多抗菌劑對(duì)植煙土壤細(xì)菌群落多樣性的影響

張忠民,劉虎,丁延芹,南龍,汪城墻,王君,郭海萌,杜秉海*

1.濟(jì)寧學(xué)院,山東曲阜2731552.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/山東省農(nóng)業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東泰安271018

?

多抗菌劑對(duì)植煙土壤細(xì)菌群落多樣性的影響

張忠民1,劉虎2*,丁延芹2,南龍2,汪城墻2,王君2,郭海萌2,杜秉海2**

1.濟(jì)寧學(xué)院,山東曲阜273155
2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/山東省農(nóng)業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東泰安271018

摘要:本試驗(yàn)運(yùn)用454焦磷酸高通量測(cè)序的方法對(duì)施用多抗菌劑的植煙土壤進(jìn)行細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn):植煙土壤中細(xì)菌的種類主要集中在變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和厚壁菌門(Firmicutes)。施用多抗菌劑與未施用多抗菌劑的樣品相比，根際土壤中細(xì)菌總綱數(shù)減少7.27%，檢測(cè)到的OTU數(shù)目減少12.83%；非根際土中，細(xì)菌的總綱數(shù)減少4.62%，檢測(cè)到的OTU數(shù)目減少20.31%?？梢姡┯枚嗫咕鷦┛梢越档椭矡熗寥乐屑?xì)菌群落多樣性。

關(guān)鍵詞:植煙土壤;細(xì)菌群落多樣性; 454焦磷酸測(cè)序;多抗菌劑

*并列第一作者:劉虎(1990-),男,山東臨沂人,在讀碩士研究生,主要從事環(huán)境微生物研究. E-mail:liuhu20090905@163.com

煙草青枯病是由Ralstonia solanacearum引起的一種細(xì)菌性病害，是煙草的重要病害之一。幾乎存在于世界各植煙地區(qū)，特別是在熱帶和亞熱帶以及一些溫帶地區(qū)較為集中[1]。青枯病一旦發(fā)病，會(huì)對(duì)煙草的產(chǎn)量和煙葉的質(zhì)量造成極大的影響[2]。煙草黑脛病也是煙草生產(chǎn)中較為嚴(yán)重的土傳病害，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成絕產(chǎn)。目前對(duì)青枯病和黑脛病的防治主要是合理輪作、選育抗性品種、藥劑防治[3-5]、，以及施用可以有效降低青枯病發(fā)病率的生物有機(jī)肥的生物防治[6]。

土壤是微生物活動(dòng)的大本營(yíng)，土壤中蘊(yùn)含大量的微生物。土壤微生物群落是土壤生物區(qū)系中最重要的功能成分，對(duì)于環(huán)境變化程度十分敏感，根據(jù)環(huán)境變化，土壤微生物能夠在結(jié)構(gòu)和功能上做出響應(yīng)[7]，土壤微生物群落多樣性是土壤微生物活性指標(biāo)中最重要的因素，與土壤生態(tài)穩(wěn)定密切相關(guān)。在植物病害的生防過(guò)程中使用的一些菌劑可能會(huì)對(duì)植物根際土壤中的微生物群落產(chǎn)生影響。有研究表明施用棉花黃萎病拮抗菌后棉花根際土壤中微生物的數(shù)量發(fā)生變化，真菌數(shù)量減少[8]。

傳統(tǒng)的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析通常采用在普通凝膠電泳基礎(chǔ)上發(fā)展來(lái)的DGGE(變性梯度凝膠電泳法)[9]，以及建立在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上，結(jié)合DNA限制性酶切技術(shù)、熒光標(biāo)記技術(shù)和DNA序

