3′-U3區(qū)堿基突變不影響禽白血病病毒的體外復(fù)制能力

高雁怩，高 奇，李曉菲，贠炳嶺，祁小樂(lè)，王永強(qiáng)，劉長(zhǎng)軍，崔紅玉，張艷萍，高宏雷，王笑梅，高玉龍

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室禽免疫抑制病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，哈爾濱150001）

禽白血病病毒屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科，禽C型反轉(zhuǎn)錄病毒屬，俗稱禽C型腫瘤病毒。根據(jù)病毒的宿主范圍、囊膜特性、交叉中和試驗(yàn)及其他特性，可將禽白血病病毒分為6個(gè)亞群，即A、B、C、D、E和J亞群禽白血病病毒。同時(shí)，根據(jù)傳播方式的不同，禽白血病病毒也可分為外源性白血病病毒（A、B、C、D和J亞群）和內(nèi)源性白血病病毒（E亞群）。J亞群禽白血病病毒（J subgroup avian leukosis virus，ALV-J）是在1988年由英國(guó)科學(xué)家L.N.Payne于肉用型雞群中首次分離得到［1］，此后ALV-J在世界范圍內(nèi)流行，給世界養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。中國(guó)于1999年首先在肉雞中分離出ALV-J，隨后在2004年首次報(bào)道蛋雞自然感染ALV-J［2-3］。

在2004年以前，中國(guó)的ALV-J感染主要在肉雞中流行，但自2004年后，在蛋雞以及多種地方品系雞中也發(fā)現(xiàn)了ALV-J的自然感染病例并分離得到病毒［4-5］，特別是2009年后，該病在蛋雞群中的影響進(jìn)一步擴(kuò)大。有報(bào)道稱ALV-J感染蛋種雞群后可引起高達(dá)60%的發(fā)病率和最多超過(guò)20%的死亡率。同時(shí)，ALV-J的感染還引起了多種腫瘤的發(fā)生，并在全國(guó)范圍內(nèi)引起商品化蛋雞和地方種雞的生產(chǎn)下降等問(wèn)題［2，6-7］。

ALV-J具有典型慢轉(zhuǎn)化復(fù)制完全型白血病病毒的整體結(jié)構(gòu)，即5′-LTR-gag-pol-env-3′LTR［8］。其LTR區(qū)域是病毒復(fù)制過(guò)程的重要調(diào)節(jié)區(qū)域，在病毒的翻譯和RNA的復(fù)制過(guò)程中起著重要的作用。LTR由U3-R-U5三部分組成，其中U3的作用最為重要。U3區(qū)含有多種順勢(shì)作用元件，如CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合元件等，可與細(xì)胞內(nèi)反式作用因子結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控病毒的復(fù)制，轉(zhuǎn)錄等重要生命過(guò)程。gag、pol和env基因則分別編碼ALV-J的衣殼蛋白、反轉(zhuǎn)錄酶及囊膜蛋白。

近幾年，ALV-J的流行毒株與其原型毒株HPRS-103的基因組序列比較顯示，ALV-J的流行毒株的基因組序列出現(xiàn)一些與其致病性密切相關(guān)的特征性突變。例如，其r TM缺失205個(gè)堿基，E元件序列的缺失都是ALV-J在其進(jìn)化過(guò)程中自然發(fā)生的序列突變，并且某些這類突變能夠增強(qiáng)病毒本身的致病力［10-11］。最近，本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)分析ALV-J蛋雞分離株的序列特點(diǎn)，在其U3區(qū)域發(fā)現(xiàn)了很多特異性且有規(guī)律的突變［7，11］。為了驗(yàn)證這些特異性的突變是否能夠?qū)Σ《镜纳飳W(xué)特性造成影響，我們構(gòu)建了ALV-J的原型毒株HPRS-103的感染性克隆，同時(shí)構(gòu)建了以HPRS-103原型毒株為骨架，替換上具有特征性突變的蛋雞分離株SD09DP04的U3區(qū)嵌合病毒的感染性克隆，拯救出2株病毒，并對(duì)拯救出的嵌合病毒的生物學(xué)特性進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 病毒株、細(xì)胞、載體和菌種

ALV-J病毒株SD09DP04由本實(shí)驗(yàn)室分離保存［12］；ALV-J原型毒株HPRS-103基因組全長(zhǎng)已經(jīng)克隆到p UC19載體上，該質(zhì)粒命名為p UC19-HPRS-103，由英國(guó)Pirbright研究所病毒性腫瘤病實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；DF-1細(xì)胞由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存，用于病毒的拯救和增殖；pBlueScript II KS（＋）載體和DH5α菌種由筆者所在課題組保存。

