蒲公英水提物對(duì)豬鏈球菌生物被膜體外干預(yù)作用

于文會(huì)，許 晶，魏慶微，姜曉文，單安山

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱150030）

豬鏈球菌（Streptocccus suis，S.suis）是一種革蘭陽性細(xì)菌，不僅引起豬的腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎等一系列疾病，而且感染相關(guān)的從業(yè)人員，是一種人獸共患?。?］。在感染的起始階段，細(xì)菌能否定植在宿主組織，取決于細(xì)菌被胞外基質(zhì)（extracellular matrix）包裹的生物被膜形成與否。形成生物被膜的胞外基質(zhì)來源于環(huán)境和細(xì)菌的代謝產(chǎn)物。細(xì)菌形成生物被膜有利于細(xì)菌的持續(xù)性定植，抵抗宿主免疫系統(tǒng)的清除，增強(qiáng)細(xì)菌的耐藥性，增加細(xì)菌和細(xì)菌間遺傳物質(zhì)的交換［2］。蒲公英（dandelion）是一種多年生菊科植物，在我國各地均有分布，來源廣泛，價(jià)格低廉。蒲公英作為一種藥用植物，具有利膽、利尿、抗風(fēng)濕、抗糖尿病及抗炎特性。蒲公英不同部位的提取物具有不同的藥理活性。蒲公英根的水提物可以緩解酒精誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)；蒲公英葉的提取物可以緩解高脂肪食物誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝；蒲公英花的提取物具有抗菌活性［3］。然而，蒲公英的全草類提取物干預(yù)細(xì)菌生物被膜形成的研究，未見國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道。蒲公英主要抗菌活性成分為綠原酸，且含量較高，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、降糖等多種作用［4］。綠原酸對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜［5］、葡萄球菌生物被膜［6］、口腔中多種細(xì)菌的生物被膜［7］的形成均有抑制作用，但綠原酸對(duì)豬鏈球菌生物被膜形成影響的研究，國內(nèi)外文獻(xiàn)未見報(bào)道。為開發(fā)蒲公英在防治豬鏈球菌病的應(yīng)用，采用蒲公英水提物對(duì)體外豬鏈球菌生物被膜的形成進(jìn)行干預(yù)，探討蒲公英抗豬鏈球菌的機(jī)制，為今后蒲公英防治豬鏈球菌病的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：豬鏈球菌分離株，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供并鑒定；蒲公英飲片，購自中國藥材集團(tuán)黑龍江省藥材公司；卡爾加里生物被膜培養(yǎng)裝置，購自加拿大Innovotech有限公司；THB（Todd-Hewitt broth）培養(yǎng)基，購自中國青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；綠原酸對(duì)照品，購自中國藥品生物制品檢定所；乙腈和甲醇為色譜純。

1.2 主要儀器

酶標(biāo)儀（SN239591，美國Epoch），掃描電鏡（S-3400N，日本），日本島津10 AVP高效液相色譜儀，紫外檢測器，CWS30色譜工作站。

1.3 方法

1.3.1 蒲公英水提物制備和綠原酸含量檢測稱取蒲公英200 g于燒杯中，粉碎后加蒸餾水1.6 L，室溫浸泡過夜。煎煮30 min，12層紗布過濾，取濾液。再向?yàn)V渣內(nèi)加入蒸餾水1.2 L煎煮30 min，同樣用12層紗布過濾，合并濾液。濾液以3 000 r·min-1，離心10 min，取上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至100 m L，再利用真空冷凍干燥機(jī)凍干至粉末［8］。準(zhǔn)確稱量蒲公英凍干粉末1 g，用2 m L雙蒸水溶解，用0.22μm濾膜過濾，保存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

參照中國獸藥典蒲公英的鑒定方法［8］，以綠原酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，高效液相色譜法測得蒲公英水提物中綠原酸含量。

1.3.2 蒲公英水提物和綠原酸對(duì)豬鏈球菌最小抑菌濃度（MIC）及最小殺菌濃度（MBC）測定MIC的測定參照I.Wiegand等［9］微量肉湯稀釋法進(jìn)行。將豬鏈球菌菌株接種于THB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過夜。取單個(gè)菌落接種于THB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12～16 h。比濁法將菌液濃度先調(diào)整為0.5麥?zhǔn)暇鷳乙海?.0×108cfu·m L-1），然后用THB培養(yǎng)基稀釋為約1.0×106cfu·m L-1。依次向無菌96孔細(xì)胞培養(yǎng)板加入THB培養(yǎng)基，除第1孔加入160μL THB培養(yǎng)基外，其余每管加入100 μL THB，在第1孔加入蒲公英水提物40μL混勻，然后吸取100μL至第2孔，混勻后再吸取100μL至第3孔，如此連續(xù)倍比稀釋至第11孔，并從第11孔中吸取100μL棄去，第12孔為不含藥物的生長對(duì)照。然后在每孔內(nèi)加入上述制備好的菌液100 μL，使每孔最終菌液濃度約為5×105cfu·m L-1，混勻后蓋好，于37℃孵育24 h。以肉眼觀察，無細(xì)菌生長的藥物最低濃度孔，即為各蒲公英水提物對(duì)S.suis的MIC。