列自動(dòng)分析技術(shù)的T-RFLP（即末端標(biāo)記限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性）[10,11]、還有FAME（脂肪酸甲脂分析）和PLFA（磷脂脂肪酸分析）等方法。但是這些技術(shù)工作量較大，且獲得的信息量少。新興的羅氏454和Illumina高通量測(cè)序可以有效地減少工作量，提高工作效率。羅氏454高通量測(cè)序是依據(jù)焦磷酸測(cè)序基本原理，454測(cè)序無(wú)需建庫(kù)，每次反應(yīng)可以獲取100萬(wàn)個(gè)測(cè)序讀長(zhǎng)在400~500 bp的序列片段，測(cè)序準(zhǔn)確性高[12,13]，同時(shí)高通量測(cè)序還有助于發(fā)現(xiàn)新物種。

本實(shí)驗(yàn)以煙草青枯病拮抗菌多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）YD0136、短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）DZQ3以及煙草黑脛病拮抗菌多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）YD0573組成的多抗菌劑進(jìn)行大田試驗(yàn)，采用454高通量測(cè)序方法研究多抗菌劑對(duì)煙草根際土壤和非根際土壤細(xì)菌群落多樣性的影響。

1　材料與方法

1.1取樣

取樣地點(diǎn)在貴州省遵義市道真縣（經(jīng)度107.6°，緯度28.89°）隆興鎮(zhèn)浣溪村化木嶺組，海拔高度1264 m。取樣時(shí)間為2013年7月28日。取樣處理為添加多抗菌劑的非根際土、未添加多抗菌劑的非根際土、未添加多抗菌劑的根際土、添加多抗菌劑的根際土，分別編號(hào)為S1、S2、S3、S4。土樣取出后保存在-20℃冰箱中備用。

1.2樣品處理

土壤總DNA的提取：土壤總DNA的提取采用美國(guó)OMEGA公司生產(chǎn)的E.Z.N.A.Soil DNA Kit試劑盒。將提取的土壤總DNA檢測(cè)合格后，密封，用冰袋寄送到上海人類基因組研究中心基因組測(cè)序部，測(cè)序儀器為454 GX-FLX（Roche，羅氏公司）。

2　結(jié)果分析

由圖1稀釋曲線可以看出隨著測(cè)序數(shù)據(jù)的增加，曲線的斜率逐漸變小，說(shuō)明更多的取樣只會(huì)產(chǎn)生少量新的物種。本試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析選擇測(cè)序數(shù)量為10000條，此時(shí)曲線斜率變小，基本能夠反映物種的豐富度，說(shuō)明取樣數(shù)量合理。

圖1　稀釋曲線Fig.1 Dilution curve

2.1豐度及多樣性評(píng)估

ACE指數(shù)和Chao指數(shù)用于估算樣本中含有的OTU數(shù)目，即所含物種的總數(shù)。由表1可以看出：S2處理的ACE指數(shù)、Chao指數(shù)均大于S1處理的ACE指數(shù)、Chao指數(shù)；S4處理的ACE指數(shù)大于S3處理的ACE指數(shù)，S4處理的Chao指數(shù)小于S3處理的Chao指數(shù)。S2、S3、S4、S1的Shanon指數(shù)依次減小。OTU數(shù)由S3、S2、S4、S1依次減小。

表1　樣本的多樣性指數(shù)（97%相似水平）Table 1 The community index (97%similarity level)

Shannon指數(shù)是用來(lái)估算樣品中微生物的多樣性指數(shù)之一，它常用來(lái)反映α-多樣性。Shannon值越大，說(shuō)明群落多樣性越高。S2、S3、S4、S1的Shanon指數(shù)依次減小說(shuō)明添加多抗菌劑的非根際土群落多樣性最低，添加多抗菌劑的根際土S4的群落多樣性要低于未添加多抗菌劑的根際土S3。

2.2分類統(tǒng)計(jì)

對(duì)測(cè)序得到的OTU結(jié)果進(jìn)行分析可知，S1、S2、S3、S4四個(gè)樣品中檢測(cè)到細(xì)菌門數(shù)分別為30、29、23、26；細(xì)菌綱數(shù)分別為62、65、55、51；細(xì)菌目數(shù)分別為98、98、87、78；細(xì)菌科數(shù)分別為155、152、139、131；細(xì)菌屬數(shù)分別為225、235、234、210。在綱、目、科、屬水平均表現(xiàn)出施多抗菌劑的樣品要小于未施用樣品，其中在綱水平上S1比S2減少4.62%，S4比S3減少7.27%。

