利奈唑胺對(duì)人血小板細(xì)胞的凋亡作用研究

王天琳，郭代紅，柴 棟，張 波，王 睿（.解放軍總醫(yī)院藥品保障中心，北京 0085；.沈陽(yáng)藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 006；.解放軍總醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，北京 0085）

利奈唑胺對(duì)人血小板細(xì)胞的凋亡作用研究

王天琳1，郭代紅1，柴 棟1，張 波2，王 睿3
（1.解放軍總醫(yī)院藥品保障中心，北京 100853；2.沈陽(yáng)藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016；3.解放軍總醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，北京 100853）

[摘要]目的：研究利奈唑胺對(duì)人血小板的凋亡作用。方法：用兩步離心法制備人富血小板血漿并純化血小板，用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)乳酸脫氫酶（LDH）評(píng)價(jià)血小板損傷程度，用Annexin V法檢測(cè)磷酯酰絲氨酸外翻，用比色法檢測(cè)Caspase-3活性。結(jié)果：與空白對(duì)照組相比，利奈唑胺劑給藥4 h可劑量依賴性引起磷酯酰絲氨酸外翻增加，Caspase-3活性增加。150 μg·mL-1利奈唑胺給藥4 h可引起血小板LDH釋放增加。結(jié)論：利奈唑胺可引起人血小板凋亡。

[關(guān)鍵詞]利奈唑胺；血小板；凋亡；乳酸脫氫酶；Caspase-3

Effect of linezolid on the apoptosis of human platelet in vitro

WANG Tian-lin1, GUO Dai-hong1, CHAI Dong1, ZHANG Bo2, WANG Rui3
(1. Department of Pharmaceutical Care, PLA General Hospital, Beijing 100853, China; 2. School of Life Sciences and Biopharmaceutics, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China; 3. Translational Medical Center, PLA General Hospital, Beijing 100853, China)

[ABSTRACT] Objective: To study the effect of linezolid on the apoptosis of human platelet. Methods: Two-step centrifugation was used for platelet enrichment and purification. LDH concentration in the supernatant was determined by ELISA, phosphatidylserine (PS) exposure by Annexin V-binding, and the activation of Caspase-3 by colorimetry. Results: Four hours exposure to linezolid triggered Annexin V-binding, activated Caspase-3 in dose dependent manner. Linezolid 150 μg·mL-1·4 h-1can stimulate the release of LDH. Conclusion: Linezolid can induce the apoptosis of human platelet.

[KEY WORDS] Linezolid; Platelet; Apoptosis; Lactic dehydrogenase; Caspase-3

利奈唑胺（linezolid）是第一個(gè)應(yīng)用于臨床的新型唑烷酮類抗生素[1]。其抗革蘭陽(yáng)性球菌活性優(yōu)越，作為治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）和耐萬(wàn)古霉素糞腸球菌（VRE）感染的首選藥物[2]，利奈唑胺引起血小板減少的報(bào)道逐漸增多，嚴(yán)重限制其使用效能并影響患者預(yù)后[3]。近年來(lái)，多種藥物引起的血小板減少被報(bào)道與引起血小板凋亡有關(guān)，控制血小板凋亡有可能成為預(yù)防和治療血小板減少癥的新途徑?；诖?，本文嘗試考察不同濃度的利奈唑胺作用于人血小板細(xì)胞，觀察其是否具有誘導(dǎo)血小板凋亡的作用，為了解利奈唑胺引起血小板減少癥的相關(guān)機(jī)制，尋求降低該不良反應(yīng)發(fā)生率的對(duì)策，進(jìn)而提高利奈唑胺使用的安全性提供參考。

1　材料

1.1血小板

依據(jù)年齡30歲以下、無(wú)基礎(chǔ)性疾病、3個(gè)月內(nèi)未使用過(guò)任何藥物、無(wú)吸煙飲酒等不良嗜好，血小板基礎(chǔ)值在100×109·L-1至300×109·L-1區(qū)間范圍內(nèi)的納入條件選擇健康志愿者8名，簽署知情同意書，按“2.1”項(xiàng)下的方法獲取血小板。本研究已通過(guò)解放軍總醫(yī)院倫理委員會(huì)審議批準(zhǔn)（編號(hào)2012007）。

1.2試劑

利奈唑胺注射液（300 mL : 0.6 g）購(gòu)自美國(guó)輝瑞制藥有限公司。細(xì)胞LDH檢測(cè)試劑盒（微孔法）、AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、JC-1檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司，Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒、伊屋諾霉素（Ionomycin）購(gòu)自海門碧云天生物技術(shù)研究所，CGS緩沖液購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司，PBS緩沖液購(gòu)自北京中生瑞泰科技有限公司。

1.3儀器

流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter公司），電泳儀（美國(guó)BIO-RAD公司），搖床振蕩器（海門其林貝爾儀器制造有限公司），漩渦震蕩儀（海門其林貝爾儀器制造有限公司），DualRange分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司），冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司），酶標(biāo)儀（美國(guó)BIO-RAD公司），二氧化碳培養(yǎng)箱（德國(guó)Memmert公司）。