從MIC終點(diǎn)孔到第1孔中分別吸取50μL液體接種于THB平板上，37℃溫箱中孵育24 h。觀察結(jié)果，接種平板中未見菌體生長的最低藥物濃度為MBC。

1.3.3 豬鏈球菌生物膜形成能力測定 參照周永輝等［10］方法，首先將豬鏈球菌菌株于無菌條件下在THB瓊脂平板上傳代2代進(jìn)行分離，從THB瓊脂平板上挑取單個(gè)菌落，接種于無菌THB液體試管中，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后，比濁法將菌液濃度先調(diào)整為0.5麥?zhǔn)暇鷳乙海?.0×108cfu·m L-1），再用THB液體培養(yǎng)基稀釋，使菌液濃度約為1×106cfu·m L-1。每孔200μL菌液加到卡爾加里裝置底部板內(nèi)，只含THB液體培養(yǎng)基的孔為對(duì)照組，37℃，50 r·min-1搖床上培養(yǎng)72 h。設(shè)置空白對(duì)照組（THB培養(yǎng)基）和陽性對(duì)照組（1／2環(huán)丙沙星）。參照S.Stepanovic等的方法［11］分別用空白對(duì)照組（THB培養(yǎng)基）、陽性對(duì)照組（1／2MIC環(huán)丙沙星）、陰性對(duì)照組（豬鏈球菌菌液）共同培養(yǎng)72 h后染色，酶標(biāo)儀595 nm處測定OD值。判斷豬鏈球菌生物被膜的形成能力。

1.3.4 不同濃度蒲公英水提物及不同濃度綠原酸對(duì)鏈球菌生物被膜干預(yù)作用 將濁度為0.5麥?zhǔn)暇鷳乙合♂尩?.0×106cfu·m L-1，向卡爾加里生物被膜裝置每孔中加菌液和蒲公英水提物共200 μL（濃度分別為1／2MIC、1／4MIC、1／8MIC、1／16MIC、1／32MIC），另設(shè)空白對(duì)照孔（只加培養(yǎng)基）和陰性對(duì)照孔（只加菌液），每個(gè)樣品5個(gè)重復(fù)。37℃，50 r·min-1搖床上孵育72 h，PBS清洗2次，固定，染色，酶標(biāo)儀595 nm處測定OD值。

1.3.5 蒲公英水提物及綠原酸對(duì)鏈球菌生物被膜干預(yù)作用形態(tài)學(xué)觀察 從卡爾加里被膜裝置中取出所需觀察的樁釘，并使用滅菌PBS（p H7.2）輕輕洗滌3次以去除游離菌。用p H 7.2戊二醛在4℃冰箱中固定1 h。依次用p H 7.2 PBS沖洗2次，每次均為10 min。用50%、70%、90%乙醇各脫水一次，每次10 min；再用100%乙醇脫水2次，每次10 min，最后用100%乙醇與叔丁醇（1∶1）混合液和純叔丁醇各脫水一次后，每次15 min。然后將樣品送電鏡中心進(jìn)行掃描電子顯微鏡下觀察。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用±s表示，統(tǒng)計(jì)資料的比較采用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 蒲公英水提物中綠原酸含量

測定綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品和蒲公英水提物最大吸收峰的波長為327 nm，蒲公英水提物出現(xiàn)最大吸收峰的波長與標(biāo)準(zhǔn)品的波長和時(shí)間均一致。經(jīng)HPLC分離檢測，蒲公英水提物在5 min左右檢測到的物質(zhì)為綠原酸（圖1、圖2）。以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的系列質(zhì)量濃度x（μg·m L-1）為橫坐標(biāo)，峰面積y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y＝70 223x＋4.7× 105，R2＝0.999 9，結(jié)果表明綠原酸進(jìn)樣量在0.02～0.12μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。按中華人民共和國獸藥典第二部［8］方法制備供試品溶液，進(jìn)樣20μL，在5 min時(shí)測得其峰面積為2 099 255，供試品溶液測得蒲公英水提物中綠原酸的含量為5.833 mg·m L-1（圖3）。

