鮮牛乳及乳制品中4種雌激素含量的HPLC測定

譚欣同,鄧立剛,趙善倉,董燕婕,王燕,李增梅*

1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東泰安2710182.山東農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所,山東濟(jì)南2501003.山東省食品質(zhì)量與安全檢測技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東濟(jì)南250100

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鮮牛乳及乳制品中4種雌激素含量的HPLC測定

譚欣同1,鄧立剛2,3,趙善倉2,3,董燕婕2,3,王燕1,李增梅2,3*

1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東泰安271018
2.山東農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所,山東濟(jì)南250100
3.山東省食品質(zhì)量與安全檢測技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東濟(jì)南250100

摘要:本文建立了鮮牛乳及奶粉中4種雌激素（17β-雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌酚）的HPLC分析方法。奶粉樣品溶解于水，QuEChERS方法萃取，用乙腈沉淀蛋白質(zhì)并提取雌激素，正己烷除脂，經(jīng)氨基柱凈化，C18色譜柱分離，采用紫外檢測器，檢測波長為230 nm。該方法對鮮牛乳及奶粉中17β-雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌酚的檢出限（S/N=3計(jì)）分別為0.03 mg/kg、0.026 mg/kg、0.03 mg/kg、0.012 mg/kg和0.024 mg/kg、0.021 mg/kg、0.025 mg/kg、0.01 mg/kg。定量限（以S/N=10計(jì)）分別為0.1 mg/kg、0.09 mg/kg、0.1 mg/kg、0.04 mg/kg和0.07 mg/kg、0.07 mg/kg、0.08 mg/kg、0.03 mg/kg在0.1、1.0、2.0 mg/kg三個(gè)濃度水平添加的平均回收率在81%~97%的范圍內(nèi)，RSD值在3.2%~8.7%之間。

關(guān)鍵詞:鮮牛乳;奶粉;雌激素; QuEChERS; HPLC

牛奶及其乳制品是人們生活中重要的食品之一，因其富含蛋白質(zhì)、維生素、鈣質(zhì)及其它人體所需的營養(yǎng)素，倍受人們青睞[1]。奶粉作為重要的奶制品之一更是嬰幼兒和老年人的重要營養(yǎng)來源，其質(zhì)量安全問題極為重要。然而，近幾年來不斷發(fā)生的乳制品安全事件，使得人們“談奶色變”。2013年圣元奶粉導(dǎo)致嬰幼兒性早熟事件的發(fā)生，使人們普遍意識(shí)到奶粉中的激素水平是關(guān)系到奶粉安全的一個(gè)重要因素。有研究表明，兒童性早熟，婦女乳腺癌和男性前列腺癌的發(fā)病率的上升和食品中的雌激素的殘留有關(guān)[2,3]。在中華人民共和國農(nóng)業(yè)部發(fā)布的第235號公告中，修訂了《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》，其中規(guī)定雌二醇、己烯雌酚等雌激素在任何動(dòng)物性食品中不允許添加和檢出[4,5]。在歐盟CAC(國際食品法典委員會(huì))發(fā)布的《Maximum Residue Limits for Veterinary Drugs in Food》中，規(guī)定在牛的肌肉、肝臟、脂肪中不得檢出17β-雌二醇。生鮮牛乳作為原料乳，其質(zhì)量安全直接影響了奶粉質(zhì)量。但在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)動(dòng)下，養(yǎng)殖戶們?yōu)樘岣吣膛５漠a(chǎn)奶量，濫用這類違規(guī)藥物，易導(dǎo)致奶牛體內(nèi)雌激素分泌異常，從而使生鮮牛乳中的雌激素含量升高，存在風(fēng)險(xiǎn)隱患。

目前國家新近制定的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)乳粉》中，并沒有關(guān)于檢測雌激素項(xiàng)目的規(guī)定，這就意味著目前我國對雌激素的檢測和控制存在盲區(qū)，可能導(dǎo)致雌激素的泛濫[6]。

目前，國內(nèi)外檢測牛奶或者奶粉中的雌激素方法較多，其中放射免疫法[7]和酶聯(lián)免疫法[8]等生物技術(shù)雖然具有操作簡單，適合大批量的測定，靈敏度較高等優(yōu)點(diǎn)，但是容易出現(xiàn)相互影響，造成污染，樣品導(dǎo)致假陽性率偏高。此外還有氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[9]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[10]和高效液相色譜法[11]等方法。

