抗Ⅰ型鴨肝炎病毒RdRp蛋白噬菌體單鏈抗體庫構(gòu)建及單鏈抗體的淘選

王永娟，李碧春，沈明君，洪偉鳴，左偉勇*

(1.揚(yáng)州大學(xué) 動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點實驗室，江蘇泰州 225300)

鴨病毒性肝炎主要由1 型鴨肝炎病毒(Duck hepatitis virus type 1，DHV-1)引起。目前其防制以疫苗免疫為主，但由于病毒株的變異大大降低了免疫效果，因此亟待開展防制新方法的研究。DHV-1 全基因組序列于2006 年首次報道[1]，Tseng 等測定的DHV-1 全基因組序列約為7 690 nt 的單股正鏈RNA，編碼2 249 個氨基酸，編碼蛋白的順序為5'-UTR-VP0-VP3-VP1-2A1-2A2-2A3-2B-2C-3A-3B-3C-3D-3'[2]。3D 蛋白是RNA 依賴的RNA 聚合酶(RdRp)，它能夠特異地識別病毒RNA，參與選擇RNA 模板和RNA 合成的起始位點、維持RNA 合成的延伸、協(xié)調(diào)RNA 合成步驟和調(diào)控病毒變異進(jìn)化，對于RNA 的復(fù)制至關(guān)重要[3]。

單鏈抗體即單鏈抗體可變區(qū)片段(Single-chain antibody variable fragment，ScFv)是由抗體重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)通過一段10～25 個氨基酸的連接肽(Linker)連接而成的抗原特異性結(jié)合的最小功能結(jié)構(gòu)單位[4]。由于scFv 具有易于構(gòu)建和表達(dá)、分子質(zhì)量小、穿透力強(qiáng)、特異性好、免疫原性低的優(yōu)點[5]，是目前報道最多的一種基因工程抗體，在抑制病毒復(fù)制(如HIV-1)、腫瘤基因治療、基因敲除、藥物殘留檢測等方面得到了廣泛應(yīng)用[6-9]。本研究構(gòu)建了抗DHV-1 RdRp 蛋白的scFv 基因文庫，并淘選獲得特異性結(jié)合RdRp 的scFv，對于鴨病毒性肝炎防制新策略研究具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料 DHV-1 SH 株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所惠贈；pET-32a 載體、大腸桿菌(E.coli)BL21(DE3)和DH5α 均由江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點實驗室保存；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase、Taq DNA 聚合酶、1 kb DNA Ladder、Ex-Taq MasterMix 和RNase Inhibitor 購自Fermentas 公司；Wizard DNA Clean-up System 購自Promega 公司；pCANTAB5E、M13K07、E.coli TG1、HB2151 和TRIzol 試劑購自Invitrogen 公司；HRP 標(biāo)記的抗M13 抗體購自GE Healthcare 公司、抗E-tag 的單克隆抗體(MAb)購自Abcam 公司；6 周齡ICR 小鼠購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。

1.2 引物及Linker設(shè)計 根據(jù)GenBank 中登錄的DHV-1 SH 株基因序列(HQ265433)設(shè)計擴(kuò)增RdRp 核苷酸序列(3D)的特異性引物。引物序列為3DF：5'-GGAAGATCTATGGGGAAAGTAGTGAGTAAG C-3'(Bgl Ⅱ)/3DR：5'-CGGTCGACGATCATCATGCA AGCTGTGTATG-3'(SalⅠ)。

參照文獻(xiàn)[10]設(shè)計鼠源抗體重鏈及輕鏈可變區(qū)的擴(kuò)增引物，連接肽Linker 采用文獻(xiàn)[11]介紹的(Gly4Ser)3形式，兩端根據(jù)重鏈及輕鏈的序列分別添加互補(bǔ)序列。所有序列均由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.3 DHV-ⅠRdRp的克隆及表達(dá) 按照TRIzol 說明書提取含DHV-1 的雞胚總RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，以其為模板，擴(kuò)增RdRp 基因，膠回收后經(jīng)BglⅡ/SalⅠ雙酶切，克隆于pET-32a 中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-RdRp。將pET-RdRp 轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)，重組菌經(jīng)1 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，超聲裂解，收獲上清液和沉淀分別于12 % SDS-PAGE膠中檢測分析。