圖1 綠原酸Fig.1 Chlorogenic acid

圖2 蒲公英水提物Fig.2 Dandelion aqueous extract

圖3 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Chlorogenic acid standard curve

2.2 蒲公英水提物對(duì)豬鏈球菌的MIC和MBC

通過微量稀釋法測定了蒲公英水提物對(duì)豬鏈球菌的MIC和MBC分別為和62.5和250 mg·m L-1。綠原酸對(duì)豬鏈球菌的MIC和MBC分別為和2.5和10 mg·m L-1。

2.3 豬鏈球菌生物被膜形成能力

空白對(duì)照組OD595nm值（0.199 0±0.017 7）明顯低于陰性對(duì)照組OD595nm值（0.582 0±0.025 9），且差異極顯著（P＜0.01）。陽性對(duì)照組OD595nm值（0.194 0±0.020 7）明顯低于陰性對(duì)照組OD595nm值，差異極顯著（P＜0.01）。豬鏈球菌形成生物被膜能力較強(qiáng)。試驗(yàn)結(jié)果見圖4。

2.4 亞MIC對(duì)豬鏈球菌生物被膜的干預(yù)作用

2.4.1 蒲公英水提物亞MIC對(duì)豬鏈球菌生物被膜的干預(yù)作用 1／2MIC蒲公英水提物組OD595nm值（0.226 8±0.031 6）、1／4MIC蒲公英水提物組OD595nm值（0.262 4±0.034 4）、1／8MIC蒲公英水提物組OD595nm值（0.346 0±0.040 4）、1／16MIC蒲公英水提物組OD595nm值（0.460 0±0.037 4）、陽性對(duì)照組OD595nm值（0.194 0±0.020 7）均顯著低于陰性對(duì)照組OD595nm值（0.582 0±0.025 9），差異極顯著（P＜0.01）。1／32MIC蒲公英水提物組OD595nm值（0.568 0±0.026 8），低于陰性對(duì)照組OD595nm值（0.582 0±0.025 9），差異顯著（P＜0.05）。蒲公英水提物對(duì)豬鏈球菌有干預(yù)作用，呈劑量依賴性。試驗(yàn)結(jié)果見圖5。

圖4 豬鏈球菌生物被膜形成能力（n＝5，±s）Fig.4 The ability of biofilm formation of Streptococcus suis（n＝5，±s）

圖5 蒲公英水提物對(duì)豬鏈球菌生物被膜干預(yù)作用（n＝5，±s）Fig.5 The water extract of dandelion on Streptococcus suis biofilm intervention role（n＝5，±s）

2.4.2 綠原酸亞MIC對(duì)豬鏈球菌生物被膜的干預(yù)作用 1／2MIC綠原酸組OD595nm值（0.226 8± 0.011 6），1／4MIC綠原酸組OD595nm值（0.262 4± 0.054 4），1／8MIC綠原酸組OD595nm值（0.346 0± 0.025 4），1／16MIC綠原酸組OD595nm值（0.460 5± 0.039 2），陽性對(duì)照組OD595nm值（0.193 7± 0.021 7），均明顯低于陰性對(duì)照組OD595nm值（0.599 2±0.024 1），差異極顯著（P＜0.01）。1／32MIC綠原酸組OD595nm值（0.578 2±0.029 9）低于陰性對(duì)照組OD595nm值（0.582 8±0.023 7），差異顯著（P＜0.05）。綠原酸對(duì)豬鏈球菌有干預(yù)作用，呈劑量依賴性。試驗(yàn)結(jié)果見圖6。

2.5 蒲公英水提物及綠原酸對(duì)豬鏈球菌干預(yù)作用的形態(tài)學(xué)觀察

掃描電鏡觀察，陰性對(duì)照組細(xì)菌鑲嵌于生物被膜中，細(xì)菌周圍有厚厚的黏液層，而蒲公英水提物和綠原酸均能夠使細(xì)菌生物被膜發(fā)生明顯變化，細(xì)菌數(shù)減少，未見有黏液成分和胞外基質(zhì)，蒲公英水提物和綠原酸的抑制生物被膜形成與劑量相關(guān)，呈劑量的依賴性，見圖7、8。

圖6 綠原酸對(duì)豬鏈球菌生物被膜干預(yù)作用（n＝5，±s）Fig.6 Chlorogenic acid of Streptococcus suis biofilm intervention role（n＝5，±s）

