膽管Cajal間質(zhì)細(xì)胞與藥物性肝內(nèi)膽汁淤積的相關(guān)性研究＊

蔡 佳，章述軍，秦 波

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科 400016）

藥物性肝內(nèi)膽汁淤積是臨床最常見(jiàn)膽汁淤積的原因之一。Cajal間質(zhì)細(xì)胞 （interstitial cells of Cajal，ICC）是胃腸道的起搏細(xì)胞，它產(chǎn)生和傳導(dǎo)慢波引起平滑肌自發(fā)節(jié)律性收縮，在調(diào)節(jié)胃腸道蠕動(dòng)方面起著重要作用[1]。同時(shí)大量研究證實(shí)ICC也存在于胃腸道以外的器官如膽道系統(tǒng)中[2]。大黃素（emodin）是中藥大黃的主要有效成分，具有多種藥理作用。有實(shí)驗(yàn)表明大黃素具有保肝、降黃疸作用[3]，同時(shí)大黃素也能顯著增加結(jié)腸ICC的數(shù)量從而發(fā)揮其調(diào)節(jié)腸道蠕動(dòng)和導(dǎo)瀉的作用。已有研究證實(shí)：膽囊存在Cajal樣細(xì)胞，它在調(diào)節(jié)膽道運(yùn)動(dòng)方面具有重要的作用。膽道系統(tǒng)中ICC是否也能調(diào)節(jié)膽道的蠕動(dòng)，在膽汁淤積中起重要作用，目前尚不清楚。近來(lái)研究表明ICC能特異性表達(dá)c-kit受體，并且c-kit信號(hào)途徑對(duì)于ICC的發(fā)生、發(fā)育具有重要作用，持續(xù)的c-kit信號(hào)刺激ICC形成和維持所必須的條件，c-kit敲除可導(dǎo)致ICC缺失，c-kit陽(yáng)性是ICC的主要鑒定標(biāo)準(zhǔn)之一。本研究試圖通過(guò)膽汁淤積模型及大黃素干預(yù)模型中膽管內(nèi)c-kit陽(yáng)性ICC數(shù)量變化及其對(duì)肝功能生化指標(biāo)的影響，探求大黃素對(duì)肝內(nèi)膽汁淤積的治療作用與膽管ICC數(shù)量的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用雄性SD大鼠，體質(zhì)量200g，共15只，采用簡(jiǎn)單隨機(jī)法均分為3組，即對(duì)照組、藥物性肝內(nèi)膽汁淤積模型組（模型組）及大黃素干預(yù)組（大黃素組）。

1.2 模型建立及標(biāo)本采集

1.2.1 藥物性肝內(nèi)膽汁淤積模型及大黃素干預(yù)模型建立 參照蔣峻華等[4]的方法建立模型組，將異硫氰酸萘酯（α-naphthyl isothiocyanate，ANIT）用橄欖油配制成20g／L，大黃素用5g／L羧甲基纖維素鈉配制成4g／L的混懸液備用。將4%ANIT，予大鼠灌胃，首劑為15mg／100g，24h后再予5mg／100g。48h后，SD大鼠肝內(nèi)膽汁淤積型肝炎的模型建成，在病理學(xué)上與臨床上的藥物誘導(dǎo)的肝內(nèi)膽汁淤積型肝炎相似。對(duì)照組則予等容量的生理鹽水灌胃。造模4～6h后大黃素組按20mg·kg-1·d-1劑量給予大黃素灌胃，均為1次／天，連續(xù)治療7d，第7天給藥后4h，分離血清并留取肝臟標(biāo)本[5]。對(duì)照組則仍給予等體積等滲鹽水灌胃。對(duì)照組、模型組及大黃素組均在7d后取標(biāo)本。造模結(jié)束后光鏡下觀察可見(jiàn)：肝細(xì)胞內(nèi)見(jiàn)膽色素沉積，毛細(xì)膽管內(nèi)膽汁淤積，匯管區(qū)較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。肝功能生化指標(biāo)可見(jiàn)：血清丙氨酸基轉(zhuǎn)移酶（alanine transaminase，ALT）、堿性磷酸酶 （alkaline phosphatase，ALP）、總膽紅素（direct bilirubin，TBIL）、γ-谷 氨 酰 轉(zhuǎn) 肽 酶 （γ-glutamyl transpeptidaser，γ-GT）顯著高于對(duì)照組，證明肝內(nèi)膽汁淤積型模型造模成功。

1.2.2 標(biāo)本采集 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用水合氯醛（250mg／kg）腹腔麻醉后開(kāi)腹，然后抽取心臟血及摘眼球取血，留取相應(yīng)肝組織塊，分別以10%福爾馬林及2%戊二醛液浸泡固定，血標(biāo)本抗凝、離心后取上清液保存。肝組織固定，石蠟包埋，常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察病理變化。

1.2.3 生化指標(biāo)檢測(cè) 用日立7600生化自動(dòng)檢測(cè)儀檢測(cè)，移液器將0.5mL血清移入加樣管中，系統(tǒng)自動(dòng)取樣分析，獲取血清標(biāo)本檢測(cè) ALT、ALP、D-Bil、γ-GT水平。