2　方法

2.1血小板富集與分離

于實(shí)驗(yàn)當(dāng)日取每名志愿者靜脈血10 mL，將全血和ACD抗凝劑按照7 : 1體積輕輕混勻，在25 ℃下以800 r·min-1離心10 min，分離上層富含血小板血漿（PRP），再將PRP以1500 g離心2 min，棄上清液，沉淀用CGS緩沖液懸浮，在25 ℃下以2500 r·min-1離心2 min，棄上清液，將沉淀再重懸于CGS緩沖液洗滌，再次在25 ℃下以2500 r·min-1離心2 min，將沉淀部分用MTB緩沖液重懸，得到洗滌血小板，調(diào)整血小板濃度為3×108·mL-1，室溫靜置1 h 使其恢復(fù)至靜息狀態(tài)待用。

2.2分組

按照給藥劑量將洗滌后的血小板分為4組：空白對(duì)照組，利奈唑胺75 μg·mL-1組，利奈唑胺150 μg·mL-1組和Ionomycin 0.5 μmol組，每組8個(gè)樣本。

2.3乳酸脫氫酶活性檢測(cè)

將各組血小板在37 ℃下孵育4 h，期間在培養(yǎng)液中加入1% Triton X-100充分裂解血小板，取標(biāo)準(zhǔn)品丙酮酸鈉和樣本各10 μL加入到微孔板中。按說(shuō)明書要求設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和對(duì)照孔，取60 μL底物緩沖液與氧化型輔酶Ⅰ（NAD）混合溶液加到各孔，充分混勻，37 ℃水浴孵育15 min。而后在各孔中加入2，4-二硝基苯肼溶液50 μL，充分混合，37 ℃水浴孵育15 min后加入150 μL終止試劑。室溫靜置3 min，選擇450 nm波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，用酶標(biāo)儀在440 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各組吸光度。依據(jù)說(shuō)明書公式算出LDH活性釋放量。

2.4磷脂酰絲氨酸外翻檢測(cè)

將各組血小板在37 ℃下孵育4 h。而后用PBS洗滌兩次（2000 r·min-1離心5 min），收集5×105個(gè)血小板，加入500 μL的Binding Buffer使之懸浮，加入5 μL膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）混勻后，加入5 μL熒光染料碘化嘧啶再次混勻，在室溫下避光孵育15 min，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

2.5Caspase-3活性檢測(cè)

用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)各組樣品蛋白含量，確保蛋白濃度> 1 mg·mL-1。將各組血小板按說(shuō)明書要求在37 ℃下孵育4 h。而后在4 ℃下600 g離心5 min收集血小板，除去上清液，用PBS洗滌一次后，加入1% Triton X-100充分裂解血小板，4 ℃下20 000 g離心10 ~ 15 min，立即在405 nm下測(cè)定pNA吸光度以反映Caspase-3的酶活性。

2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以（x± s ）表示，單因素方差分析來(lái)確定多組樣本之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P < 0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1利奈唑胺對(duì)人血小板乳酸脫氫酶釋放的影響

如圖1所示，150 μg·mL-1利奈唑胺作用4 h可引起人血小板LDH釋放增加，與空白對(duì)照組、利奈唑胺75 μg·mL-1組相比均有明顯差異，75 μg·mL-1利奈唑胺作用4 h，人血小板LDH釋放未見(jiàn)顯著變化。

圖1　利奈唑胺對(duì)人血小板乳酸脫氫酶釋放的影響Fig 1 Effect of linezolid on LDH release of human platelets

3.2利奈唑胺對(duì)人血小板磷酯酰絲氨酸外翻的影響

如圖2所示，75 μg·mL-1利奈唑胺作用4 h，血小板細(xì)胞膜表面磷酯酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）外翻顯著增加，與Annexin V特異性結(jié)合后產(chǎn)生綠色熒光，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，與空白對(duì)照組相比具有顯著性差異。150 μg·mL-1利奈唑胺作用4 h，血小板細(xì)胞膜表面PS外翻顯著增加，與空白對(duì)照組、利奈唑胺75 μg·mL-1組相比均具有顯著性差異。

3.3利奈唑胺對(duì)人血小板Caspase-3酶活性的影響

如圖3所示，150 μg·mL-1利奈唑胺作用4 h，血小板細(xì)胞Caspase-3酶活性顯著升高，與空白對(duì)照組、利奈唑胺75 μg·mL-1組相比具有顯著性差異。與空白對(duì)照組相比，75 μg·mL-1利奈唑胺作用4 h，血小板細(xì)胞Caspase-3酶活性未見(jiàn)顯著性變化。

圖2　利奈唑胺對(duì)人血小板磷酯酰絲氨酸外翻的影響Fig 2 Effect of linezolid on phosphatidylserine exposure of human platelets

