玻璃體腔注射神經(jīng)生長因子安全性研究及視網(wǎng)膜組織分布＊

劉丹寧，樊繼山，陰正勤

（1.重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院眼科 400010；2.重慶醫(yī)科大學兒童醫(yī)院藥學部 400014；3.第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院眼科，重慶400038）

從小鼠頜下腺提取的肌內(nèi)注射劑型鼠神經(jīng)生長因子（mNGF）是國家的Ⅰ類新藥，臨床上已將其應用于包括視神經(jīng)損傷在內(nèi)的神經(jīng)損傷修復，并有望用于眼底疾病特別是視網(wǎng)膜色素變性（RP）的治療研究[1-3]，而藥物能否在靶組織達到有效藥物濃度是治療的關鍵，由于其肌內(nèi)注射的給藥方式限制了達到眼部的藥物濃度，必要的眼部濃度維持需要全身給予大劑量藥物，增加了發(fā)生不良反應的風險[4-5]。因此，采用眼局部用藥如玻璃體腔注射可能成為mNGF治療RP的方法[6]。但全身應用的肌內(nèi)注射型藥物mNGF玻璃體腔注射后眼內(nèi)的安全性如何，玻璃體腔注射mNGF后，藥物能否迅速聚集于視網(wǎng)膜等問題，目前尚不清楚，極大地限制了mNGF治療RP的應用前景。因此本研究觀察了臨床劑型mNGF（即小鼠頜下腺提取的肌內(nèi)注射劑型mNGF）兔眼玻璃體腔注射的安全性，并在此基礎上，觀察了該濃度mNGF視網(wǎng)膜組織藥物分布情況，為其后期臨床研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 成年健康灰兔，雌雄不限，200～300kg，第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，動物飼養(yǎng)及實驗操作在第三軍醫(yī)大學實驗動物中心進行。

1.1.2 實驗材料 mNGF（北京舒泰神藥業(yè)有限公司，純度為98%，國藥準字S20060023 30μg／瓶），NGF 2.5S凍干粉（以色列Alomone labs，行125I標記用藥），125I（第三軍醫(yī)大學核醫(yī)學實驗室提供），復方托吡卡胺滴眼液（日本參天制藥株式會社），0.4%奧布卡因滴眼液（日本參天制藥株式會社），其他均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及實驗設計 （1）兔眼玻璃體腔注射mNGF安全性評估的動物分組：取成年健康灰兔6只，分2組，每組3只6眼，NGF組：玻璃體腔注射30μg／100μL mNGF，對照組：玻璃體腔注射0.9%生理鹽水100μL。于玻璃體腔注藥后1、7、30d分別行行為學觀察，裂隙燈觀察角膜清亮度、前房清亮程度、晶體透明度，眼B超檢查玻璃體清亮程度，直接眼底鏡觀察眼底視網(wǎng)膜情況，并于30d時處死動物，取眼球行冰凍切片蘇木精-伊紅（HE）染色；（2）兔眼局部注射NGF后眼內(nèi)藥物分布的動物分組：取成年健康灰兔27只，玻璃體腔注射30μg／100μL125I-NGF。于注藥后15、30min，1、3、6、8、12、24、48h處死動物，分別取眼內(nèi)容物房水、玻璃體，眼球內(nèi)壁組織虹膜睫狀體、視網(wǎng)膜、脈絡膜，眼球外壁組織角膜、鞏膜進行125I-NGF的檢測，每個時間點3只動物6眼。觀察視網(wǎng)膜藥物峰濃度及達峰時間。

1.2.2125I-NGF的標記、鑒定和檢測125I-NGF的標記、鑒定：采用氯胺T法進行125I-NGF的標記（由第三軍醫(yī)大學核醫(yī)學實驗室協(xié)助）[7]。標記物鑒定結(jié)果：標記率為50，放化純度：95%，比活度為2.294×1015Bq／kg，放射性活度為1.154×107Bq。藥物配制比例為8∶100；125I-NGF的檢測：液體取100 μL，固體稱質(zhì)量，置于稱質(zhì)量后的放射免疫管中，于γ-計數(shù)器上進行計數(shù)，以各組織各時間點125I-NGF的百分劑量率（%ID／g＝樣本γ-計數(shù)／標準液γ-計數(shù)／樣本重量×100%）代表組織中NGF的含量。