QuEChERS方法是由美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究服務(wù)中心開發(fā)的一種快速、簡便、價(jià)格低廉、環(huán)境友好的預(yù)處理方法，是實(shí)驗(yàn)室大規(guī)模樣品處理較理想的方法，有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值[12]。QuEChERS方法常用于農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的檢測，研究證明有超過200種農(nóng)藥可以用此法分析[13]。本研究采用QuEChERS方法萃取，結(jié)合SPE凈化處理樣品，HPLC分析。實(shí)驗(yàn)方法簡便、快速、可操作性強(qiáng)且液相色譜法的普及率較高，此方法可適用于生鮮牛乳和奶粉中雌激素水平含量的分析。

1　材料與方法

1.1樣品的采集

奶粉樣品為進(jìn)口的某品牌嬰幼兒奶粉，購于超市；生鮮牛乳樣品采集于濟(jì)南市12個(gè)不同的生鮮牛乳收購站或奶牛養(yǎng)殖場。

1.2儀器與試劑

2.2.1儀器Waters2695高效液相色譜儀配2489紫外檢測器（美國waters公司）；Heidolph L4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Heidolph公司)；3K30型高速旋轉(zhuǎn)離心機(jī)(美國sigma公司)；IKA-MS3渦旋振蕩器(德國IKA工業(yè)設(shè)備公司)；KQ-500E超聲波提取器(昆山市超生儀器有限公司)；0.22μm有機(jī)濾膜(美國Pall公司)；彩色單道移液槍（100~1000μL）(德國Eppendorf有限公司)；彩色單道移液槍（10~100 μL）(德國Eppendorf有限公司)；氨基固相萃取小柱；旋蒸瓶；離心管、膠頭滴管。

2.2.2試劑17β-雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌酚固體標(biāo)準(zhǔn)品（純度>99%，德國DR公司）；乙腈（分析純、色譜純）、蒸餾水、乙酸銨（優(yōu)級純）、正己烷、二氯甲烷、氯化鈉、乙酸乙酯、無水硫酸鎂。

以上試劑除標(biāo)明外，其他均為分析純。

2.2.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱取10.0 mg標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解后定容，此時(shí)標(biāo)準(zhǔn)液濃度為100 mg/kg;使用前用甲醇稀釋成10 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)使用液。另外，用甲醇分別稀釋為0.1、0.5、1.0、2.0、2.5、10.0 mg/kg標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3色譜條件

色譜柱：Waters Atlantis dC18不銹鋼柱（4.6×250 mm，i.d 5 μm）；檢測波長：230 nm；柱溫：40℃；流動(dòng)相：水（A）：乙腈(B)；梯度洗脫程序：0～7 min，70%～50% A；7～20 min，保持50% A；20～21 min，50%～70%A;流速：1.0 mL/min;進(jìn)樣量：10μL。

2.4樣品處理

2.4.1奶粉樣品處理稱取奶粉樣品10 g（精確到0.01 g）于100 mL具塞塑料離心管中，加入15 mL去離子水，充分振搖2 min使奶粉充分溶解，加入40 mL乙腈，振搖2 min，超聲提取10 min，然后加入5 g QuEChERS鹽析劑（4 g無水硫酸鎂，1 g氯化鈉），高速振搖，以8000 r/min離心12 min，取上清液20 mL至50 mL離心管中，加入20 mL用乙腈飽和過的正己烷。振蕩后靜置分層，除去上層正己烷，再重復(fù)操作一次。將離心管內(nèi)的乙腈層轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶內(nèi)，以40°C旋蒸近干，用2 mL二氯甲烷：甲醇（95:5, V/V）溶解，待凈化。

2.4.2生鮮牛乳樣品處理準(zhǔn)確稱取生鮮牛乳樣品10 g（精確到0.01 g）于50 mL具塞塑料離心管中，加入20 mL乙腈，震搖2 min，超聲提取10 min，加入3 gQuEChERS鹽析劑（2.5 g無水硫酸鎂，0.5 g氯化鈉），高速振搖，以8000 r/min離心12 min，取上清液10 mL至50 mL離心管中，加入10 mL用乙腈飽和過的正己烷。充分震搖后靜置分層，除去上層正己烷，再重復(fù)操作一次。將離心管內(nèi)的乙腈層轉(zhuǎn)入旋蒸瓶內(nèi)，以40°C旋蒸近干，用2 mL二氯甲烷：甲醇（95:5, V/V）溶解，待凈化。

2.4.3凈化預(yù)先用10 mL二氯甲烷：甲醇（95:5, V/V）活化平衡氨基柱后，將上述待凈化液上柱，再用15 mL二氯甲烷：甲醇（95:5, V/V）洗脫，流速控制在約2 mL/min。將待凈化液與洗脫液一起收集于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶內(nèi)，以40°C旋蒸近干，用1 mL的色譜甲醇定容，過0.22μm有機(jī)濾膜，待上機(jī)分析。

