黃芪多糖和甲砜霉素影響ALV-J對SPF雞致病性的分析

王廣文，呂 林，王 超，張振東，程子龍，屈亞錦，劉思當(dāng)＊

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，泰安271018；2.泰安出入境檢驗檢疫局，泰安271018）

禽白血?。饬觯╝vian leukosis，AL）是由反轉(zhuǎn)錄病毒科禽白血?。饬霾《救海ˋLV／SV）引起禽類多種腫瘤性疾病的總稱［1］。其中對我國養(yǎng)禽業(yè)危害最嚴(yán)重的是由J亞群白血病病毒（ALV-J）引起的多種腫瘤性疾病。目前，對該病尚無可用的商品化疫苗，也無特效防治藥物，只能通過種雞群的凈化來防控。崔治中等［2］研究表明我國從2011年起對蛋用型祖代雞場進(jìn)行凈化，使得ALV-J在商品代蛋雞中的感染率和發(fā)病死亡率迅速下降，但我國選育的黃羽肉種雞的J亞群白血病日趨嚴(yán)峻，更嚴(yán)重的是該病又進(jìn)一步向我國地方品種雞群［3-6］蔓延。若對感染發(fā)病率較高的地方品種雞群采用嚴(yán)格檢疫淘汰程序，大多數(shù)公司經(jīng)濟實力可能無法承受凈化的成本和代價，若能尋求一種減輕感染的輔助方法（如藥物預(yù)防），協(xié)助雞群的凈化，將對地方品系雞群的凈化具有莫大幫助。

黃芪多糖是一種中藥提取劑，具有多種生物學(xué)功能。黃芪多糖在動物腫瘤模型防治研究中表現(xiàn)出很好的抗腫瘤活性，如小鼠乳腺癌［7］、H22肝癌小鼠移植瘤［8］等，且在人醫(yī)臨床用于癌癥患者的治療中也收到了滿意的效果［9-10］。我們前期試驗研究表明黃芪多糖在0.003 9～0.062 5 mg·m L-1安全濃度范圍內(nèi)，在DF1細(xì)胞上能明顯抑制ALV-J P27的表達(dá)［11］，但其在雞體內(nèi)抗禽白血病致瘤作用未見報道。

甲砜霉素是第二代氯霉素類藥物，在臨床上被廣泛用于育雛雞沙門菌病、大腸桿菌病及支原體病的防治。有研究表明氯霉素能抑制造血功能，體外試驗?zāi)苷T導(dǎo)白血病細(xì)胞系凋亡，有人將氯霉素用于人白血病的防治，并取得良好療效［12］。另外，盡管甲砜霉素不像氯霉素能產(chǎn)生再生障礙性貧血。但甲砜霉素具有與氯霉素相同的不良反應(yīng)，即抑制造血、免疫功能［13］。甲砜霉素對ALV-J的致瘤作用是抑制還是促進(jìn)，有待于試驗驗證。本研究擬驗證育雛期應(yīng)用上述兩種藥物對雛雞先天感染ALV-J致腫瘤發(fā)生的影響，以尋求凈化該病的輔助性防制藥物并考量腫瘤誘發(fā)因素的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

ALV-J NX0101株由崔治中教授惠贈；禽白血病P27抗原ELISA檢測試劑盒購自IDEXX公司；批號：99-09254-FH050、99-09254-AJ999；DMEM培養(yǎng)基購自Invitrogen公司，新生牛血清購自北京元亨金馬生物技術(shù)開發(fā)有限公司；黃芪多糖溶液（含量106.3 mg·g-1）由生泰爾公司提供，甲砜霉素（含量99.1%）由浙江潤康藥業(yè)有限公司提供；SPF雞胚購自濟南SPF雞場。

1.2 動物試驗

將1 000 TCID50ALV-J NX0101毒株接種6日齡SPF雞胚，100μL·胚-1，SPF雞出殼后，隨機分為3組，每組35只，在隔離罩內(nèi)飼養(yǎng)，全價顆粒飼料由泰安六和公司提供。3組試驗雞于16日齡時滴鼻免疫新城疫弱毒疫苗。