圖7 掃描電鏡（8 000×）下不同濃度蒲公英水提物對(duì)豬鏈球菌生物被膜的形態(tài)學(xué)影響Fig.7 Different concentrations of aqueous extract of dandelion on biofilm morphology of Streptococcus suis were observed under scanningelectron microscope（8 000×）

3 討 論

已有報(bào)道綠原酸為蒲公英中主要藥效活性成分，含量較高［12-13］，但為了確證蒲公英水提物中綠原酸的含量，作者利用高效液相色譜對(duì)其進(jìn)行分析，結(jié)果表明蒲公英水提物中綠原酸含量為5.833 mg·m L-1，含量較高，這與報(bào)道的相一致。為了明確蒲公英水提物對(duì)豬鏈球菌抑菌和殺菌作用的主要藥效成分是否為綠原酸，試驗(yàn)分別測定蒲公英水提物和綠原酸對(duì)豬鏈球菌的最低抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC），從測得的結(jié)果看，綠原酸的MIC和MBC均低于蒲公英水提物的濃度，而且二者相差數(shù)十倍，表明綠原酸為蒲公英水提物中抗菌的主要藥效成分。

圖8 掃描電鏡（8 000×）下不同濃度綠原酸對(duì)豬鏈球菌生被物膜的形態(tài)學(xué)影響Fig.8 Different concentration of chlorogenic acid on the morphology of Streptococcus suis biofilm were observed under scanning electron microscope（8 000×）

豬鏈球菌在體內(nèi)定植常以生物被膜形式生存，生物被膜可以阻止和抑制巨噬細(xì)胞、白細(xì)胞、抗體及抗生素進(jìn)入生物被膜中清除或殺滅細(xì)菌，導(dǎo)致鏈球菌反復(fù)感染，難以控制［14］。生物被膜一旦形成，膜內(nèi)細(xì)菌比浮游細(xì)菌耐藥性增加100～1 000倍以上，是細(xì)菌毒力增強(qiáng)的重要因素。因此，篩選一種能夠抑制豬鏈球菌生物被膜形成藥物，是治療豬鏈球菌病的關(guān)鍵。已有研究報(bào)道綠原酸對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜［5］、葡萄球菌生物被膜［6］、口腔中多種細(xì)菌的生物被膜［7］等均有抑制作用，但綠原酸干預(yù)豬鏈球菌生物被膜形成是否具有抑制作用，國內(nèi)外文獻(xiàn)未見報(bào)道。作者采用1／2MIC、1／4MIC、1／8MIC、1／16MIC蒲公英水提物及1／2MIC、1／4MIC、1／8MIC、1／16MIC綠原酸對(duì)豬鏈球菌生物被膜形成進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果表明蒲公英水提物及綠原酸對(duì)豬鏈球菌生物被膜均有明顯的抑制作用，并呈劑量依賴性；電鏡觀察可見陰性對(duì)照組細(xì)菌鑲嵌于生物被膜中，細(xì)菌周圍有厚厚的黏液層，而蒲公英水提物和綠原酸均能使細(xì)菌生物被膜中的細(xì)菌數(shù)量和生物被膜的形態(tài)發(fā)生明顯變化，細(xì)菌數(shù)量明顯減少，未見有黏液成分和胞外基質(zhì)分泌，二者對(duì)生物被膜的抑制作用均呈劑量依賴性。

蒲公英水提物中含有多種成分，本試驗(yàn)只對(duì)蒲公英水提物中的綠原酸進(jìn)行考察，通過蒲公英水提物和綠原酸對(duì)豬鏈球菌生物被膜的形成抑制作用進(jìn)行比較，表明蒲公英水提物中抑制豬鏈球菌生物被膜形成的主要活性成分為綠原酸，但蒲公英水提物中的其他成分對(duì)豬鏈球菌生物被膜形成的抑制作用如何，有待今后進(jìn)一步研究。

試驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)證明蒲公英水提物對(duì)體外豬鏈球菌生物被膜的形成具有抑制作用，但對(duì)豬鏈球菌病是否具有治療與預(yù)防作用，還有待于今后對(duì)豬鏈球菌病進(jìn)行臨床試驗(yàn)研究。

4 結(jié) 論

蒲公英水提物對(duì)體外豬鏈球菌生物被膜形成具有抑制作用，并呈劑量依賴性；蒲公英水提物對(duì)體外豬鏈球菌生物被膜形成抑制作用的主要活性成分為綠原酸。

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