圖2　樣本的群落結(jié)構(gòu)相對(duì)豐度（門水平）Fig.2 The relative abundance of bacterial in phylum level

由圖2可以看出：在四個(gè)植煙土壤樣品中變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、厚壁菌門（Firmicutes）所占比例較高，在S1、S2、S3、S4中分別占93.9%，96.4%，97.4%、98.0%。其中芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）和厚壁菌門（Firmicutes）在根際土和非根際土中的分布存在差異。芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）在非根際土S1中約占2.9%，S2中占3.5%，而在根際土S3中只占1.85%，S4中占1.49%；厚壁菌門（Firmicutes）在根際土S3中約占4.6%，S4中占3.3%，而在非根際土S1中占1.3%，S2中占3.0%。

四個(gè)樣品中存在各自特有的門，樣品S1中特有的菌門：螺旋體門（Spirochaetes)；樣品S2中特有的菌門：軟壁菌門（Tenericutes）；樣品S4中特有的菌門：LCP-89。在非根際土樣品(S1&S2)中特有的菌門：脫鐵桿菌門（Deferribacteres）、GN04、Synergistetes；根際土樣品(S3&S4)中特有的菌門：纖維桿菌門（Fibrobacteres）。

對(duì)四個(gè)樣品中含量最高的變形菌門（Proteobacteria）進(jìn)行綱水平分析，其中α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）含量最高，S1、S2、S3、S4所占比例分別為66.9%、69.1%、50.3%、63.9%。γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）在根際土中的含量較高，添加多抗菌劑的處理為27.05%，未添加多抗菌劑的處理為31.63%；而在非根際土中添加多抗菌劑的處理為11.01%，未添加多抗菌劑的處理為10.68%。在未添加多抗菌劑的處理S2和S3中存在特有的綱：非根際土S2中為TA18以及一個(gè)尚未確定的綱；根際土S3中為ε-變形菌綱（Epsilonproteobacteria）。

2.3β多樣性評(píng)估

由圖3可以看出：樣品S1中的OTU數(shù)為4249，樣品S2中的OTU數(shù)為5332，樣品S3中的OTU數(shù)為4997，樣品S4中的OTU數(shù)為4356。非根際土中，添加多抗菌劑的處理S1的OTU數(shù)目比未添加多抗菌劑的處理S2的OTU數(shù)目減少20.31%；根際土中，添加多抗菌劑的處理S4的OTU數(shù)目比未添加多抗菌劑的處理S3的OTU數(shù)目減少12.83%。

樣品S1中特有的OTU數(shù)為1592，樣品S2中特有的OTU數(shù)為2763，樣品S3中特有的OTU數(shù)為1939，樣品S4中特有的OTU數(shù)為1578。樣品S1和S2共有的OTU數(shù)為1694；樣品S3和S4共有OTU數(shù)為2012；樣品S1和S4共有OTU數(shù)為1454；樣品S2和S3共有OTU數(shù)為1523。

相似水平為97%時(shí)的OTU數(shù)可以代表菌種數(shù)目。樣品S2、S3、S4、S1所含有的總OTU數(shù)目依次減小說(shuō)明施用多抗菌劑后菌種數(shù)目減少。施用多抗菌劑后特有OTU也呈現(xiàn)減少趨勢(shì)。添加多抗菌劑的非根際土S1的OTU數(shù)目的減少幅度達(dá)到20.31%。添加多抗菌劑的根際土S4的OTU數(shù)目減少幅度為12.83%。

圖3　樣品共有和特有的OTU數(shù)目（97%相似水平）Fig.3 The amount of commom and peculiar OTU in four samples (97% similarity level)

圖4　樣品的群落結(jié)構(gòu)相似度樹狀圖(97%相似水平)Fig.4 The tree of community structural similarity (97%similarity level)

