琥珀布考納米膠束含量測定方法的研究

包曉悅，張志文，喬明曦，陳大為*

（1. 沈陽藥科大學 藥學院，遼寧 沈陽 110016；2. 中國科學院上海藥物研究所，上海 201203）

琥珀布考納米膠束含量測定方法的研究

包曉悅1，張志文2，喬明曦1，陳大為1*

（1. 沈陽藥科大學 藥學院，遼寧 沈陽 110016；2. 中國科學院上海藥物研究所，上海 201203）

目的制備琥珀布考納米膠束，建立琥珀布考納米制劑的HPLC含量測定方法，并用于其含量的測定。方法采用滴入法制備琥珀布考納米膠束，應用高效液相色譜法測定藥物含量。色譜柱為Discovery-C18HS F5-5柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-體積分數(shù)0.1% TFA水溶液（體積比80:20），流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為242 nm，進樣量為20 μL。采用高速離心法分離納米膠束與游離藥物并測定其包封率和載藥量。結(jié)果琥珀布考質(zhì)量濃度在1.0～500.0 mg·L-1內(nèi)與吸收峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為A=1.920 3×104ρ+2.424 6× 104（r=1.000 0），低、中、高三個質(zhì)量濃度的回收率均在98%～102%，日內(nèi)精密度和日間精密度的RSD均小于2%（n=6）。自制琥珀布考納米制劑的含量為(3.88 ±0.06) g·L-1，包封率為(96.95±0.02)%，載藥量為(9.65±0.01)%。結(jié)論該方法準確可靠、簡單快速、重復性好，可用于測定琥珀布考納米制劑的含量、包封率和載藥量。

藥劑學；琥珀布考；高效液相色潽法；含量測定；包封率

普羅布考是一種已經(jīng)上市的抗氧化劑，主要用于抗粥樣動脈硬化和高膽固醇等心腦血管疾病的治療[1-3]。琥珀布考是普羅布考的單琥珀酸酯，研究發(fā)現(xiàn)其比母體化合物具有更好的水溶性和細胞穿透性，具有明顯的抗氧化活性和降脂活性。琥珀布考有雙重作用，一方面可以通過抗氧化作用來保護血管內(nèi)皮，另一方面可以降低血LDL-膽固醇的水平，并且還可以抑制VCAM-1和MCP-1的表達，抑制平滑肌細胞的增殖，在動脈粥樣硬化和高脂血癥動物模型中發(fā)揮了療效[4]。

納米載藥系統(tǒng)具有改善藥物分布，提高疏水性藥物吸收和生物利用度，降低藥物毒性及不良反應等優(yōu)勢。由于琥珀布考疏水性導致其吸收效果差和生物利用度低等特點，本文作者制備琥珀布考納米載藥系統(tǒng)能夠有效提高其吸收和生物利用度，并且將納米載藥系統(tǒng)應用于靜脈注射途徑，能夠使其具有明顯的靶向作用從而顯著提高藥物的吸收和利用率。包封率和載藥量是評價納米制劑質(zhì)量的重要指標[5]。本文作者考察了琥珀布考的制備方法并對其納米制劑中藥物含量進行測定，該方法簡便易行，為納米制劑的質(zhì)量控制提供了依據(jù)，有效排除了后續(xù)實驗中因制劑因素引入的誤差。琥珀布考（succinobucol，Sub）的化學結(jié)構(gòu)式見圖1。

Fig. 1 The chemical structure of succinobucol圖 1 琥珀布考的化學結(jié)構(gòu)式

1 儀器與材料

BP190S電子天平（美國Sartorius公司），DF-101S恒溫磁力攪拌器（上海予華儀器有限公司），2695高效液相色譜儀（美國Waters公司），Millex-HP超濾管（德國默克公司）。

琥珀布考（含量質(zhì)量分數(shù)>97%，自制），mPEG5k-PDPA10（自制），琥珀布考納米膠束（自制），空白納米膠束（自制），乙腈（國藥集團化學試劑有限公司），水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 納米制劑的制備

取mPEG5k-PDPA1018 mg、琥珀布考4 mg，溶于50 μL甲醇中，室溫磁力攪拌條件下，緩緩滴入去離子水1.9 mL，繼續(xù)攪拌30 min后，得到質(zhì)量濃度為4 g·L-1琥珀布考納米制劑（PMS）。