1 M KCL 染色SDS-PAGE 電泳后的重組蛋白，切下明顯的乳白色蛋白條帶，使用凝膠成像系統(tǒng)的定量軟件對其進(jìn)行定量，液氮法碾磨碎至1 mL 注射器針頭可以吸出為止，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 動物免疫及脾臟總RNA提取 按每只小鼠100 μg 的劑量頸背部皮下注射6 周齡ICR 小鼠，免疫程序為每2 周一次，3 免后采血分離血清，測定抗體效價；加強(qiáng)免疫后3 d 采集其脾臟，按TRIzol說明書方法提取0.1 g 脾臟總RNA，取少量用紫外分光光度儀測定其純度和濃度。

1.5 全長sc Fv基因的制備 參考文獻(xiàn)[9]方法，利用隨機(jī)引物將提取的RNA(>1 μg)反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，再以VH基因上下游引物(VH-B/VH-F)和VL基因上下游引物(VL-B/VL-F1、2、3、4)擴(kuò)增全套VH基因和VL基因，通過重疊延伸PCR(SOE-PCR)擴(kuò)增Linker-VL片段，并進(jìn)一步擴(kuò)增VH-Linker-VL片段(即全長scFv 編碼序列)。

1.6 sc Fv庫的構(gòu)建及鑒定 采用SfiⅠ/NotⅠ雙酶切全長scFv 基因并克隆于pCANTAB5E 載體中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)TG1，取100 μL 轉(zhuǎn)化菌涂布2×YT-GA 平板，37 ℃過夜培養(yǎng)，計算單菌落數(shù)，推算庫容；隨機(jī)挑取12 個單菌落，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。

其余轉(zhuǎn)化菌加入1 mL 2×YT-G，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600nm為0.8，加入終濃度1010pfu/mL M13K07輔助噬菌體，繼續(xù)培養(yǎng)30 min 后加終濃度100 μg/mL的氨芐青霉素，繼續(xù)培養(yǎng)1 h 后離心棄上清液，將沉淀重懸于100 mL 2×YT-AK 培養(yǎng)基，振蕩過夜后，4 ℃高速離心，收集上清液，加入1/5 體積的PEG/NaCl 溶液，冰浴1 h 后4 ℃高速離心棄上清液，2×YT 重懸沉淀，得到單鏈?zhǔn)删w抗體初級庫，用于單鏈?zhǔn)删w抗體庫的富集篩選。

1.7 噬菌體滴度測定 將上述噬菌體液10-6～10-10稀釋，分別取100 μL 加入OD600nm值為1 的500 μL TG1 菌液中，37 ℃水浴靜置30 min，加入4 mL 2×YT 半固體培養(yǎng)基，混勻后立即轉(zhuǎn)入2×YT 固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)過夜，根據(jù)空斑數(shù)(pfu)計算噬菌體滴度。

1.8 scFv的富集淘選 參考文獻(xiàn)[12]方法，選擇微孔板法借助抗原抗體特異性結(jié)合及噬菌體侵染擴(kuò)增進(jìn)行富集篩選：將所得初級噬菌體抗體庫加入至純化的RdRp 原核表達(dá)產(chǎn)物包被的96 孔板中，37 ℃水浴靜置1 h，PBS 洗滌，加入500 μL 100 mmol/L Gly-HCL 洗脫，10 min 后加入50 μL 1 mol/L Tris(pH8.5)，收集上清液，0.22 μm 濾器過濾除菌，加入9 倍體積的對數(shù)生長期TG1，培養(yǎng)后取10 μL 涂布2×YT-GA 平板，37 ℃過夜培養(yǎng)，計算單菌落數(shù)，推算庫容；其余的再次加入M13KO7 輔助噬菌體感染，構(gòu)建單鏈二級噬菌體抗體庫。重復(fù)上述富集程序4 次。

1.9 ScFv的初步鑒定 從上述第4 輪富集篩選的后涂布的平板上隨機(jī)挑取20 個單菌落，制備噬菌體ScFv。以純化的RdRp 原核表達(dá)產(chǎn)物為檢測抗原，HRP 標(biāo)記的抗M13 抗體(1∶2 000)為二抗，間接ELISA 法檢測所制備的ScFv。同時設(shè)陰性對照(pET-32a 的原核表達(dá)產(chǎn)物)和空白對照(PBS)(n=3)，檢測OD450nm值，將P/N>2.1 并且P>0.2(P=陽性值-陰性值，N=陰性值-空白值)的檢測孔判為陽性scFv。