1.3 用藥程序

第1、2組于1～5、11～15、21～25 d，在雛雞飲水中分別加入黃芪多糖（100 mg·L-1）、甲砜霉素（100 mg·L-1），連用3個療程。第3組：飲水中不加入任何藥物，作為對照。

1.4 檢測指標(biāo)

分別于6、16、26、42、60、90、120 d，每組取15只，稱重，采集泄殖腔棉拭子，用IDEXX試劑盒檢測ALV-J P27抗原，采促凝血和抗凝血分別檢測ALV-J抗體、新城疫抗體以及病毒血癥。然后每組取3只，剖檢，觀察眼觀病變。取骨髓、心、肝、脾、肺、腎、法氏囊、胸腺等器官組織，于10%福爾馬林溶液固定，石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察病理組織學(xué)病變。

分別于6、26、42、60、120 d，每組取5只，采集抗凝血做血常規(guī)檢測。

于42 d時，每組分別剖殺5只雞，稱量脾和法氏囊的重量，計算免疫器官指數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 ALV-J接種SPF雞胚出殼率

分別于第5天通過卵黃囊接種1 000 TCID50ALV-J，每胚0.1 m L，共計200枚雞胚。21 d后出殼率達(dá)60%左右，但是雛雞不易出殼，體質(zhì)較弱，許多雛雞能啄殼，但出不了殼，需要人工輔助出殼，最后孵出健康雛雞105只，每組35只。

2.2 藥物對雛雞先天性感染ALV-J新城疫抗體的影響

在16 d滴鼻免疫新城疫弱毒疫苗，于免疫后的第8、16、24、42及74天采集血清樣品進(jìn)行新城疫抗體檢測，對各日齡所得抗體效價結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析后發(fā)現(xiàn)，在免疫后第8—42天各組間抗體水平差異不顯著（P＞0.05），后期抗體水平均逐漸下降，到免疫后74天，各組新城疫抗體滴度均降至0（圖1）。

2.3 藥物對雛雞先天性感染ALV-J泄殖腔排毒規(guī)律的影響

從圖2中可以看出，三組泄殖腔排毒呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律。黃芪多糖組在第三次用藥后（26 d）出現(xiàn)突然性的下降，陽性率為45%（9／20），均低于甲砜霉素組和病毒對照組，但在之后檢測中發(fā)現(xiàn)，泄殖腔排毒又維持在較高的水平，陽性率最高時可達(dá)100%（14／14）。甲砜霉素組泄殖腔排毒規(guī)律呈現(xiàn)“波浪型”模式，整個試驗過程中陽性率均高于55%，基本上維持在70%～85%。病毒對照組剛開始時泄殖腔排毒率較低（35%）。在整個試驗過程中排毒規(guī)律呈現(xiàn)上升的趨勢，到后期時各組排毒規(guī)律基本一致。

圖1 兩種藥物對雛雞先天性感染ALV-J NDV HI抗體滴度的影響Fig.1 The influence of two drugs on the ND HI antibody level of SPF chicken with ALV-J congenital infection

圖2 兩種藥物對雛雞先天性感染ALV-J泄殖腔排毒規(guī)律的影響Fig.2 The influence of two drugs on cloaca detoxification of SPF chicken with ALV-J congenital infection

2.4 藥物對雛雞先天性感染ALV-J病毒血癥以及抗體水平的影響

黃芪多糖組、甲砜霉素組和病毒對照組在整個試驗過程中病毒血癥基本上全為陽性。ALV-J抗體陽性雞只最早在42日齡出現(xiàn)在病毒對照組（1／15），在隨后檢測時間點各組均出現(xiàn)1～2只ALV-J抗體陽性雞（表1）。

