BPI蛋白對感染綿羊肺炎支原體的盤羊雜交羊細(xì)胞因子水平的影響

郭海英，沈 文，陳冬梅，陳凱麗，張曉麗，高寶德，孫延鳴＊

（1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，石河子832003；2.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石河子832003）

新疆天山地帶的野生盤羊是國家二級保護(hù)動物，巴什拜羊也是新疆特有的地方優(yōu)良品種，二者都具有很強(qiáng)的適應(yīng)性和抗病能力。長期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其幼齡的雜交后代羊的抗病力卻大大降低，非常易感呼吸道疾?。?-2］，研究表明主要與綿羊肺炎支原體感染有關(guān)［3］。盤羊的雜交后代可能存在先天性免疫能力下降，其可能與羊的疾病抗性基因變異有關(guān)［4］。

殺菌通透性增加蛋白基因（bactericidal／permeability-increasing protein gene，BPI）屬于抗菌肽或蛋白類基因，其編碼產(chǎn)物有殺滅革蘭陰性菌、中和內(nèi)毒素、對中性粒細(xì)胞的調(diào)理作用等活性，在動物機(jī)體先天免疫中起重要的作用，被很多學(xué)者作為豬牛等的抗病候選基因［5-6］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)BPI有抑制促炎細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、IL-8等的作用，促進(jìn)抗炎因子如IL-10的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)［7-8］。研究表明肺炎支原體感染可以誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子產(chǎn)生，有學(xué)者建立小鼠支原體肺炎模型檢測其細(xì)胞因子表達(dá)水平，表明IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-r等參與其致病過程，在肺部防御與炎癥中起重要的作用［9-10］。前期研究中，作者發(fā)現(xiàn)巴什拜羊和盤羊雜交羊的BPI基因N端活性區(qū)域有3處核苷酸差異，并導(dǎo)致3處氨基酸改變。為進(jìn)一步研究BPI蛋白的免疫調(diào)節(jié)功能，本試驗建立了MO的盤羊雜交羊疾病模型，利用真核表達(dá)的重組BPI蛋白（r BPI）進(jìn)行治療試驗，測定外周血中IL-8、IL-10、TNF-α及IFN-γ變化規(guī)律，并對其肺組織的病理切片進(jìn)行病理評分，為研究BPI基因在MO的致病機(jī)制研究及治療提供一定的實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和實驗動物

綿羊肺炎支原體菌株（Mycoplasma Ovipneumoniae，MO）（由石河子大學(xué)動物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實驗室王靜梅高級實驗師提供，與Y-98標(biāo)準(zhǔn)株的相似性為98%）；12只盤羊雜交羊（盤羊♂×巴什拜羊♀）及6只巴什拜羊由塔城裕民縣提供，均為2～3月齡，體重為10～15 kg，MO ELISA抗體檢測均為陰性。

1.2 主要試劑

綿羊肺炎支原體專用培養(yǎng)基（蘭州獸醫(yī)研究所儲岳峰研究員贈予）；MO ELISA診斷試劑盒（美國ADL公司）；r BPI為巴什拜羊重組BPI蛋白（石河子大學(xué)動物科技學(xué)院生化實驗室制備）［11］；綿羊IL-8、IL-10、TNF-α及IFN-γELISA試劑盒（上海藍(lán)基（Blue Gene）公司）。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 試驗羊分組、感染及r BPI注射 培養(yǎng)綿羊肺炎支原體，人工感染按參考文獻(xiàn)［12］的方法采用氣管內(nèi)注射。感染時所使用的MO濃度為CCU＝106·m L-1，2 m L·只-1，試驗全程中飼喂均不添加抗生素。在感染MO后的第4天開始，C組羊每天注射rBPI 150 mg·只-1（真核表達(dá)的rBPI，濃縮后濃度為74.54 mg·m L-1），A、B組羊注射同劑量的生理鹽水。在感染的第0、2、5、7、14、21天，頸靜脈采血分離血清，試驗結(jié)束后宰殺綿羊進(jìn)行剖檢。試驗羊分組、感染及重組蛋白質(zhì)注射的具體情況見表1。

