三種泵用胰島素體外對抗等電點沉淀的研究

湯智慧，金楊紅，母義明，崔曉飛，李久旭，梁 瀟，李 芳

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三種泵用胰島素體外對抗等電點沉淀的研究

湯智慧1ab，金楊紅2，母義明1a*，崔曉飛3，李久旭1b，梁 瀟1b，李 芳1b

目的 比較三種市售泵用胰島素對抗等電點沉淀的效果。方法 通過加入稀釋鹽酸的方法模擬pH值下降過程中，用高效液相色譜(HPLC)測定三種胰島素(重和林R、諾和靈R、優(yōu)泌林R)等電點沉淀情況。并采用高斯擬合的方法繪制出沉淀曲線，并得出三種胰島素發(fā)生沉淀時的pH值。結(jié)果 重和林R、諾和靈R和優(yōu)泌林R在出現(xiàn)10%和90%沉淀時的pH值分別為6.52和5.82，6.85和6.00，6.68和5.94。結(jié)論 重和林R開始出現(xiàn)沉淀的pH值最低，對抗等電點的作用最強，其次是優(yōu)泌林R，諾和靈R最差。胰島素等電點會引起胰島素構(gòu)象改變發(fā)生沉淀，阻塞胰島素泵，進(jìn)而引起血糖控制不佳。但本研究僅在體外比較了胰島素對抗等電點沉淀的不同，與臨床中胰島素泵堵塞之間作用的機制仍需進(jìn)一步研究。

胰島素泵；等電點沉淀;高效液相色譜法

0 引言

早在上世紀(jì)七八十年代，胰島素持續(xù)皮下泵入(CSII)作為一種治療手段就開始在臨床使用。由于CSII對平均血糖水平和糖化血紅蛋白(HbA1c)的改善較靜脈注射胰島素均有明顯提高，可以明顯改善糖尿病患者的生活質(zhì)量，近年來發(fā)展迅速。但在CSII治療過程中，胰島素儲存在儲藥器中，因此，環(huán)境的改變(如：pH值的改變、溫度的升高等)可能會影響胰島素的穩(wěn)定性，引起胰島素構(gòu)象的改變以及性質(zhì)變化，造成胰島素沉淀進(jìn)而導(dǎo)致胰島素泵管路的堵塞[1-2]。胰島素泵的堵塞是CSII治療糖尿病的主要缺點，會增加患者出現(xiàn)糖尿病酸中毒的風(fēng)險[3]。盡管隨著胰島素泵技術(shù)的提高以及胰島素制劑配方的改變，胰島素泵管路堵塞問題引起的糖尿病酮癥酸中毒已經(jīng)大大減少，但仍然是CSII臨床治療面臨的一個問題。因此，減少胰島素泵的堵塞無疑可以給患者帶來更大的獲益。本研究旨在通過體外模擬pH值下降過程中三種短效胰島素發(fā)生等電點沉淀的情況。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(安捷倫，1100)，安捷倫色譜工作站(美國安捷倫公司)，電子天平(METTLER TOLEDO XS205DU)，pH計(METTLER TOLEDO FIVEEASY電極FE20)，渦旋振蕩器[IKA(r)VORTER GENIUS3]，離心機(SIGMA 2-16PK)。

1.2 試藥 賴脯胰島素對照品(批號：140729-200501，含量94.4%，效價26.9 IU/mg)，重組人胰島素注射液(商品名：重和林R，拜耳，批號：643005)，重組人胰島素注射液(商品名：優(yōu)泌林R，禮來，批號：C256635E)，生物合成人胰島素注射液(商品名：諾和靈R，諾和諾德，批號：DVG0145)，乙腈(色譜純)，鹽酸(優(yōu)級純，北京化工，批號：20140401)。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件[4]根據(jù)《中國藥典》(2010版第一增補版)，色譜柱：安捷倫十八烷基硅膠柱(ZORBAX SB-C18，4.6×250 mm，5 μm)；流動相：0.2 mol/L硫酸鹽緩沖液(取無水硫酸鈉28.4 g，加水溶解后，加磷酸2.7 mL，乙醇胺調(diào)節(jié)pH值至2.3，加水1 000 mL)-乙腈(74∶26)；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：214 nm。

2.2 胰島素沉淀的制備 將每種胰島素分為36等份，每份5 mL。通過加入100%濃度為0.1 mol/L的鹽酸和100%純凈的蒸餾水不同比例的混合(總量720 μL)，來調(diào)整每個樣本的pH值，使得所有的pH覆蓋7.1～3.6(胰島素的沉淀范圍)，使用pH計測定pH值，將樣本室溫下放置渦旋振蕩器上振蕩1 h。將振蕩沉淀后的樣品放入離心機(4 000 r/min)中離心5 min。精密量取離心后樣品的上清液10 μL，注入HPLC儀，記錄色譜柱。另外取對照品3份加入720 μL蒸餾水，同法測得。按照外標(biāo)法以胰島素的峰面積來計算溶解胰島素的含量。根據(jù)3種胰島素上清液中溶解胰島素的量以及對照品中胰島素含量(n=3)來確定3種胰島素在不同pH值下的沉淀量。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法[5]根據(jù)改進(jìn)的高斯模型，將沉淀的胰島素的百分比與pH值和進(jìn)行擬合。統(tǒng)計分析采用SAS 9.2軟件。公式如下：