3　結(jié)果與分析

3.1色譜條件的優(yōu)化

本研究分別考察了Waters Atlantis dC18柱（4.6×250 mm，i.d 5 μm）、Waters SunFireTMC18柱(4.6×150 mm，i.d 5 μm)和Waters Atlantis dC18柱（4.6×150 mm，i.d 5 μm）三根色譜柱對4種雌激素的分離效果，由于雌三醇的極性較強(qiáng)，在兩根不同型號的150 mm的C18色譜柱上，雌三醇在色譜柱上難以保留；實(shí)驗(yàn)表明，在流動(dòng)相中添加10 mmol/L乙酸銨時(shí)，四種雌激素的靈敏度下降約20%～30%之間；當(dāng)乙腈：水（50:50，V/V）作流動(dòng)相時(shí)，無法實(shí)現(xiàn)與樣品雜質(zhì)的完全分離，通過優(yōu)化洗脫梯度，可解決這一問題。優(yōu)化后的梯度洗脫程序見2.2小節(jié)。17β-雌二醇、雌酮、雌三醇均在在230 nm和280 nm處有較強(qiáng)的紫外吸收，己烯雌酚在220 nm～260 nm有較強(qiáng)的紫外吸收。本實(shí)驗(yàn)選擇了220 nm、230 nm、280 nm三個(gè)檢測波長進(jìn)行分別測試，結(jié)果表明四種雌激素在230 nm處有良好的峰型并能排除雜質(zhì)干擾。優(yōu)化后的色譜圖分離度好，且具有峰窄，無拖尾，重現(xiàn)性好的特點(diǎn)。4種雌激素的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖(圖1)。

3.2樣品前處理的優(yōu)化

QuEChERS[12]的提取方法常用QuEChERS鹽吸劑（4 g無水硫酸鎂，1 g氯化鈉）促使水與乙腈快速分層，實(shí)現(xiàn)有機(jī)物的快速溶劑萃取，本實(shí)驗(yàn)采用這種液液萃取的方法提取四種雌激素，四種雌激素的添加回收率均在81%～97%之間，平均回收率為88%。較于直接用乙腈或者甲醇單獨(dú)提取四種雌激素，添加回收率有了明顯的提高(圖2)。

圖1　4種雌激素標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖（5 mg/kg）Fig.1 HPLC of 4 estrogen standards（5 mg/kg）

圖2　三種不同提取方法的回收率比較Fig.2 Comparison among recovery rates of 3 different methods

對于凈化洗脫液的選擇：本試驗(yàn)選用乙酸乙酯-甲醇（90:10，V/V）的混合液和二氯甲烷-甲醇（95:5，V/V）的混合液進(jìn)行氨基柱活化與洗脫。實(shí)驗(yàn)中探究了兩種不同的洗脫液對凈化的影響，發(fā)現(xiàn)用乙酸乙酯-甲醇（90:10，V/V）活化洗脫奶粉樣品后，在雌三醇峰圖附近存在一個(gè)干擾極強(qiáng)的雜質(zhì)峰，嚴(yán)重影響雌三醇的定量分析。而使用二氯甲烷-甲醇（95:5，V/V）的混合液凈化處理，無論是奶粉樣品還是生鮮牛乳樣品，均有很好的凈化效果。故本實(shí)驗(yàn)使用二氯甲烷-甲醇（95:5，V/V）凈化樣品。用10 mL~20 mL洗脫液進(jìn)行洗脫實(shí)驗(yàn)，當(dāng)洗脫液為15 mL時(shí)，回收率達(dá)到最大值97%，且后5 mL的洗脫液中4種雌激素均未檢出，由此最終確定洗脫液的體積為15 mL。

3.3線性范圍和檢出限

用0.5~10.0 mg/kg的四種雌激素標(biāo)準(zhǔn)溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖3，峰面積Y(μV*sec)與其質(zhì)量X(ng)具有良好的線性關(guān)系，R均大于0.999。以3倍信噪比（S/N=3）對應(yīng)的奶粉和生鮮牛乳樣品中雌激素濃度作為檢出限(LOD),10倍信噪比(S/N=10)對應(yīng)的樣品中雌激素作為定量限(LOQ)，算得四種雌激素的檢出限和定量限。所得結(jié)果見表1。

表1　線性方程、線性相關(guān)系數(shù)及4種雌激素在奶粉中和生鮮牛乳中的檢出限和定量限Table1 The liner equation, correlation coefficient, LOD and LOQ of 4 estrogens in milk powder and fresh milk

3.4奶粉與生鮮牛乳樣品的添加回收實(shí)驗(yàn)

在奶粉和生鮮牛乳中添加三種濃度水平（0.1 mg/kg，1.0 mg/kg和2.0 mg/kg）的4種雌激素，每個(gè)平行重復(fù)5次，進(jìn)樣分析并計(jì)算回收率和精密度，結(jié)果見表2，平均回收率為81.3%~97.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.2%~8.7%。添加回收圖譜(圖3-6)。