表1 試驗設(shè)計Table 1 The experimental design

1.3.2 臨床觀察與病原鑒定 每天定點(diǎn)測量記錄體溫，并觀察臨床癥狀，直至試驗結(jié)束。試驗結(jié)束后宰殺所有試驗羊，檢查肺部病變。在感染前和感染2周后，采血分離血清，使用MO ELISA診斷試劑盒檢測抗體水平，按試劑盒說明書操作。同時從每組隨機(jī)抽取2只個體，采用無菌棉拭子鼻腔采樣，接種于支原體專用培養(yǎng)基培養(yǎng)，在5%CO237℃培養(yǎng)4 d，培養(yǎng)基由粉紅轉(zhuǎn)為黃色為陽性，并進(jìn)行葡萄糖發(fā)酵試驗、洋地黃皂苷試驗等理化特性鑒定［13］。

1.3.3 人工感染前后血清細(xì)胞因子的ELISA檢測在感染前（第0天）及感染后第2、5、7、14及21天，用普通采血管采集所有羊的靜脈血，37℃傾斜放置2 h后3 000 r·min-1離心15 min，取上清，-20℃保存?zhèn)溆谩⒄誆LISA試劑盒說明書檢測細(xì)胞因子IL-8、IL-10、TNF-α及IFN-γ的濃度。

1.3.4 標(biāo)本的固定染色及組織病理學(xué)評分 各組羊宰殺之后，取每只羊的左右肺組織常規(guī)制備石蠟切片、HE染色，光鏡下觀察組織學(xué)變化，參照張慧等對急性支原體肺炎動物模型的組織病理學(xué)評分系統(tǒng)［14］，以0～26分的組織病理學(xué)評分來確定肺部的炎癥反應(yīng)程度，評分包括支氣管／細(xì)支氣管周圍浸潤部位的百分比、支氣管／細(xì)支氣管管腔炎性細(xì)胞浸潤的多少、支氣管／細(xì)支氣管管腔炎性滲出的嚴(yán)重程度、血管周圍炎性細(xì)胞浸潤的百分比、實質(zhì)性肺炎嚴(yán)重程度五方面。每一側(cè)肺的評分相加之后除以2而構(gòu)成每只動物的評分。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理分析 采用SPSS 17.0軟件分析比較不同組羊細(xì)胞因子IL-8、IL-10、TNF-α及IFN-γ表達(dá)水平差異，以及每組病理評分的差異，結(jié)果以“±s”表示。

2 結(jié) 果

2.1 臨床觀察與病原鑒定

A組巴什拜羊在感染后2～3 d表現(xiàn)為食欲減退、體溫一過性升高（40～41℃），呼吸啰音，之后體溫恢復(fù)正常，無死亡病例，剖檢后肺表面有輕微出血點(diǎn)（圖2A）；B組雜交羊體溫升高（40～41℃）并持續(xù)不下，有咳嗽、流漿液性鼻涕、嚴(yán)重呼吸啰音及腹瀉癥狀，死亡率為33%，剖檢胸膜有黃白色纖維素層附著，肺表面有不同程度的粉色肉變和肝變，有出血點(diǎn)、出血斑及表面凸出結(jié)節(jié)（圖2B）。C組雜交羊起初體溫升高、食欲減退、咳嗽癥狀，剖檢肺表面有出血點(diǎn)和出血斑（圖2C）。感染前后血清MO抗體ELISA檢測結(jié)果見圖1，測定OD值（與陰性對照OD值（NC）比較，＞2NC＋0.06為陽性）結(jié)果顯示陰性對照OD值為0.12，所以可得臨界值為0.3，人工感染前均為陰性，感染后血清MO抗體均呈陽性（圖1）。將鼻腔采集的棉拭子接種于培養(yǎng)基中，由粉紅轉(zhuǎn)為黃色，取培養(yǎng)物涂片姬姆薩染色鏡檢，可見球形及多形性支原體，接種于固體培養(yǎng)基，4 d后在顯微鏡下觀察呈典型支原體菌落，同時經(jīng)生化鑒定（表2），結(jié)果為MO，表明感染成功。

2.2 肺部組織病理學(xué)評分

A組巴什拜羊表現(xiàn)為輕度病變，肺組織結(jié)構(gòu)清晰，局部視野肺間質(zhì)增寬，其間有淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及淡粉色滲出液浸潤。細(xì)支氣管上皮排列尚規(guī)則，管腔的周圍有少量炎癥細(xì)胞浸潤（圖3A）。B組雜交羊均表現(xiàn)重度病變，其病變范圍廣泛，大部分視野可見肺間質(zhì)明顯變寬，壓迫肺間質(zhì)致使連成片，肺泡腔消失，間隔內(nèi)有大量淋巴細(xì)胞浸潤，細(xì)支氣管上皮破壞、脫落，管腔內(nèi)有明顯滲出，肺間質(zhì)毛細(xì)血管、支氣管旁小靜脈淤血突出（圖3B）。C組雜交羊表現(xiàn)為中度病變，肺泡間隔增寬較明顯，間隔內(nèi)有較多淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)部分破壞，細(xì)支氣管上皮增生，小血管周圍淋巴細(xì)胞浸潤（圖3C）。對3組綿羊肺部病理評分后，A組平均分為9.4，B組平均分19.9，C組平均分為12.8，三組評分結(jié)果差異見圖3D，B組評分與A、C組差異顯著（P＜0.05、P＜0.05）。