1.2 主要試劑

各種限制性內(nèi)切酶、PrimeSTARTMHS DNA Polymerase、DNA Marker、d NTP、T4DNA連接酶、PUC19空載體等購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；FITC標(biāo)記的抗鼠IgG熒光抗體、pGL3 Luciferase Reporter Vectors檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Sigma公司；脂質(zhì)體（LipfectamineTM2000）購(gòu)于GiBcoBRL公司；質(zhì)粒提取試劑盒、核酸凝膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司；Plasmid Mini Kits為QIAGEN公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄酶活性檢測(cè)試劑盒為Roche公司產(chǎn)品；ALV-J的p27蛋白單克隆抗體為本實(shí)驗(yàn)室保存［13］。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)ALV-J原型株HPRS-103在GenBank中的序列設(shè)計(jì)3對(duì)特異引物，用以擴(kuò)增病毒的前病毒基因組。同時(shí)，根據(jù)構(gòu)建3′-U3區(qū)嵌合病毒的需要設(shè)計(jì)融合PCR所需引物。引物序列見(jiàn)表1。

1.4 融合PCR

用DNA凝膠回收試劑盒回收以質(zhì)粒HPRS-103為模板，R1-F、R1-R這對(duì)引物擴(kuò)增的特異片段R1（2 333 bp），R2-F、R2-R這對(duì)引物擴(kuò)增的特異片段R2（99 bp）。膠回收以質(zhì)粒SD09DP04為模板，R3-F、R3-R這對(duì)引物擴(kuò)增的特異片段R3（226 bp）。將R1、R2、R3做融合PCR，得到2 658 bp的片段，命名為A-DPU3備用。

1.5 嵌合病毒HPRS-103ΔDPU3株感染性克隆構(gòu)建

以KpnⅠ和SacⅠ雙酶切凝膠回收的融合PCR產(chǎn)物A-DPU3及空載體p UC19，經(jīng)連接和轉(zhuǎn)化后，挑取單克隆白色菌落進(jìn)行鑒定，陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為p UC19-A-DPU3；以BF、BR為引物，質(zhì)粒p UC19-HPRS-103為模板PCR擴(kuò)增B片段。以Hin dⅢ和HpaⅠ雙酶切凝膠回收的PCR產(chǎn)物和p UC19-A-DPU3，經(jīng)連接轉(zhuǎn)化后，挑取單克隆白色菌落進(jìn)行鑒定，陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為p UC19-ADPU3-B。以CF、CR為引物，質(zhì)粒p UC19-HPRS- 103為模板PCR擴(kuò)增C片段，以HpaⅠ和KpnⅠ雙酶切凝膠回收PCR產(chǎn)物及p UC19-A-DPU3-B，經(jīng)連接和轉(zhuǎn)化后，挑取單克隆白色菌落進(jìn)行鑒定，陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為p UC19-A-DPU3-B-C，即嵌合病毒HPRS-103ΔDPU3株感染性克隆。構(gòu)建策略如圖1。

表1 擴(kuò)增PBW-ALV-J前病毒基因組的引物Table 1 Primers used for amplification of PBW-ALV-J pri-DNA

圖1 嵌合病毒重組質(zhì)粒PUC19-A-DPU3-B-C構(gòu)建策略Fig.1 The diagram of the construction strategy about the recombinant plasmid PUC19-A-DPU3-B-C

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及病毒拯救

用QIAGEN公司的產(chǎn)品Plasmid Mini Kit分別純化p UC19-HPRS-103和p UC19-A-DPU3-B-C，由LipfectamineTM2000分別介導(dǎo)轉(zhuǎn)染約80%的單層DF-1細(xì)胞，同時(shí)以正常的DF-1為對(duì)照，轉(zhuǎn)染后6 h棄細(xì)胞上清，用只加雙抗的DMEM清洗兩遍，每孔加入2 m L含10%胎牛血清的加入雙抗的DMEM，在37℃溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染72 h后收毒，凍存于-80℃冰箱。反復(fù)凍融三次后連續(xù)在DF-1上傳代，經(jīng)鑒定后將拯救的病毒命名為r H-PRS-103和r HPRS-103ΔDPU3。

