瘤細胞的增殖。ISL作為一種黃酮類化合物,具有多種藥理活性,其中抗腫瘤作用備受關(guān)注。本試驗研究發(fā)現(xiàn),ISL可使SKOV3細胞增殖受到明顯抑制,具有明顯的量效和時效關(guān)系。同時ISL可使SKOV3細胞凋亡率增加,隨著藥物濃度增高,細胞凋亡率增加更為顯著。形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果也顯示細胞發(fā)生凋亡改變,提示凋亡可能是ISL抑制人卵巢癌SKOV3細胞增殖的作用機制之一。
關(guān)于凋亡機制的研究,可以通過檢測死亡受體通路的相關(guān)蛋白或基因(如:Fas)的表達[7],也可以通過檢測線粒體凋亡途徑的相關(guān)蛋白或基因(如:Bcl-2、Bax)的表達,亦可以檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路的相關(guān)基因或蛋白的表達,以進一步明確其促凋亡的機制[8-9]。本研究分析ISL處理后對常見的促凋亡基因Bax和抑制凋亡基因Bcl-2蛋白水平的影響,發(fā)現(xiàn)其可上調(diào)Bax的蛋白水平,降低Bcl-2的蛋白水平,表明ISL可激活SKOV3細胞的死亡受體途徑。本研究結(jié)果顯示ISL可以促進SKOV3的自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3的表達,隨著藥物濃度的增加,其表達量呈上升趨勢,同時SKOV3的凋亡率也增加。提示ISL可以促進SKOV3自噬活性,從而使其凋亡。自噬現(xiàn)象最初被認為是細胞的另外一種凋亡方式,目前研究表明,自噬可以維持細胞新陳代謝,但是當(dāng)自噬過度活躍時則會促進細胞發(fā)生自噬性凋亡[10-11]。凋亡和自噬都可以誘發(fā)細胞的程序性死亡,但是二者的關(guān)系仍不明確,但二者在某些情況下可以相互拮抗或促進[12]。自噬對腫瘤細胞的作用不盡相同[13-14]。
動物實驗表明,ISL具有毒性低、不良反應(yīng)小的特點[3],為臨床治人卵巢癌提供了更廣闊的思路,有著更卓越的臨床應(yīng)用價值。本試驗為今后進一步研究ISL的抑瘤機制和探索開發(fā)人卵巢癌新的藥物治療提供了初步的試驗依據(jù)。
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