1.10 Sc Fv的可溶性表達(dá)及檢測 按照上述方法制備陽性scFv 對應(yīng)的噬菌體，按1∶100 比例接種至新鮮制備的HB2151 感受態(tài)，37 ℃緩慢震蕩30 min 后高速振蕩過夜；再按1∶100 比例加入2×YT-AG 培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)1 h 后離心棄上清液；沉淀加入等量2×YT-AI 培養(yǎng)基，30 ℃振蕩培養(yǎng)4 h 后離心棄上清液，沉淀加入500 μL PBS-EDTA(1 mmol/L EDTA)，冰浴30 min 后沸水浴5 min，高速離心收集上清液，即為可溶性表達(dá)的ScFv。

以抗E-tag 的MAb(1:4 000)為二抗，按照上述ELISA 方法檢測可溶性表達(dá)的ScFv。

2 結(jié)果

2.1 DHV-1 RdRp基因擴(kuò)增及克隆鑒定 以從DHV-1 感染的雞胚中提取總RNA 為模板進(jìn)行RTPCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示擴(kuò)增得到與預(yù)期大小相符的片段，約為1.4 kb(圖1)。

將純化回收的RdRp 基因克隆于pET-32a 構(gòu)建pET-RdRp，pET-RdRp 經(jīng)Kpn Ⅰ/Not Ⅰ雙酶切鑒定(圖略)后進(jìn)行序列測定。結(jié)果表明，RdRp 基因序列與DHV-1 SH 株(HQ265433)的同源性為100 %。

圖1 DHV-1 RdRp 基因的RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 Amplification of DHV-1 RdRp gene by RT-PCR

2.2 免疫原鑒定、制備及免疫效價測定 含pETRdRp 的重組菌在不同培養(yǎng)溫度、不同誘導(dǎo)劑濃度培養(yǎng)后，最終選取37 ℃、1 mmol/L IPTG、誘導(dǎo)4 h為最佳誘導(dǎo)條件。誘導(dǎo)產(chǎn)物經(jīng)超聲裂解進(jìn)行SDSPAGE 分析，結(jié)果顯示，與空載體相比，在68 ku 處出現(xiàn)了預(yù)期大小的重組蛋白，并以包涵體形式存在(圖略)。分離免疫后的小鼠血清，間接ELISA 法測定的RdRp 抗體效價達(dá)1∶16 000。

2.3 VL、VH基因擴(kuò)增及全長sc Fv基因的制備 以提取的免疫鼠脾臟總RNA 制備的cDNA 為模板，首先采用PCR 擴(kuò)增獲VL/VH編碼序列，再通過SOE-PCR 經(jīng)Linker 編碼序列擴(kuò)增全長scFv 基因，電泳檢測結(jié)果顯示：VL基因約為320 bp，VH基因約為340 bp，全長scFv 基因約為750 bp，均與預(yù)期大小相符(圖2)。測序結(jié)果表明所得序列具有正確的表達(dá)閱讀框，為VH-Linker-VL結(jié)構(gòu)。

圖2 VL、VH和scFv PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 Amplifications of the scFv gene by SOE-PCR

2.4 scFv文庫的構(gòu)建及鑒定 將純化回收后的scFv 編碼序列克隆于pCANTAB5E 載體中，隨機(jī)挑取12 個單菌落，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)Hin d Ⅲ/NotⅠ雙酶切鑒定，均可獲得約0.8 kb 和4.5 kb 的片段(圖3)，表明scFv 片段正確插入pCANTAB5E 噬粒載體。根據(jù)轉(zhuǎn)化平板上生長的菌落數(shù)，估算庫容為2.9×106。

圖3 富集前重組噬菌粒的雙酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant phagemid before enrichment

2.5 scFv的富集淘選及初步鑒定 通過微孔板法對噬菌體scFv 庫共進(jìn)行了4 輪“親和吸附-洗脫-擴(kuò)增”的富集淘選，對每一輪的抗體庫進(jìn)行噬菌體滴度測定，結(jié)果顯示，富集后的抗體庫滴度比初級抗體庫提高了約223 倍(表1)，表明特異性重組噬菌體得到了有效的富集。