1.7 病毒粒子的鑒定

1.7.1 間接免疫熒光試驗(yàn) 將拯救的2株病毒按照常規(guī)方法接種于約70%單層DF-1的48孔板中，7 d后按常規(guī)方法進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)，檢測(cè)所用一抗為抗ALV-J p27蛋白的單克隆抗體，二抗為FITC標(biāo)記的兔抗鼠IgG抗體，同時(shí)設(shè)不接毒的DF-1細(xì)胞作為對(duì)照。

1.7.2 群特異性禽白血病病毒抗原檢測(cè) 使用禽白血病病毒抗原檢測(cè)試劑盒［13］，參照其試劑盒說(shuō)明書的具體步驟，對(duì)拯救的兩株病毒進(jìn)行檢測(cè)。

1.7.3 反轉(zhuǎn)錄酶檢驗(yàn) 用reverse transcriptase assay檢測(cè)病毒的反轉(zhuǎn)錄酶的活性，首先用PEG法處理接毒的細(xì)胞液，按照試劑盒說(shuō)明要求，對(duì)拯救的兩株病毒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄酶活性的檢測(cè)。

1.8 r HPRS-103和r HPRS-103ΔDPU3的U3區(qū)啟動(dòng)子活性、增強(qiáng)子活性差異檢測(cè)

將ALV-J實(shí)驗(yàn)室分離株SD09DP04和原型株HPRS-103的U3區(qū)分別克隆至p GL-Enhancer Vector或p GL-Promoter Vector（引物序列如下，DPU3F：AGCGGTACCAATGTAGTCTTATGCAATACTCT；DPU3R：AGCAAGCTTGTTTATTGTATCAAGCTAGG；103U3F：GCGGTACCAATGTAGTGTTATGCAATACTCT；103U3R：CGAAAGCTTGTTTATTGTGTCGGGCTA）。轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)。挑取單克隆，用Axygen質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒后測(cè)序鑒定正確，將質(zhì)粒命名為E-DPU3、E-103U3和P-DPU3、P-103U3，分別用于檢測(cè)比較U3區(qū)的啟動(dòng)子活性和增強(qiáng)子活性。用QIAGEN的Plasmid Mini Kits純化構(gòu)建好的4種質(zhì)粒，用LipfectamineTM2000分別介導(dǎo)轉(zhuǎn)染約80%的單層DF-1細(xì)胞的6孔板中，同時(shí)轉(zhuǎn)染p GL-Enhancer Vector或p GL-Promoter Vector作為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染后48 h按照p GL Luciferase Reporter Vectors試劑盒檢測(cè)說(shuō)明書進(jìn)行熒光檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)并分析數(shù)據(jù)。

1.9 r HPRS-103和r HPRS-103ΔDPU3復(fù)制動(dòng)力學(xué)的比較

將兩株拯救的病毒以1×102TCID50的病毒量接種鋪有單層的DF-1細(xì)胞的6孔板中（約1×106個(gè)細(xì)胞），感染后1、2、3、4、5、6、7 d分別取細(xì)胞上清，用禽白血病病毒抗原檢測(cè)試劑盒檢測(cè)p27，用于其復(fù)制動(dòng)力學(xué)比較，重復(fù)測(cè)定3次，取其平均值，繪制病毒的復(fù)制動(dòng)力學(xué)曲線。

2 結(jié) 果

2.1 ALV-J嵌合病毒重組質(zhì)粒的鑒定

用KpnⅠ、SacⅠ單酶切；Hin dⅢ和HpaⅠ雙酶切，鑒定重組質(zhì)粒p UC19-A-DPU3-B-C。酶切結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒p UC19-A-DPU3-B-C經(jīng)KpnⅠ、SacⅠ單酶切后，均為大小為10 695 bp的單一清晰條帶，而經(jīng)Hin dⅢ和HpaⅠ雙酶切后，則得到大小分別為2 957和7 738 bp的2條條帶（圖2）。同時(shí)將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒全長(zhǎng)測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示構(gòu)建成功。

圖2 感染性克隆p UC19-A-DPU3-B-C的酶切鑒定Fig.2 Enzyme identification of the infectious clone pUC19-A-DPU3-B-C

2.2 病毒粒子的鑒定

2.2.1 間接免疫熒光鑒定 r HPRS-103、r HPRS-103ΔDPU3的第5代病毒與抗ALV-J的p27蛋白的單克隆抗體均呈陽(yáng)性反應(yīng)。感染組DF-1細(xì)胞表面以及細(xì)胞質(zhì)有明顯的綠色熒光（圖3）。對(duì)照組DF-1細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有綠色熒光。該結(jié)果表明，2株病毒均得到成功拯救。