比較多個(gè)樣品中OTU組成的差異及各OTU中含有的序列豐度，計(jì)算每個(gè)樣品在97%相似水平下的群落結(jié)構(gòu)相似度，可以從整個(gè)分類系統(tǒng)上全面了解樣品中所有微生物的進(jìn)化關(guān)系和豐富度差異。由圖4可以看出樣品S1和S2屬于同一分支距離比較近，樣品S3和S4屬于同一分支距離比較近。說(shuō)明非根際土樣品S1和S2群落結(jié)構(gòu)相似，根際土樣品S3和S4群落結(jié)構(gòu)相似。樣品S2和樣品S3雖然不在同一分支，但是距離較近，群落結(jié)構(gòu)也較為相似。

由圖5 HeatMap熱圖分析可以看出樣品S1和樣品S2聚在一起，相似度極高，樣品S3和樣品S4聚在一起，相似度較高。在HeatMap圖中顏色的變化，表明物種豐度不同。樣品S1和S2在土壤桿菌目（Solirubrobacterales）、Syntrophobacterales、酸桿菌目（Acidobacteriales）、Solibacterales、Saprospirales、鞘脂單胞菌目（Sphingomonadales）、放線菌目(Actinomycetales)豐度上存在差異，S1 中Solibacterales、Solirubrobacterales、酸桿菌目（Acidobacteriales）、放線菌目(Actinomycetales)、鞘脂單胞菌目（Sphingomonadales）豐度較低。樣品S3和S4中Solibacterales、假單胞菌目（Pseudomonadales）、Syntrophobacterales、Ellin329、Saprospirales、放線菌目（Actinomycetales）豐度差異明顯。在樣品S4中均表現(xiàn)出豐度較低。

圖5　樣本的聚類分析圖（目水平）Fig.5 The clustering analysis of bacterial in order level

3　結(jié)論與討論

土壤微生物群落多樣性是土壤微生物活性指標(biāo)中最重要的因素，與土壤生態(tài)穩(wěn)定密切相關(guān)。土壤群落能夠在結(jié)構(gòu)上對(duì)環(huán)境變化做出及時(shí)響應(yīng)[7]。有研究表明在棉花連作土壤中施用棉花黃萎病拮抗菌和相應(yīng)的有機(jī)肥能夠使土壤中真菌數(shù)量減少，細(xì)菌和放線菌數(shù)量增加，細(xì)菌增加7.3~13.4倍[14]。本試驗(yàn)中樣品S3和S4的ACE指數(shù)和Chao指數(shù)的比較表現(xiàn)出來(lái)的趨勢(shì)存在差異，可能是因?yàn)閮蓚€(gè)指數(shù)的算法不同，造成試驗(yàn)了結(jié)果上的差別。結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)施用多抗菌劑的土壤要比未施用多抗菌劑的土壤中細(xì)菌種類少，其可能原因是施用的多抗菌劑主要用來(lái)防治煙草青枯病，而青枯病的病原菌屬于細(xì)菌，生防菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)可能會(huì)對(duì)與病原菌親緣關(guān)系較近的菌產(chǎn)生拮抗作用。在施用多抗菌劑的土壤中，根際土的細(xì)菌數(shù)量要比非根際土的細(xì)菌數(shù)量少，這可能是由于多抗菌菌劑是灌根施用，集中在煙株的根部，能夠在根部局布范圍內(nèi)定殖，在煙株根際發(fā)揮作用，抑制了其他細(xì)菌的定殖，還有可能是多抗菌劑誘導(dǎo)煙草在根部產(chǎn)生某些物質(zhì)，影響部分細(xì)菌的定殖。

綜上所述，施用多抗菌劑可以改變煙草土壤中細(xì)菌群落多樣性，施用多抗菌劑后植煙土壤中細(xì)菌群落多樣性降低，同時(shí)煙株根際土的細(xì)菌多樣性要低于煙株非根際土。

參考文獻(xiàn)

[1] Hayward AC.Biology and epidemiology of bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum[J].Annu Rev Phytopathol, 1991,29:65-87