表2　生鮮牛乳和奶粉中雌激素的添加回收實(shí)驗(yàn)Table 2 The average recovery and RSD in fresh milk and powder

通過上述數(shù)據(jù)可以得出：隨著添加量的增加，奶粉和生鮮牛乳中的平均回收率升高，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值減?。簧r牛乳的平均回收率高于奶粉，且檢出限更低，原因可能是相對于生鮮牛乳，奶粉的成分較為復(fù)雜，且脂肪含量較高，通過凈化以后仍然存在較多的雜質(zhì)干擾，所以出現(xiàn)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖3　空白樣品色譜圖Fig.3 The chromatography of blank samples

圖4　空白樣品添加激素后色譜圖（0.1 mg/kg）Fig.4 The chromatography of blank milk powder samples after adding 4 estrogens（0.1 mg/kg）

圖5　鮮牛乳空白樣品色譜圖Fig.5 The chromatography of blank fresh milk sample

圖6　鮮牛乳添加激素樣品色譜圖(0.1 mg/kg)Fig.6 The chromatography of blank fresh milk samplesafter adding 4 estrogens（0.1 mg/kg）

3.5實(shí)際樣品的測定

對購買的貝因美品牌的奶粉用上述方法進(jìn)行分析，未檢出上述4種雌激素的殘留。對從濟(jì)南不同奶站采集回來的12個(gè)生鮮牛乳樣品進(jìn)行分析，其中一個(gè)生鮮牛乳樣品檢測出含有雌酮，含量是0.045 mg/kg，其他樣品均為檢出。

4　結(jié)論

本研究采用了QuEChERS法提取、結(jié)合傳統(tǒng)的SPE凈化，HPLC分析的方法，分析了奶粉和生鮮牛乳中不同性質(zhì)的4種雌激素，該方法實(shí)現(xiàn)了4種雌激素的快速分離，增強(qiáng)了4種雌激素的定性能力，方法的回收率高，重現(xiàn)性好。同時(shí)發(fā)現(xiàn)了生鮮牛乳中存在著雌激素超標(biāo)的現(xiàn)象。發(fā)現(xiàn)了奶粉乃至其他乳制品當(dāng)中雌激素可能的來源，這對奶粉及其他乳品企業(yè)有一定的預(yù)警和指導(dǎo)作用。

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Determination on 4 Estrogens Content in Fresh Milk and Dairy Products by HPLC

TAN Xin-tong1, DENG Li-gang2,3, ZHAO Shan-cang2,3, DONG Yan-jie2,3, WANG Yan1, LI Zeng-mei2,3*

1College of Food Scienceand Engineering/Shandong Agricultural University,Tai’an 271018, China
2. InstituteofAgriculturalQualityStandardsandTestingTechnologyResearch,ShandongAcademyofAgriculturalSciences,Jinan250100,China
3. KeyLaboratoryof TestTechnologyon FoodQualityand Safetyof Shandong Province,Jinan 250100,China

Abstract:A novel method for the determination of 4 estrogens（17β-estradiol，Estriol，Estrone and Diethylstilbestrol）in raw milk and milk powder has been developed by HPLC. The milk powder was dissolved in water and then it was extracted with acetonitrile by QuEChERS method and purified by NH2solid phase extraction cartridge after fats were removed by hexane. The analyte was separated on a C18column (Waters Atlantis dC18,4.6×250 mm，i.d 5 μm) at UV 230 nm. The detection limits(S/N=3) of 17β-estradiol, estriol, estrone and diethylstilbestrol in milk powder and fresh milk were 0.03 mg/kg, 0.026 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.012 mg/kg and 0.024 mg/kg, 0.021 mg/kg, 0.025 mg/kg, 0.01 mg/kg, respectively. The quantitation limit(S/N=10) in milk powder and raw milk were 0.1 mg/kg, 0.09 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.04 mg/kg and 0.07 mg/kg, 0.07 mg/kg, 0.08 mg/kg, 0.03 mg/kg, respectively. The recoveries were 81%~97% with the range of RSD from 3.2% to 8.7%.

Keywords:Fresh milk; milk powder; estrogen; QuEChERS; HPLC

*通訊作者:Author for correspondence. E-mail:lizengmei78@163.com

作者簡介:譚欣同(1990-),男,碩士研究生,主要從事食品質(zhì)量與安全工作. E-mail:tanxintong142536@163.com

基金項(xiàng)目:公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))項(xiàng)目(201403071);山東省科技發(fā)展計(jì)劃(20070917214和20100814601)

收稿日期:2015-04-11修回日期: 2015-06-22

中圖法分類號:TS252.51;O657.7+2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號:1000-2324(2015)04-0519-05