2.2.2 群特異性抗原檢測(cè) 用禽白血病病毒抗原檢測(cè)試劑盒檢測(cè)這2株拯救病毒的第5代病毒，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。陽(yáng)性對(duì)照孔在OD650nm吸光度平均值為0.368，陰性對(duì)照孔在OD650nm吸光度平均值為0.078。由公式得臨界值＝0.2×（陽(yáng)性對(duì)照平均值—陰性對(duì)照平均值），計(jì)算得臨界值為0.136。r HPRS-103株在OD650nm吸光度檢測(cè)的平均值為0.795，r HPRS-103ΔDPU3株在OD650nm吸光度檢測(cè)的平均值為0.967?？乖瓩z測(cè)結(jié)果表明，2株病毒均得到成功拯救。

圖3 r HPRS-103、r HPRS-103ΔDPU3株的間接免疫熒光鑒定結(jié)果Fig.3 Identification of r HPRS-103，r HPRS-103ΔDPU3 by IFA

2.2.3 反轉(zhuǎn)錄酶檢驗(yàn) 采用Roche的反轉(zhuǎn)錄酶檢測(cè)試劑盒，利用HIV反轉(zhuǎn)錄酶標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再通過(guò)吸光度確定第5代拯救病毒的反轉(zhuǎn)錄酶活性，通過(guò)ELISA檢測(cè)，取3次檢測(cè)結(jié)果的平均數(shù)。2株病毒ELISA在OD450nm處吸光值分別如下：r HPRS-103為3.128，r HPRS-103ΔDPU3為2.985。所對(duì)應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄酶活性分別為1.528 1和1.324。結(jié)果表明，2株病毒均得到成功拯救。

2.3 rHPRS-103、rHPRS-103ΔDPU3復(fù)制動(dòng)力學(xué)的比較

繪制的病毒復(fù)制動(dòng)力學(xué)曲線見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，r HPRS-103、r HPRS-103ΔDPU3兩株病毒體外復(fù)制無(wú)明顯差異。

圖4 拯救病毒的復(fù)制動(dòng)力學(xué)曲線Fig.4 Proliferation kinetics curve of the rescued viruses

2.4 U3區(qū)啟動(dòng)子及增強(qiáng)子活性差異比較

按p GL3 Luciferase Reporter Vectors試劑盒檢測(cè)說(shuō)明書對(duì)轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞進(jìn)行熒光檢測(cè)。結(jié)果如圖5。檢測(cè)結(jié)果表明，r HPRS-103、r HPRS-103ΔDPU3的U3區(qū)啟動(dòng)子活性和增強(qiáng)子活性均無(wú)明顯差異。

圖5 ALV-J實(shí)驗(yàn)室分離株SD09DP04與原型株HPRS-103 U3區(qū)啟動(dòng)子活性（A）、增強(qiáng)子活性（B）結(jié)果Fig.5 The results of the promoter（A）／enhancer（B）activity between laboratories isolated virus SD09DP04 and classical virus HPRS-103

3 討 論

自2008年以來(lái)，ALV-J的感染在中國(guó)出現(xiàn)大范圍的流行［7，12］。而與此同時(shí)，ALV-J的流行毒株的基因組序列與原型毒株HPRS-103相比也出現(xiàn)了一些特異有規(guī)律的變化。通過(guò)筆者實(shí)驗(yàn)室所進(jìn)行的流行病學(xué)調(diào)查以及對(duì)ALV-J流行毒株U3區(qū)的基因序列分析，發(fā)現(xiàn)87.5%（14／16）的流行毒株具有14個(gè)堿基的規(guī)律性突變。而且，流行毒株的U3區(qū)與原型毒株及多株肉雞分離株的U3區(qū)的進(jìn)化樹分析顯示，此流行毒株的U3區(qū)處于一個(gè)新的分支上［12］。由于U3區(qū)在病毒的復(fù)制增殖過(guò)程中有著重要的調(diào)控作用，含有多種與病毒復(fù)制密切相關(guān)的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件［14］。且最近的一些研究表明，ALV-J傾向于出現(xiàn)有利于其迅速進(jìn)化的突變［10］。而上述流行毒株中出現(xiàn)的U3區(qū)的規(guī)律性突變正是ALV-J在其進(jìn)化過(guò)程中自然發(fā)生的，這就表明其很有可能是ALV-J本身適應(yīng)自然界，增強(qiáng)其增殖能力的一個(gè)有利進(jìn)化。因此，對(duì)此具有特異性規(guī)律突變的U3區(qū)的功能及其對(duì)病毒復(fù)制的影響的研究，成為本研究的主題。本研究所拯救的ALV-J嵌合病毒中的U3區(qū)，即為近年來(lái)流行毒株SD09DP04的U3區(qū)序列，并且具有上述U3區(qū)的特異性規(guī)律特征。