[2]番華彩,唐嘉義,秦小萍.煙草青枯病防治研究進(jìn)展[J].云南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2008,30(S1):31-35

[3]徐輝,熊霞.煙草青枯病防治技術(shù)研究進(jìn)展[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué),2009(4):91-93,94

[4]劉雅婷,張世光.煙草青枯病的研究進(jìn)展[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2001,16(1):72-76

[5]馬國(guó)勝,高智謀,陳娟.煙草黑脛病研究進(jìn)展[J].煙草科技,2001(9):44-48

[6]劉艷霞,李想,曹毅.抑制煙草青枯病型生物有機(jī)肥的田間防效研究[J].植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào),2014,20(5):1203-1211

[7]余悅.黃河三角洲原生演替中土壤微生物多樣性及其與土壤理化性質(zhì)關(guān)系[D].濟(jì)南:山東大學(xué),2012

[8]程凱,江歡歡,沈標(biāo),等.棉花黃萎病拮抗菌的篩選及其生物防治效果[J].植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào),2011,17(1):166-174

[9]彭科峰,曹立群,吳韶平,等.DGGE和T-RFLP在堆肥微生物群落結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用[J].生物信息學(xué),2007,5:31-33

[10]羅佳捷,李麗立,張彬.T-RFLP技術(shù)及其在微生物群落結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2009,36(7):75-78

[11]賈俊濤,宋林生,李筠.T-RFLP技術(shù)及其在微生物群落結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用[J].海洋科學(xué),2004,28(3):64-68

[12]華蔚穎,徐昭,張夢(mèng)暉.CVTree在454高通量測(cè)序分析菌群結(jié)構(gòu)中的應(yīng)用[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,2010,22(4):312-316

[13]李橋,王龍龍.454高通量測(cè)序技術(shù)在土壤微生物中的應(yīng)用[J].綠色科技,2013(8):203-205

[14]張慧,楊興明,冉煒.土傳棉花黃萎病拮抗菌的篩選及其生物效應(yīng)[J].土壤學(xué)報(bào),2008,45(6):1095-1101

**通訊作者:Author for correspondence. E-mail:du_binghai@163.com

The Effect of Multiple Antimicrobial Inoculant on the Bacterial Community Diversity in Tobacco Planting Soil

ZHANG Zhong-min1, LIU Hu2*, DENG Yan-qin2, NAN Long2, WANG Chengqiang2, WANG Jun2, GUO Hai-meng2, DU Bing-hai2**

1. Jining University, Qufu 273155, China
2. CollegeofLifeSciences/ShandongAgriculturalUniversity/ShandongKeyLaboratoryofAgriculturalMicrobiology,Taian271018,China

Abstract:We used 454 pyrophosphate sequencing approach to analyze the bacterial com-munity structure of the tobacco planting soils with multiple antimicrobial inoculant. The results showed that the bacterium in tobacco planting soil which was detected in this experiment belong to five phyla. They are Proteobacteria, Actinobacteria, Acidobacteria, Gemmatimonadetes, Firmicutes compared with rizosphere soil without using multiple antimicrobial inoculants, the number of class which belonged to rhizosphere soil with multiple antimicrobial inoculant reduced 7.27%, and the number of OTU reduced 12.83%. Compared with non-rizosphere soil without using multiple antimicrobial inoculants, the number of class which belonged to non-rhizosphere soil with multiple antimicrobial inoculant reduced 4.62%, and the number of OTU reduced 20.31%. Obviously, multiple antimicrobial inoculantis can lead the decrease in microbial diversity of tobacco planting soil.

Keywords:Tobacco planting soil; bacterial community diversity; 454 pyrophosphate sequencing; multiple antimicrobial inoculant

作者簡(jiǎn)介:張忠民(1978-),男,碩士,講師,主要從事生物學(xué)教學(xué)與研究. E-mail:317291125@qq.com

基金項(xiàng)目:湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司科技項(xiàng)目(2011-yc-0002)

收稿日期:2014-06-23修回日期: 2014-07-02

中圖法分類號(hào):S154.37

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1000-2324(2015)04-0528-05