取mPEG5k-PDPA1018 mg，溶于50 μL甲醇中，室溫磁力攪拌條件下，緩緩滴入去離子水1.9 mL，繼續(xù)攪拌30 min后，得到空白納米制劑。

2.2 含量方法的建立

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Discovery-C18HS F5-5柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-體積分數(shù)0.1% TFA水溶液（體積比80:20）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：242 nm；進樣量：20 μL。

2.2.2 溶液的制備

對照溶液：取琥珀布考對照品約10 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得質(zhì)量濃度為1 g·L-1的琥珀布考對照儲備液。精密量取琥珀布考對照儲備液1.0 mL，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得質(zhì)量濃度為100 mg·L-1琥珀布考對照溶液。

供試溶液：精密移取琥珀布考納米制劑1.0 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇破乳并稀釋至刻度，作為供試溶液。

2.2.3 專屬性考察

取質(zhì)量濃度為1.0 g·L-1的Sub乙腈溶液，4.5 g·L-1的空白材料溶液，配置含Sub終質(zhì)量濃度為1.0 g·L-1的PMS溶液，加入9倍體積乙腈破壞。按“2.2.1”條方法測定，考察專屬性。結(jié)果表明，Sub及空白載體材料的HPLC色譜圖見圖2。Sub的出峰時間為6.52 min，在此色譜條件下，不能檢測出空白載體材料的色譜峰，因此空白載體材料不影響藥物的檢測。

Fig. 2 HPLC chromatograms of mPEG5k-PDPA10(A) and Sub (B) and PMS (C)圖 2 mPEG5k-PDPA10(A)、Sub (B) 和PMS（C）的高效液相色譜圖

2.2.4 線性范圍考察

取琥珀布考約10 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得琥珀布考儲備液。精密移取該儲備液適量，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為 500.0、100.0、50.0、10.0和1.0 mg·L-1的系列標準溶液分別進樣，記錄峰面積。將峰面積（A）和對應溶液的質(zhì)量濃度（ρ）線性回歸，得Sub的標準曲線，回歸方程為A=1.920 3×104ρ+2.424 6×104(r=1.000 0)。結(jié)果表明，Sub的質(zhì)量濃度在1.0～500.0 mg·L-1內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 回收率和精密度試驗

取空白載膠束溶液，分別加入終質(zhì)量濃度為1.0、50.0和500.0 mg·L-1的Sub溶液，加入9倍體積色譜乙腈，HPLC測定，考察方法回收率。低、中、高三個質(zhì)量濃度的回收率均在98%～102%內(nèi)，回收率符合方法學要求。結(jié)果見表1。

Table 1 Recoveries of the assay (n=6)表 1 回收率實驗結(jié)果（n=6）

取1.0、50.0和500.0 mg·L-1的Sub溶液，于日內(nèi)或日間連續(xù)測定，計算日內(nèi)和日間精密度。精密度的考察結(jié)果見表2，低、中、高三個質(zhì)量濃度的日內(nèi)和日間精密度的RSD均小于2%，符合方法學要求。

Table 2 Precision of the method (n=6)表 2 精密度實驗結(jié)果(n=6)

2.3 PMS的包封率和載藥量

精密移取琥珀布考對照儲備液1.0 mL，加甲醇稀釋至10 mL，搖勻，作為對照溶液。另精密移取琥珀布考納米制劑1.0 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇破乳并稀釋至刻度，平行操作三份，作為樣品溶液。分別取上述溶液進樣分析，用外標法計算琥珀布考納米制劑中琥珀布考的含量，測得琥珀布考納米制劑的含量為(3.88±0.01) g·L-1(n=3)，結(jié)果見表3。

Table 3 Results of quatification experiments (n=3)表3 定量實驗的結(jié)果（n=3）

將PMS置于30 ku的超濾管中，5 000 r·min-1離心30 min，取下層液體，用HPLC方法測定PMS中游離琥珀布考的質(zhì)量濃度。同時用9倍乙腈破壞PMS并提取Sub，用HPLC檢測Sub的總質(zhì)量濃度。按照公式：EE=mm/mf×100%計算包封率（EE）和公式：DL=mm/mp×100%計算載藥量（DL）。其中，mm為納米膠束中琥珀布考的質(zhì)量，mf為琥珀布考投藥質(zhì)量，mp為納米膠束和琥珀布考總質(zhì)量。結(jié)果表明琥珀布考納米制劑的包封率為(96.95±0.02)%（n=3），載藥量為(9.65±0.01)%（n=3）。