圖3　利奈唑胺對(duì)人血小板Caspase-3酶活性的影響Fig 3 Effect of linezolid on Caspase-3 activity of human platelets

4　討論

近年來(lái)，多種因素引起的血小板減少癥均被報(bào)道與誘導(dǎo)血小板凋亡有關(guān)[4-6]。因此，本文依據(jù)利奈唑胺常用給藥劑量（600 mg，bid）下的藥-時(shí)曲線面積（AUC），設(shè)置了75 μg·mL-1、150 μg·mL-1兩個(gè)給藥劑量，模擬半衰期（t1/2）設(shè)置了4 h的給藥時(shí)間，擬觀察利奈唑胺是否存在對(duì)人血小板的凋亡作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，利奈唑胺可劑量依賴性引起血小板PS外翻增加，150 μg·mL-1利奈唑胺可引起血小板LDH釋放增加，Caspase-3酶活性增加。提示利奈唑胺具有引起人血小板損傷的作用，且該作用可能與通過(guò)誘導(dǎo)血小板凋亡有關(guān)。

LDH來(lái)源于細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)催化乳酸形成丙酮酸鹽，和INT（四唑鹽類）反應(yīng)形成具有紫外吸收的產(chǎn)物而被檢測(cè)到[7]，其大量增加提示150 μg·mL-1利奈唑胺可引起血小板細(xì)胞膜的損傷。Annexin V可特異性地與外翻到細(xì)胞表面的PS結(jié)合，是檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一[8]。有文獻(xiàn)指出，外翻的PS參與巨噬細(xì)胞對(duì)凋亡細(xì)胞的結(jié)合，加快吞噬細(xì)胞對(duì)凋亡細(xì)胞的清除[9]。利奈唑胺劑量依賴性引起人血小板PS外翻，除提示血小板處于早期凋亡狀態(tài)外，還存在通過(guò)誘導(dǎo)PS外翻，增加凋亡血小板的免疫原性，加快吞噬細(xì)胞對(duì)凋亡血小板的清除作用，進(jìn)而引起血小板減少。

Ionomycin是一種鈣離子載體，可開(kāi)放細(xì)胞鈣離子通道，引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。與Ionomycin相比，利奈唑胺誘導(dǎo)凋亡的作用部分類似，提示利奈唑胺具有潛在的鈣離子通道載體作用，尚需進(jìn)一步考察血小板細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化予以證實(shí)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 林東昉，王明貴，張嬰元.唑烷酮類抗菌藥：利奈唑胺[J].中國(guó)抗感染化療雜志，2001，1（3）：184-186.

[2] 王小文，趙松，宋陽(yáng)，等.利奈唑胺在治療難治性中樞神經(jīng)系統(tǒng)革蘭陽(yáng)性球菌感染中的價(jià)值[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2010，20（20）：3207-3209.

[3] 王兵，韓鸚贏，李紅潔，等.危重患者血小板減少癥發(fā)病危險(xiǎn)因素及預(yù)后分析[J].中國(guó)急救醫(yī)學(xué)，2008，28（12）：1072-1076.

[4] Towhid ST, Schmidt EM, Tolios A, et al. Stimulation of platelet death by vancomycin[J]. Cell Physiol Biochem, 2013, 31(1): 102-112.

[5] Santhosh MS, Thushara RM, Hemshekhar M, et al. Alleviation of viper venom induced platelet apoptosis by crocin (Crocus sativus): implications for thrombocytopenia in viper bites[J]. J Thromb Thrombolysis, 2013, 36(4): 424-432.

[6] Kumari S, Chaurasia SN, Nayak MK, et al. Sirtuin inhibition induces apoptosis-like changes in platelets and thrombocytopenia[J]. J Biol Chem, 2015, 290(19): 12290-12299.

[7] Lobner D. Comparison of the LDH and MTT assays for quantifying cell death: validity for neuronal apoptosis?[J]. J Neurosci Methods, 2000, 96(2): 147-152.

[8] 吳建勇，趙德璋.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的幾種方法的比較[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，35（9）：1386-1389.

[9] 王燕群，劉尚喜.磷脂酰絲氨酸在凋亡細(xì)胞被吞噬細(xì)胞清除中的作用[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2006，22（13）：1485-1487.

[10] 敖琳，曹佳.細(xì)胞凋亡中Ca2+穩(wěn)態(tài)失調(diào)機(jī)制的研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)分冊(cè)，2001，23（2）：106-109.

收稿日期：（2015-03-08 修回日期：2015-06-21）

[作者簡(jiǎn)介]王天琳，男，主管藥師，主要從事臨床藥學(xué)、臨床藥理學(xué)工作。E-mail：klezmer@126.com

[通信作者]王睿，女，研究員，主要從事臨床藥理學(xué)工作。E-mail：wangr_301@163.com

[基金項(xiàng)目]十二五國(guó)家重大科技專項(xiàng)（2012ZX09303004-002）

[中圖分類號(hào)]R977.1+5

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1672 – 8157(2015)04 – 0209 – 03