1.3 膽管ICC免疫組織化學(xué)及反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）法

1.3.1 免疫組織化學(xué)鑒定膽道ICC分布 動(dòng)物禁食6h后，頸椎脫臼處死。剖腹立即取膽總管及部分肝內(nèi)膽管，PBS（pH＝7.4）沖凈腸內(nèi)容物，行冰凍切片，厚7μm。切片用丙酮（4℃）固定10min，PBS洗5min×3次。免疫組織化學(xué)步驟參照SABC免疫組織化學(xué)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。其中ACK2抗體（5mg／L）于4℃孵育過(guò)夜，免疫反應(yīng)產(chǎn)物顯示為棕黃色。免疫組織化學(xué)結(jié)果判定：c-kit陽(yáng)性染色為棕黃色，定位于肌層，表現(xiàn)為以胞體為中心的向相反方向延伸的2個(gè)或2個(gè)以上長(zhǎng)突起，常常與鄰近的ICC突起相互連接構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)[6]。采用MetaMorph／DP10／BX41顯微圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果，以積分光密度（integral optical density，IOD）代表蛋白顆粒密度。

1.3.2 膽管總mRNA提取及RT-PCR 動(dòng)物禁食6h后，頸椎脫臼處死。取膽總管及肝內(nèi)膽管，PBS漂洗干凈。用總RNA抽提試劑Trizol提取總核糖核酸（RNA），再應(yīng)用Dynbeads dT（25）從所提取的總RNA中提取出總信使核糖核酸（mRNA），其后逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA）。c-kit的擴(kuò)增條件為：94 ℃，5min；94 ℃，15s；50 ℃，60s；72 ℃，60s 40個(gè)循環(huán)，最后72℃，8min。c-kit上游引物序列：5′-GTA CAT AGA AAG AGA CGT GAC TCC T-3′，下游引物序列：5′-GAG TTG ACC CTC ACG GAA TGG TCC A-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為548bp。β-actin上游引物序列5′-GGC TAC AGC TTC ACC ACC AC-3′，下游引物序列：5′-TAC TCC TGC TTG CTG ATC CAC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為285bp。擴(kuò)增產(chǎn)物（3μL）在12%瓊脂糖凝膠中電泳分離，溴化乙錠染色觀察DNA條帶。

1.3.3 結(jié)果分析 使用德國(guó)Labimage圖像分析系統(tǒng)對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行量化分析，計(jì)算各個(gè)組別的c-kit／β-actin的比值作為mRNA表達(dá)的相對(duì)定量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用±s表示，并用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 藥物性肝內(nèi)膽汁淤積模型建立 模型組 ALT、TBIL、ALP和γ-GT水平較對(duì)照組相比明顯升高（F＝34.88，P＜0.05；F＝51.86，P＜0.05；F＝27.25，P＜0.05；F＝28.08，P＜0.05），大黃素組上述指標(biāo)水平較對(duì)照組也有明顯升高，但比模型組低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝34.88，P＜0.05；F＝51.86，P＜0.05；F＝27.25，P＜0.05；F＝28.08，P＜0.05），見(jiàn)表1。

病理組織觀察：光鏡下，對(duì)照組：肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞形態(tài)正常。無(wú)變性壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維組織增生等改變。模型組：肝細(xì)胞內(nèi)見(jiàn)膽色素沉積，中央靜脈淤血，可見(jiàn)肝細(xì)胞大量混濁腫脹、空泡變性，灶性壞死，匯管區(qū)較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及膽管上皮細(xì)胞增生。表明實(shí)驗(yàn)大鼠服用ANIT后，成功構(gòu)建肝內(nèi)膽汁淤積型肝炎模型。

表1 不同組別肝功能相關(guān)生化指標(biāo)比較（±s，n＝5）

表1 不同組別肝功能相關(guān)生化指標(biāo)比較（±s，n＝5）

a：P＜0.05，與對(duì)照組比較；b：P＜0.05，與模型組比較。

組別 ALT（U／L） TBIL（μmol／L） ALP（U／L） γ-GT（U／L 8.7±1.1 54.1±13.5 312.2±73.3 2.2±0.6模型組 398.2±87.4a465.0±90.7a 680.1±82.6a7.2±1.3a大黃素組 280.5±97.2ab 323.0±65.5ab 412.0±87.4ab 4.4±1.1）對(duì)照組ab

圖1 不同組別膽管c-kit mRNA表達(dá)

圖2 不同組別膽管c-kit mRNA表達(dá)對(duì)比分析圖

2.2 RT-PCR法檢測(cè)c-kit mRNA的表達(dá)水平 結(jié)果顯示，對(duì)照組、模型組及大黃素組位于548bp處的條帶均有表達(dá)（圖1）。3組c-kit mRNA表達(dá)的相對(duì)量分別為0.98±0.195，0.47±0.064，0.86±0.120（圖2）。β-actin mRNA的擴(kuò)增片段為285bp。模型組c-kit mRNA表達(dá)量明顯低于大黃素組及對(duì)照組（P＜0.05）。大黃素組低于對(duì)照組，但組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