隨機(jī)挑取第4 輪富集篩選后的所涂平板上的20個單菌落，制備噬菌體scFv，以抗M13 抗體為二抗，ELISA 測定抗體與特異性抗原的結(jié)合情況。取3 組數(shù)據(jù)平均值，結(jié)果顯示，參照P/N>2.1 并且P>0.2 的標(biāo)準(zhǔn)，可初步確定A1、A3、A5、A6、A7、A8、B2、B3、B4、B7 這10 株為重組ScFv(表2)。

表1 噬菌體抗體庫的免疫親和富集效果Table 1 Enrichment of phage display library

表2 ScFv 的ELISA 篩選結(jié)果Table 2 Screening the ScFv by ELISA

2.6 Sc Fv的可溶性表達(dá)及檢測 將篩選到的10 株陽性scFv 在HB2151 中進(jìn)行可溶性表達(dá)，以抗E-tag MAb 為二抗，ELISA 測定抗體與特異性抗原的結(jié)合情況。參照上述標(biāo)準(zhǔn)，取三組數(shù)據(jù)平均值，結(jié)果顯示，A1、A3、A5、A7、A8、B4、B7 這7 株ScFv得到了可溶性表達(dá)，有較好的抗原結(jié)合活性(表3)。

表3 ScFv 的可溶性表達(dá)檢測結(jié)果Table 3 Detection of the ScFv expressed in a soluble form

3 討論

本研究在制備的具有免疫原性的RdRp 蛋白基礎(chǔ)上，采用噬菌體展示技術(shù)，構(gòu)建了DHV-1 RdRp的ScFv 文庫；借助抗原抗體特異結(jié)合淘選、ELISA檢測鑒定，獲得了7 株具有良好抗原結(jié)合活性的scFv。這一DHV-1 RdRp 特異ScFv 的制備，在國內(nèi)外屬首次，為鴨病毒性肝炎防制新策略研究奠定了基礎(chǔ)。

獲得特異性好，親和力高的抗體是建立免疫學(xué)檢測方法和免疫治療的前提。傳統(tǒng)的MAb 雖然具有高特異性，但其篩選的技術(shù)條件較為嚴(yán)苛，工作量較大。ScFv 作為第3 代基因工程抗體，相對于MAb，具有結(jié)合位點特異、分子量小、免疫原性低以及易于篩選等優(yōu)勢，在醫(yī)學(xué)診斷和治療方面已得到廣泛應(yīng)用[6-9]。而在動物疫病防制方面，目前僅有新城疫scFv 的報道[13]。

連接肽Linker 的設(shè)計在scFv 的制備中至關(guān)重要，既不能對抗原結(jié)合部位造成阻礙，不能干擾VH和VL的空間構(gòu)象，也不引起分子動力學(xué)改變并且盡可能減少蛋白酶降解及防止ScFv 聚集[14]，本研究選用了目前最廣泛應(yīng)用的(Gly4Ser)3序列。scFv 的取向方面，之前研究表明VH-linker-VL比VL-linker-VH的親和力高10 倍以上，而VL-linker-VH比VH-linker-VL的表達(dá)量高20 倍[15]，我們選取了親和力比較好的VH-linker-VL方式。對噬菌體ScFv 的淘篩方法，主要有微孔板法、免疫管富集篩選法及抗原生物素標(biāo)記法，本實驗采用了簡單易行的微孔板法，經(jīng)過4 輪富集篩選，得到了高滴度的特異性ScFv，這一結(jié)果進(jìn)一步證明了我們所選擇的鏈接肽、鏈接方式及淘選方法的確實有效性。

建立的噬菌體抗體庫，將基因型和表現(xiàn)型統(tǒng)一于同一噬菌體顆粒中，既能夠特異性識別抗原，又能感染宿主進(jìn)行再擴(kuò)增，實現(xiàn)了淘選與富集的同步，在不經(jīng)雜交瘤途徑的情況下實現(xiàn)對抗體的直接篩選[7]，是目前最廣泛的ScFv 制備方法。ScFv 的編碼基因可以借助于分子生物學(xué)方法得以串聯(lián)表達(dá)，從而避開MAb 目標(biāo)單一的缺點，可為建立特異、高效抗體為基礎(chǔ)的疾病防制方法開辟新思路。

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