圖1 感染前后MO抗體水平檢測Fig.1 Serum anti-MO antibody levels after 2 weeks of infection

圖2 各組肺的肉眼病變觀察Fig.2 Lesion observation of lung in each group

表2 生化鑒定結(jié)果Table 2 Biochemical identification results in the three groups

2.3 IL-8檢測

人工感染前后各組羊的IL-8含量如表3所示，在感染后3個組的IL-8濃度均逐漸升高。在感染后第7天，C組IL-8濃度顯著低于A組（P＜0.05）；在第14—21天，B組極顯著高于A組（P＜0.01）。B組IL-8呈持續(xù)增高，說明了炎癥程度嚴(yán)重，與其對應(yīng)的病理反應(yīng)存在相關(guān)性。

圖3 各組肺組織病變（HE 100×）及病理評分Fig.3 Pathological changes of lung（HE 100×）and histopathological scores in the three groups

表3 注射r BPI蛋白前后各組羊IL-8的濃度（±s）Table 3 Concentration of IL-8 of each group at pre-and post-injecting rBPI pg·mL-1

表3 注射r BPI蛋白前后各組羊IL-8的濃度（±s）Table 3 Concentration of IL-8 of each group at pre-and post-injecting rBPI pg·mL-1

同一行中，不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）；不同大寫字母表示差異極顯著（P＜0.01）。下同In the same line，different lowercase letter superscripts indicate significantly different（P＜0.05）；different uppercase letters indicate the highly significant difference（P＜0.01）.The same as below

時間Time A組（BS、生理鹽水）Group A（BS，Saline）B組（AHS、生理鹽水）Group B（AHS，Saline）C組（AHS，r BPI蛋白）Group C（AHS，r BPI protein）第0天Day 0 131.14±12.18 124.52±11.04 118.68±7.11第2天Day 2 139.65±34.51 150.85±23.65 137.03±13.71第5天Day 5 184.67±8.38 178.30±14.18 171.68±16.44第7天Day 7 267.11±17.77a 248.22±10.40ab 220.60±13.46b第14天Day 14 218.64±19.33B 283.22±23.99A 250.35±34.69AB第21天Day 21 191.57±30.62B 297.54±23.87A 224.79±30.47B

2.4 IL-10檢測

IL-10含量如表4所示。在感染后第2—5天，3個組的IL-10含量升高；在第5天，C組顯著高于A組（P＜0.05），極顯著低于B組（P＜0.01）；在感染后的第14天，C組IL-10極顯著低于A組（P＜0.01），顯著高于B組（P＜0.05）；在第21天，C組顯著低于A組（P＜0.05），極顯著高于B組（P＜ 0.01）。A、C組后期都趨向正常水平，利于機(jī)體恢復(fù)。

2.5 IFN-γ檢測

如表5所示，在感染MO后3個組的IFN-γ含量均逐漸升高（除A、C組第21天）。第14天，C組IFN-γ含量顯著高于A組（P＜0.05）；在第21天，C組顯著低于B組（P＜0.05），但極顯著高于A組（P＜0.01）。

表4 注射r BPI蛋白前后各組羊IL-10的濃度（±s）Table 4 Concentration of IL-10 of each group at pre-and post-injecting r BPI pg·m L-1

表4 注射r BPI蛋白前后各組羊IL-10的濃度（±s）Table 4 Concentration of IL-10 of each group at pre-and post-injecting r BPI pg·m L-1

時間Time A組（BS、生理鹽水）Group A（BS，Saline）B組（AHS、生理鹽水）Group B（AHS，Saline）C組（AHS，r BPI蛋白）Group C（AHS，rBPI protein）第0天Day 0 325.82±23.24 338.51±14.31 312.25±14.41第2天Day 2 353.05±20.12 348.68±19.98 334.95±26.73第5天Day 5 402.21±21.64Bb 502.41±20.16A 445.21±27.16Ba第7天Day 7 257.60±13.94 267.69±10.78 273.89±15.34第14天Day 14 285.82±14.49A 203.19±17.32Bb 236.96±21.91Ba第21天Day 21 306.15±22.09Aa 168.79±31.27Bc 263.03±29.36 Ab