2.4 結(jié)果 pH值影響胰島素沉淀量，本研究顯示，pH 7.0～3.6覆蓋了3種胰島素從開始沉淀到沉淀完全的pH范圍。3種胰島素沉淀量與pH值的關(guān)系見圖1～圖3。結(jié)果顯示，當(dāng)pH值下降時，三種胰島素開始出現(xiàn)沉淀的pH值是不同的，重和林R<諾和靈R<優(yōu)泌林R。見表1、圖4。

表1 根據(jù)高斯方程擬合結(jié)果推算出不同沉淀量所對應(yīng)的pH值

注：*5 mL胰島素加入720 μL蒸餾水后的pH值(每種胰島素各取3份取平均值)

圖1 重和林R沉淀比例與pH值之間的關(guān)系擬合曲線

圖2 諾和靈R沉淀比例與pH值之間的關(guān)系擬合曲線

圖3 優(yōu)泌林R沉淀比例與pH值之間的關(guān)系擬合曲線

圖4 三種胰島素在pH下降過程中對抗等電點沉淀的比較

3 討論

隨著胰島素泵技術(shù)的提高，理論上認(rèn)為在管路中不會發(fā)生胰島素等電點沉淀。但根據(jù)文獻(xiàn)報道，在使用胰島素泵給藥過程中，pH值會發(fā)生微小的降低(即儲藥器中pH為7.4，導(dǎo)管末端pH為7.2)，提示pH值變化主要發(fā)生在輸注部位[1-2]。另外，由于胰島素等電點沉淀引起的胰島素泵管路堵塞的報道均是使用無緩沖鹽的胰島素，以及血管內(nèi)的CO2擴散到到管中引起管路中pH值從7.0降到5.8引起的[5]。所以，即使泵技術(shù)提高了，胰島素等電點沉淀仍然可能發(fā)生，實際臨床中pH值降低會在組織中發(fā)生，如人體膿腫組織中pH值范圍是4.7～7.2,局部細(xì)菌感染部位pH值也會下降等[5]。

如表1所示，重和林R、諾和靈R、優(yōu)泌林R在出現(xiàn)10%和90%沉淀時的pH值分別為6.52和5.82、6.85和6.00、6.68和5.94。因此，胰島素在溶液中由中性到酸性的過程中，諾和靈R最早形成沉淀，而重和林R在pH<5.9以后才會形成沉淀，其形成沉淀最晚，說明重和林是由中性到酸性環(huán)境中最穩(wěn)定的胰島素，其對抗胰島素等電點沉淀的效果最強。

胰島素等電點會引起胰島素構(gòu)象改變，進(jìn)而發(fā)生沉淀，阻塞胰島素泵，引起血糖控制不佳。但本研究僅在體外比較了胰島素對抗等電點沉淀的不同，與臨床中胰島素泵堵塞之間的因果關(guān)系以及胰島素泵發(fā)生管路堵塞的機制仍需進(jìn)一步研究。

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Invitrostudy on resistance towards isoelectric precipitation of insulin products used for continuous subcutaneous insulin infusion

TANG Zhi-hui1ab,JIN Yang-hong2,MU Yi-ming1a*,CUI Xiao-fei3,LI Jiu-xu1b,LIANG Xiao1b,LI Fang1b

(1.a.Deptment of Endocrinology,b.Department of Pharmaceutical Care,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853,China;2.Puyang Oil Field General Hospital，Henan 457001，China；3.Institute for Drug and Instrument Control of PLA,Beijing 100071，China)

Objective To compare the resistance towards isoelectric precipitation of three insulin products used for continuous subcutaneous insulin infusion.Methods The degree of isoelectric insulin precipitation of recombinant human insulin injection(SciLin R),Biosynthetic human insulin injection (Novolin R),and recombinant human insulin injection (Humulin R) was examined by HPLC in the simulation of reducing pH with addition of diluted HCl.The modified Gaussian model was used to superimpose the percentage of precipitated insulin versus pH.Results The pH value at the time point of 10% and 90% precipitation occurred was 6.52 and 5.82 for SciLin R,6.85 and 6.00 for Novolin R,6.68 and 5.94 for Humulin R. Conclusion Resistance towards isoelectric precipitation is highest for SciLin R,while the pH value when the precipitation occurred is lowest. The resistance towards isoelectric precipitation of Novolin R is lowest. Isoelectric precipitation can alter the pharmacokinetic properties of the insulin and lead to the occlusion of the infusion catheter,result in poor control of blood sugar. The article compared the differences in resistance towards isoelectric precipitation of different insulin products,and the mechanism in the resistance and the formulation of catheter occlusion requirefurther studies.

Continuous subcutaneous insulin infusion (CSII);Isoelectric precipitation;HPLC

2015-02-25

1.解放軍總醫(yī)院a.內(nèi)分泌科，b.藥品保障中心，北京 100853；2.河南濮陽市油田總醫(yī)院藥劑科，河南 濮陽 457001；3.總后勤部衛(wèi)生部藥品儀器檢驗所，北京 100071

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201511024