2.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠膽管中c-kit蛋白的表達(dá)水平 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示c-kit主要在肌層表達(dá)，呈棕黃色，表現(xiàn)為以胞體為中心的向相反方向延伸的2個(gè)或2個(gè)以上長(zhǎng)突起，常常與鄰近的ICC突起相互連接構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)[6]。對(duì)照組、模型組、大黃素組c-kit免疫組織化學(xué)表達(dá)量IOD比較c-kit表達(dá)量分別為34.2±12.86、10.5±2.32、28.7±9.86，模型組明顯低于對(duì)照組及大黃素組（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 大鼠膽管c-kit免疫組織化學(xué)結(jié)果（×200）

3 討 論

藥物性肝內(nèi)膽汁淤積的發(fā)病率較高，其病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，臨床療效不理想[7]。本實(shí)驗(yàn)試圖通過(guò)藥物性膽汁淤積模型闡明藥物性肝內(nèi)膽汁淤積與膽管ICC的關(guān)系及大黃素改善肝內(nèi)膽汁淤積的機(jī)制。

ICC是胃腸道的起搏細(xì)胞，它產(chǎn)生和傳導(dǎo)慢波引起平滑肌自發(fā)節(jié)律性收縮，在調(diào)節(jié)胃腸道蠕動(dòng)方面起著重要作用[8]。同時(shí)，ICC在膽囊、膽囊管、肝內(nèi)膽管、膽總管和十二指腸等多處存在，并參與調(diào)控膽管的自主節(jié)律性運(yùn)動(dòng)[9]，而膽道梗阻動(dòng)物模型中膽囊ICC形態(tài)、結(jié)構(gòu)與對(duì)照組相比有明顯異常[10]，因此本研究推測(cè)膽道ICC在調(diào)節(jié)膽道運(yùn)動(dòng)及肝內(nèi)膽汁淤積中可能發(fā)揮重要作用。近來(lái)研究表明ICC能特異性表達(dá)c-kit受體，持續(xù)的c-kit信號(hào)刺激是小鼠胃腸道ICC形成和維持的必須要素[11]，因此本研究選擇c-kit為切入點(diǎn)。本研究結(jié)果提示：模型組膽管ICC特異性c-kit mRNA及其蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯減少，提示藥物性膽汁淤積與膽管ICC減少有關(guān)。由此推測(cè)膽道系統(tǒng)內(nèi)的ICC在肝內(nèi)外膽道的運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)及膽汁淤積形成中可能發(fā)揮重要作用。

大黃素為蒽醌類衍生物，是中藥大黃的主要有效單體，具有多種藥理作用[12-13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示大黃素能明顯改善藥物性肝內(nèi)膽汁淤積大鼠血清中ALT、ALP、TBIL及γ-GT水平，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。已有研究證實(shí)：大黃素在一定濃度范圍內(nèi)能顯著增加結(jié)腸ICC的數(shù)量，在一定程度上明顯促進(jìn)腸道的蠕動(dòng)[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：大黃素能明顯改善模型組相關(guān)生化指標(biāo)及膽汁淤積程度，同時(shí)大黃素干預(yù)后膽管c-kit表達(dá)量較對(duì)照組明顯下降，但其明顯高于模型組，提示大黃素作用后膽管內(nèi)c-kit陽(yáng)性ICC量較模型組明顯增多。因此，本研究推測(cè)，膽管ICC與肝內(nèi)膽汁淤積有一定關(guān)系，膽管ICC減少可能與肝內(nèi)膽汁淤積形成有關(guān)。同時(shí)，大黃素可能通過(guò)促進(jìn)膽管ICC數(shù)量相對(duì)增多或其對(duì)膽管ICC的保護(hù)作用而發(fā)揮其改善肝內(nèi)膽汁淤積的作用。

關(guān)于大黃素對(duì)膽管ICC影響的作用機(jī)制方面，目前研究比較多的是干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF）／c-kit信號(hào)途徑，該通路在ICC的生長(zhǎng)發(fā)育中起重要作用。SCF能劑量依賴性地促進(jìn)ICC的發(fā)育，并且在維持其表型中起重要作用。一旦去除SCF，則ICC會(huì)明顯減少[15-16]。因此，大黃素對(duì)于膽管ICC的影響，可能就是通過(guò)SCF／c-kit途徑及其下游通路，對(duì)肝內(nèi)膽汁淤積起治療作用。該信號(hào)通路是本研究下一步的主要研究方向。

綜上所述，膽管ICC與藥物性肝內(nèi)膽汁淤積形成過(guò)程可能存在密切關(guān)系，膽管ICC可能成為肝內(nèi)膽汁淤積藥物治療的新靶點(diǎn)。為進(jìn)一步證實(shí)本研究的設(shè)想，目前本實(shí)驗(yàn)組正進(jìn)行c-kit阻斷及ICC缺失動(dòng)物模型及相應(yīng)膽汁淤積模型膽管ICC數(shù)量的研究，以期進(jìn)一步闡明肝內(nèi)膽汁淤積與ICC的關(guān)系。

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