表5 注射rBPI蛋白前后各組羊IFN-γ的濃度（±s）Table 5 Concentration of IFN-γof each group at pre-and post-injecting r BPI pg·m L-1

表5 注射rBPI蛋白前后各組羊IFN-γ的濃度（±s）Table 5 Concentration of IFN-γof each group at pre-and post-injecting r BPI pg·m L-1

時間Time A組（BS、生理鹽水）Group A（BS，Saline）B組（AHS、生理鹽水）Group B（AHS，Saline）C組（AHS，r BPI蛋白）Group C（AHS，rBPI protein）第0天Day 0 47.31±6.07 54.09±10.90 45.16±5.64第2天Day 2 57.85±3.55 61.11±11.17 56.86±4.24第5天Day 5 87.52±8.50 85.90±14.41 85.71±8.65第7天Day 7 97.34±10.91 105.74±8.60 100.08±10.43第14天Day 14 81.98±10.55b 130.42±13.89a 106.88±15.41a第21天Day 21 65.11±9.93B 136.06±23.32Aa 93.25±13.02Ab

2.6 TNF-α檢測結(jié)果

如表6所示，在感染MO后TNF-α含量逐漸升高，在感染第14天，C組TNF-α顯著低于B組（P＜0.05），但顯著高于A組（P＜0.05）；在第21天，C組的TNF-α顯著低于B組（P＜0.05），但極顯著高于A組（P＜0.01）。B組持續(xù)增高，說明炎癥程度較高，感染嚴(yán)重，相反A、C組后期逐漸降低說明利于機(jī)體恢復(fù)。

表6 注射r BPI蛋白前后各組羊TNF-α的濃度（±s）Table 6 Concentration of TNF-αof each group at pre-and post-injecting rBPI pg·mL-1

表6 注射r BPI蛋白前后各組羊TNF-α的濃度（±s）Table 6 Concentration of TNF-αof each group at pre-and post-injecting rBPI pg·mL-1

時間Time A組（BS、生理鹽水）Group A（BS，Saline）B組（AHS、生理鹽水）Group B（AHS，Saline）C組（AHS，r BPI蛋白）Group C（AHS，r BPI protein）第0天Day 0 152.02±13.53 162.52±8.71 146.19±13.36第2天Day 2 178.60±7.84 177.35±4.31 169.37±6.89第5天Day 5 196.37±11.73 203.96±22.25 194.17±8.51第7天Day 7 239.05±17.80 242.95±8.54 235.60±12.55第14天Day 14 223.13±8.33c 273.55±16.34a 240.52±17.67b第21天Day 21 182.58±6.71B 304.88±23.34Aa 265.29±18.16 Ab

3 討 論

近年來，BPI作為先天免疫中的一種免疫防御分子在感染性疾病中的作用倍受關(guān)注。BPI具有殺滅革蘭陰性菌、結(jié)合內(nèi)毒素，并能形成內(nèi)毒素中和分子和抗革蘭陰性細(xì)菌感染（GNB）的藥物，因此，被譽(yù)為“超級抗生素”［15-16］，此外BPI還有促進(jìn)補(bǔ)體活化調(diào)理功能、抑制血管生成、抑制炎性介質(zhì)釋放、抗原蟲等作用［17-18］。前期研究已得到雜交羊和巴什拜羊的BPI序列有差異。為進(jìn)一步研究BPI對綿羊肺炎支原體的作用，本試驗以支原體肺炎的綿羊為疾病模型，選擇對MO不易感的巴什拜羊的r BPI蛋白來注射綿羊，動態(tài)檢測綿羊外周血中4種細(xì)胞因子變化，初步證實BPI對綿羊肺炎支原體有一定的治療作用。

人工感染巴什拜羊和雜交羊的試驗中，均能從3組羊血清中檢測到MO抗體，說明MO人工感染成功。A組巴什拜羊出現(xiàn)體溫一過性升高、咳嗽和流鼻液等較輕癥狀，剖檢癥狀不典型。而B組雜交羊有體溫升高且持續(xù)較久，咳嗽、流漿液性鼻涕、嚴(yán)重呼吸啰音及腹瀉癥狀，剖檢出現(xiàn)出血點(diǎn)、肉變和肝變。兩種羊臨床癥狀嚴(yán)重程度不同，可能是巴什拜羊較雜交羊?qū)O有抗性［8］，與姜方配等［6］同時對巴什拜羊和雜交羊攻毒MO的癥狀相符。而這些羊的體溫表現(xiàn)差異較大，這與流行病學(xué)調(diào)查時基層獸醫(yī)反映許多發(fā)病羊在測體溫時體溫不高的情況相一致［19］。