3 討論

a. 流動相考察了乙腈-水、乙腈-體積分數(shù)0.1% TFA共2種流動相體系，結(jié)果表明體積分數(shù)0.1% TFA能明顯改善琥珀布考峰形，大大提高柱效，故選擇在水相中加入體積分數(shù)0.1%三氟乙酸。

b. 對納米膠束的含量測定，一般采用破乳的方法使納米膠束轉(zhuǎn)變成溶液，然后對其藥物的含量進行測定。本文作者采用甲醇對琥珀布考納米膠束進行破乳處理，測得琥珀布考納米制劑的含量。對所建立的方法學進行驗證，結(jié)果表明，該方法合理準確，重復性好，適用于琥珀布考納米膠束的含量測定。

c. 包封率和載藥量是評價納米制劑的最重要指標，也是納米膠束能否發(fā)揮高效、低毒優(yōu)點的關(guān)鍵。納米膠束包封率和載藥量一般將游離藥物與載藥納米粒分離后再進行測定。常用的分離方法有離心法、微柱離心法、凝膠柱色譜法、透析法、超濾離心法等。其中超濾離心法是通過膜表面的微孔結(jié)構(gòu)借助離心力作用，對大分子依據(jù)相對分子質(zhì)量大小進行選擇性分離的技術(shù)，經(jīng)超濾離心后，PMS沉積于膜表面，下清液為游離藥物，采用超濾離心可將游離藥物與PMS完全分離。

[1] FENG X, LI Y, WANG X Y. Effects of probucol on mesangial cell proliferation and extracellular matrix production in rat induced by lipopolysaccharides [J]. Chin J Mod Appl Pharm, 2011, 28(4): 297-300.

[2] LI T T, GUO Y. Advances and prospects of probucol [J]. Adv Cardiovasc Dis, 2009, 30(4): 649-652.

[3] YAMAMOTO A. A unique antilipidemic drug-probucol [J]. J Atheroscler Thromb, 2008, 15(6): 304-305.

[4] MENG C Q, SOMERS P K, RACHITA C L, et al. Novel phenolic antioxidants as multifunctional inhibitors of inducible VCAM -1 expression for use in atherosclerosis [J]. Bioorg Med Chem Lett, 2002, 12: 2545-2548.

[5] 劉利萍, 金陽, 李毅. 微柱凝膠離心分離法測定克霉唑脂質(zhì)體的包封率[J]. 藥物分析雜志, 2007, 27(11): 1812-1815.

Determination of succinobucol content in nano micelles

BAO Xiao-yue1, ZHANG Zhi-wen2, QIAO Ming-xi1, CHEN Da-wei1*
(1. School of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China; 2. Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201203, China)

ObjectivesTo establish a method for the determination of the content and entrapment efficiency of succinobucol in nanomicelles. MethodsHPLC method was applied using. Discovery-C18HS F5-5 (250 mm×4.6 mm, 5 μm) column. The mobile phase consisted of acetonitrile-water with 0.1% TFA (V:V=80:20). The flow rate was 1.0 mL·min-1and the detection wavelength was set at 242 nm. The sample volume was 20 μL. Nano micelles and free drug were separated by high speed centrifugation and the entrapment efficiency and drug loading were determined.ResultsGood linear relationship (r=1.000 0) between peak areas (A) and concentration (ρ) of succinobucol ranging from 1.0-500.0 mg·L-1was obtained, and the calibration curve was A =1.920 3×104ρ+2.424 6×104. The recoveries were in the range of 98%-102% (n=3) and RSDs were less than 2.0%. The content of succinobucol in nanomicelles was (3.88± 0.06) g·L-1. The entrapment efficiency was (96.95±0.02)%. The drug loading was (9.65±0.01)%.ConclusionsThe method is accurate, simple and rapid, reproducible, and can be used for determination of entrapment efficiency and drug loading of succinobucol in nanomicelles.

pharmaceutics; succinobucol; HPLC; content determination; entrapment efficiency

R94

A

(

本篇責任編輯：馬麗麗)

（2015）02-0045-06

10.14146/j.cnki.cjp.2015.02.001

2014-06-18

包曉悅（1987-），女（蒙古族），河南焦作人，碩士研究生，E-mail baoxiaoyue223@163.com； *

：陳大為（1959-），男（漢族），遼寧海城人，教授，主要從事藥劑學研究，Tel. 024-23986306，E-mail chendawei@syphu.edu.cn。