本研究構(gòu)建了1株3′-U3區(qū)嵌合禽白血病病毒感染性克隆（p UC19-A-DPU3-B-C），與p UCHPRS-103分別轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞獲得2株拯救病毒。ALV屬于反轉(zhuǎn)錄病毒，前病毒全基因組克隆被轉(zhuǎn)染于DF-1后，即可利用宿主細(xì)胞的RNA聚合酶II，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄、翻譯過(guò)程，并最終完成病毒的包裝和釋放，所以在設(shè)計(jì)ALV感染性克隆時(shí)，不需要考慮啟動(dòng)子和核酶序列等修飾因子［15］。

構(gòu)建感染性克隆并拯救相應(yīng)病毒，對(duì)于研究病毒基因組某一部分的作用，例如其對(duì)于整個(gè)病毒復(fù)制過(guò)程的影響，具有十分重要的意義。為了排除質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)的可能性，本研究將轉(zhuǎn)染后的病毒經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代后，再進(jìn)行一系列病毒活性的檢測(cè)，并且同時(shí)采用多種檢測(cè)方法，最終確定成功拯救出病毒，為后續(xù)的試驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。

在本研究之中，對(duì)拯救的原型毒株r HPRS-103和嵌合病毒r HPRS-103ΔDPU3的復(fù)制動(dòng)力學(xué)曲線的測(cè)定結(jié)果表明這兩株拯救病毒的體外復(fù)制能力無(wú)明顯差異。為進(jìn)一步探索U3區(qū)堿基的突變對(duì)于病毒的復(fù)制能力無(wú)影響的機(jī)制，鑒于U3區(qū)含有多種順式作用元件，起重要的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子活性功能，我們對(duì)流行毒株的U3區(qū)與原型毒株U3區(qū)的啟動(dòng)子活性及增強(qiáng)子活性進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明，流行毒株的U3區(qū)其啟動(dòng)子活性和增強(qiáng)子活性均與原型毒株的U3區(qū)無(wú)明顯差異。這些數(shù)據(jù)都表明，流行毒株的U3區(qū)的規(guī)律性突變，沒(méi)有增強(qiáng)其U3區(qū)的增強(qiáng)子或啟動(dòng)子活性，進(jìn)而對(duì)ALV-J的復(fù)制能力未造成影響。

但是，ALV-J是反轉(zhuǎn)錄病毒，其在宿主體內(nèi)復(fù)制過(guò)程中，首先要整合至宿主基因組內(nèi)，而后再進(jìn)行一系列復(fù)制過(guò)程。U3區(qū)是決定ALV-J整合入宿主基因組的整合位點(diǎn)的重要區(qū)域。而且，在2008年以前，ALV-J主要感染肉雞群并引起骨髓瘤，但是在2008年后ALV-J的廣泛流行過(guò)程中，出現(xiàn)了ALVJ感染蛋雞的病例，同時(shí)還引起感染雞發(fā)生血管瘤。由于U3區(qū)在ALV-J整合入宿主基因組過(guò)程中所起的重要作用，我們猜想流行毒株U3區(qū)的規(guī)律性突變可能與宿主的改變或者引起腫瘤類型的改變有關(guān)，但這還有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

利用融合PCR技術(shù)，以ALV-J HPRS-103株為骨架構(gòu)建含SD09DP04株3′-U3區(qū)的嵌合病毒的cDNA克隆。嵌合病毒與HPRS-103的感染性克隆轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞，成功拯救到2株病毒，3′-U3區(qū)啟動(dòng)子活性和增強(qiáng)子活性的檢測(cè)以及復(fù)制動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果顯示，出現(xiàn)特異性規(guī)律性突變的U3區(qū)對(duì)于原毒株的體外復(fù)制能力無(wú)顯著影響。

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