研究表明，肺炎支原體感染后，是通過細(xì)胞因子的誘導(dǎo)作用，激活內(nèi)皮細(xì)胞和粒細(xì)胞，繼而調(diào)節(jié)黏附因子的合成及其在細(xì)胞表面的表達(dá)，從而導(dǎo)致炎癥的發(fā)生，并認(rèn)為這些細(xì)胞因子可能是支原體肺炎感染的發(fā)病機(jī)制之一［20］。IL-8作為C-X-C趨化因子家族之一，人肺炎支原體感染時，巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及人肺上皮A549細(xì)胞能分泌IL-8，引起胸膜滲出和肺的纖維素病變［4，21］。有研究表明，急性期支原體肺炎患兒的IL-8水平明顯升高，恢復(fù)期則降至正常水平［22］。本試驗中感染MO的雜交羊，在BPI治療后期IL-8有降低趨勢，濃度逐漸趨向正常水平，與其研究結(jié)果相一致。

IFN-γ為TH1型促炎細(xì)胞因子，能抑制病毒復(fù)制、增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬作用。在支原體肺炎病人中可以檢測到IFN-γ水平升高［23］，我們的研究結(jié)果也與其相一致。在感染初期，3個組IFN-γ濃度都隨時間延長而濃度升高，其中對照組雜交羊（B組）在整個21 d的試驗期內(nèi)都是升高的。BPI治療后，C組雜交羊在第14天后開始有降低趨勢，且與不治療的B組差異極顯著。說明BPI可能調(diào)節(jié)IFN-γ，使其恢復(fù)到正常水平，促使機(jī)體向有利方面發(fā)展，這與高偉［24］觀察到感染支原體肺炎的大鼠在感染初期IFN-γ升高在恢復(fù)期降低的是一致的。

TNF-α是由活化的巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，有誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的趨化作用和局部浸潤、吞噬和殺傷病原體，從而啟動炎癥反應(yīng)。有研究表明，感染支原體肺炎后TNF-α濃度升高，且與支原體肺炎的嚴(yán)重程度成正相關(guān)［25-27］。本研究結(jié)果表明，感染MO前期巴什拜羊和雜交羊血清中TNF-α濃度都升高，說明疾病發(fā)生嚴(yán)重。在BPI治療后期的雜交羊的TNF-α濃度降低，且明顯低于不治療的雜交羊，暗示治療組雜交羊癥狀減輕。而且治療后的病理評分低于不治療的，也說明治療后的雜交羊處于恢復(fù)期癥狀減輕。

IL-10是抗炎細(xì)胞因子，由TH2型細(xì)胞分泌，可作用于巨噬細(xì)胞抑制其分泌細(xì)胞因子，間接抑制TH1型細(xì)胞因子如IL-6、TNF-α等的過表達(dá)。有研究表明IL-10的分泌缺乏將導(dǎo)致各種炎癥過程，某些情況下其缺乏還將導(dǎo)致炎癥持續(xù)和不可逆的組織損傷［28］。本研究也證明了這點(diǎn)，感染MO后三組羊的IL-10含量降低，且B組雜交羊呈現(xiàn)持續(xù)降低趨勢，加上B組的病理評分分?jǐn)?shù)顯著高于其他兩組，表明肺部損傷嚴(yán)重。但是BPI治療后C組雜交羊在14 d之后IL-10逐漸升高，相應(yīng)的病理評分也低于B組，這些數(shù)據(jù)可能暗示機(jī)體將向有利于機(jī)體的方面發(fā)展，這與馬慶慶等［22］在肺炎支原體患兒血清IL-10降低，而在恢復(fù)期雖然升高但仍低于正常值的結(jié)果相似。

4 結(jié) 論

注射r BPI蛋白后盤羊雜交羊的細(xì)胞因子水平與未注射的雜交羊相比有明顯差異，說明r BPI蛋白對易感的盤羊雜交羊具有一定的免疫調(diào)節(jié)及治療效果，為綿羊支原體肺炎的臨床治療和新藥的研發(fā)提供新的理論依據(jù)。

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