1.2.3 玻璃體腔注射mNGF方法 玻璃體腔注射：稱質(zhì)量后，5%水合氯醛溶液8mL／kg腹腔注射麻醉，復方托吡卡胺滴眼液滴眼散瞳，0.4%奧布卡因滴眼液進行表面麻醉，于上方角鞏膜緣處透明角膜區(qū)隧道穿刺抽出房水約50μL，于上方角鞏膜緣后3mm隧道穿刺垂直鞏膜進針，刺入玻璃體腔，經(jīng)散大的瞳孔明確針尖在玻璃體腔后，緩慢注入藥液100μL，棉簽按壓進針處，抽出針頭，觀察眼壓及眼部血管充盈情況，給予氯霉素滴眼液點眼預防感染。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用±s表示，采用獨立樣本t檢驗，檢驗水準α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 兔眼玻璃體腔注射mNGF后眼部安全性評估

2.1.1 行為學觀察 玻璃體腔注射后第1天兩組動物均不喜睜眼，第2天好轉(zhuǎn)，無抓撓眼部情況。注射前后觀察兔覓食正常、活動靈活、體質(zhì)量增加，未發(fā)現(xiàn)任何異常行為及癥狀。

圖1 玻璃體腔注射125I-NGF后裂隙燈檢查眼前節(jié)情況（×16）

圖2 玻璃體腔注射125I-NGF后眼底檢查結(jié)果

圖3 兩組動物玻璃體腔注射后眼部B超檢查結(jié)果

2.1.2 眼前節(jié)檢查 各組行玻璃體注射后1、7、30d，裂隙燈檢查角膜均清亮透明，前房清亮，晶體透明，玻璃體透明，未見明顯炎性反應，見圖1。

2.1.3 眼底檢查 視網(wǎng)膜未見出血，滲出，水腫，視網(wǎng)膜血管走行正常，視乳頭無出血水腫，顏色正常，見圖2。

2.1.4 眼部B超檢查 兩組動物行玻璃體注射后1、7、30d玻璃體腔未見明顯炎性混濁，視網(wǎng)膜未見脫離等并發(fā)癥，見圖3。

2.1.5 HE染色組織病理學檢查 術后30d治療兔眼視網(wǎng)膜HE染色觀察各層組織形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊，無炎性細胞浸潤等異常表現(xiàn)，見圖4。

圖4 兩組動物玻璃體腔注射30d時視網(wǎng)膜HE染色結(jié)果

圖5 玻璃體腔注射125I-NGF后兔眼視網(wǎng)膜組織藥物含量變化趨勢

2.2 玻璃體腔注射125I-NGF后視網(wǎng)膜組織藥物含量變化趨勢 眼局部注射125I-NGF后48h內(nèi)，視網(wǎng)膜藥物濃度趨勢呈正態(tài)曲線分布。其達峰值時間為3h，峰值可達（118.32±18.74）%ID／g，見圖5。

圖6 玻璃體腔注射后兔眼各組織中125I-NGF含量峰值（%ID／g）

圖7 玻璃體腔注射后30min兔眼各組織中125I-NGF含量（%ID／g）

2.3 玻璃體腔注射后眼內(nèi)組織藥物濃度峰值以視網(wǎng)膜為最高 玻璃體腔注射后眼部各組織藥物峰值如圖6所示，除玻璃體內(nèi)因直接注射125I-NGF而導致很高藥物濃度外，視網(wǎng)膜組織所獲得藥物含量為最高，能夠保證眼視網(wǎng)膜獲得治療作用的藥物濃度。兔眼各組織中125I-NGF達峰時間：房水、角膜、鞏膜、虹膜睫狀體、脈絡膜、視網(wǎng)膜各為3、6、6、3、3、3h，可以看出視網(wǎng)膜達峰時間也較快，并在注射后30min內(nèi)即可達到遠高于其他眼內(nèi)組織的濃度，見圖7。

3 討 論

目前臨床上應用的mNGF主要通過肌內(nèi)注射的方式給藥，而改變給藥途徑，通過眼玻璃體腔注射，在不增加給藥總量的基礎上提高視網(wǎng)膜獲取的藥物濃度，可能成為治療RP的有效方法，為了證實其可行性，本實驗在動物體內(nèi)觀察了玻璃體腔注射的使用安全性及注射后藥物能否在靶組織視網(wǎng)膜聚集，為下一步的有效性研究及臨床試驗提供參考數(shù)據(jù)。

本研究首先觀察了mNGF經(jīng)玻璃體腔注射后兔眼內(nèi)各組織可能存在的損傷情況，確定其使用安全性，在臨床使用的肌內(nèi)注射劑型mNGF中，目前能夠獲得的最大使用濃度為30 μg／100μL。因此，本研究采用此濃度來進行臨床前眼內(nèi)組織安全性檢測。藥物對眼的損傷可分為直接接觸和藥物全身性吸收所引起的兩大類[8]，前者取決于藥物的性質(zhì)、劑量、使用時間等，是實驗觀察的重點，由于本藥是國家批準的一類新藥，故未再對后者進行觀察。研究發(fā)現(xiàn)，注射后整個實驗階段的30d內(nèi)，動物行為學上未見抓眼、流淚、分泌物增多等異常舉動和反應，表明眼局部注射藥物未對兔眼部造成明顯的刺激。眼是由一系列透光及感光組織組成的視覺器官，如果藥物造成眼部組織損傷，往往會呈現(xiàn)出透光度和感光度的改變，如角膜染色沉著、刺激性炎癥，晶體渾濁，視網(wǎng)膜化學物質(zhì)，以及色素沉著、水腫、出血、滲出，甚至視乳頭水腫等形態(tài)學改變[8]。為了深入了解眼內(nèi)各組織在注射藥物后的反應，本研究通過裂隙燈、眼底鏡、眼部B超等方法觀察了角膜、前房、晶體、玻璃體及視網(wǎng)膜等眼內(nèi)結(jié)構(gòu)的整體情況，全面監(jiān)測藥物對眼內(nèi)組織可能造成的任何損傷，結(jié)果顯示，玻璃體腔注射mNGF后，角膜透明，前房清亮，晶體透明，玻璃體透明，視網(wǎng)膜顏色正常，未見視網(wǎng)膜脫離、出血、滲出及視乳頭水腫等異?，F(xiàn)象。這表明30μg／100μL肌內(nèi)注射型mNGF經(jīng)玻璃體腔注射使用后，未造成眼部組織的藥物性損傷。此外，為了進一步確定藥物對視網(wǎng)膜的組織層次是否存在影響，本研究通過冰凍切片HE染色對視網(wǎng)膜各層組織進行病理學觀察，結(jié)果顯示，視網(wǎng)膜各層組織結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊，無炎癥細胞浸潤等異常病理改變。上述結(jié)果表明，玻璃體腔注射濃度為30μg／100μL的mNGF是安全的。

眼局部給藥的目的是希望藥物能夠在眼內(nèi)靶組織中達到理想的藥物濃度，玻璃體腔注射是否能成為有效治療RP的方法，關鍵在于藥物能否迅速到達視網(wǎng)膜組織并獲得較高的藥物濃度。因此本研究進一步檢測了玻璃體腔注射125I-NGF后視網(wǎng)膜組織藥物含量及分布趨勢。結(jié)果發(fā)現(xiàn)玻璃體腔注射125INGF后，視網(wǎng)膜在注射后30min內(nèi)即可獲得遠高于眼內(nèi)其他各組織的藥物濃度，并迅速在3h內(nèi)達峰值，而且視網(wǎng)膜所獲得的藥物濃度峰值在眼內(nèi)各組織中是最高的，這說明玻璃體腔注射NGF能夠在視網(wǎng)膜組織快速聚集，相比肌內(nèi)注射是一種更理想的眼部給藥方法。這可能與其注射后的彌散路徑及NGF藥物性質(zhì)有關。本研究發(fā)現(xiàn)玻璃體腔注射125I-NGF 30 min后，藥物已經(jīng)開始向房水及眼球內(nèi)壁組織彌散，并且在各組織藥物達峰值時的分布趨勢由大到小為視網(wǎng)膜，脈絡膜，虹膜睫狀體，鞏膜，角膜，房水，表明125I-NGF主要通過眼后節(jié)路徑即視網(wǎng)膜-脈絡膜-鞏膜路徑進行彌散，相比前節(jié)的房水、角膜等組織來說，位于眼后節(jié)的視網(wǎng)膜更容易獲得較多的藥物滲入[9-11]。此外，NGF為水溶性藥物，存在于眼周血管與視網(wǎng)膜之間的血視網(wǎng)膜屏障，阻止水溶性藥物彌散出眼外，將藥物局限在視網(wǎng)膜組織中，延長了藥物在眼內(nèi)壁停留的時間[12-14]。其次，玻璃體腔注射125I-NGF后藥物直達兔眼，而視網(wǎng)膜與玻璃體緊密相接，水溶性的125I-NGF可直接透過玻璃體向視網(wǎng)膜彌散，因而能在視網(wǎng)膜獲得高水平125I-NGF含量[14-15]。

綜上所述，玻璃體腔注射濃度為30μg／100μL的mNGF未對眼內(nèi)組織造成損傷，且玻璃體強注射mNGF方法能夠迅速在視網(wǎng)膜組織中達到較高的藥物濃度，是mNGF治療RP可行的眼局部治療方法。

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