2.5 藥物對雛雞先天性感染ALV-J免疫器官的影響

在6周齡時對三組雞進(jìn)行稱重，采樣后剖殺，分別采集脾和法氏囊，并計算免疫器官指數(shù)，統(tǒng)計學(xué)分析表明：甲砜霉素組脾和法氏囊器官指數(shù)均低于黃芪多糖組和病毒對照組，以法氏囊器官指數(shù)的降低尤其明顯（圖3），差異極顯著（P＜0.01）。

表1 兩種藥物對雛雞先天性感染ALV-J的病毒血癥及ALV-J抗體的影響Table 1 The influence of two drugs on viremia and ALV-J Ab of SPF chicken with ALV-J congenital infection

圖3 兩種藥物對雛雞先天性感染ALV-J免疫器官發(fā)育的影響Fig.3 The influence of two drugs on immune organs of SPF chicken with ALV-J congenital infection

2.6 藥物對雛雞先天性感染ALV-J體重的影響

分別在6、16、26、42、60、90、120 d對各組雞進(jìn)行稱重，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。甲砜霉素組的體重在16 d時高于黃芪多糖組和病毒對照組，差異顯著（P＜0.05），在26 d時體重也高于另外兩組，但是差異不顯著（P＞0.05），后期低于其他兩組，但只在60日齡時差異顯著（P＜0.05）。而病毒對照組和黃芪多糖組在整個試驗過程中體重差異不顯著（P＞0.05）（表2）。

2.7 藥物對雛雞先天性感染ALV-J致腫瘤的影響

試驗雞經(jīng)定期剖殺剖檢和病理組織學(xué)檢測診斷，腫瘤病變最早見于52日齡黃芪多糖組，其他組均見于60日齡之后，腫瘤發(fā)生統(tǒng)計結(jié)果表明，甲砜霉素組腫瘤發(fā)生率最高，達(dá)28.57%（10／35），其次是病毒對照組20%（7／35），黃芪多糖組最低11.43%（4／35）（表3）。另外，甲砜霉素組出現(xiàn)的腫瘤類型最多，有血管瘤（圖5，A1、A2、A3）、髓樣細(xì)胞瘤（圖5，B1、B2、B3）、纖維肉瘤和腺癌（圖5，C1、C2、C3）、淋巴肉瘤（圖5，D1、D2、D3），并且該組患雞病程進(jìn)展快，病變程度重。在各組中最常見的腫瘤類型是淋巴肉瘤（表3）。

表2 兩種藥物對雛雞先天性感染ALV-J體重的影響（±s）Table 2 The influence of two drugs on weight of SPF chicken with ALV-J congenital infection（±s）

表2 兩種藥物對雛雞先天性感染ALV-J體重的影響（±s）Table 2 The influence of two drugs on weight of SPF chicken with ALV-J congenital infection（±s）

同列數(shù)據(jù)后所標(biāo)字母相異表示差異顯著（P＜0.05），所標(biāo)字母相同表示差異不顯著（P＞0.05）Different letters in the same list means significant difference between the treatments（P＜0.05），same letter in the same row means not significant difference between treatments（P＞0.05）

組別Groups日齡／d Days 8 16 26 42 60 90 120黃芪多糖組Astragalan 0.048±0.005a 0.088±0.014a 0.16±0.03a 0.27±0.08a 0.55±0.12a 0.85±0.20a 0.97±0.19a甲砜霉素組Thiamphenicol 0.050±0.008a 0.099±0.012b 0.18±0.03a 0.30±0.05a 0.46±0.10b 0.82±0.20a 0.86±0.14a病毒對照組Virus 0.050±0.009a 0.089±0.018a 0.17±0.04a 0.30±0.08a 0.54±0.16a 0.85±0.25a 0.94±0.20a

表3 兩種藥物對雛雞先天性感染ALV-J致瘤性影響Table 3 The tumorigenicity of SPF chicken with ALV-J congenital infection

圖4 黃芪多糖組肝腫瘤病變Fig.4 The liver lesion of autopsy and histopathological examination in the astragalan group

圖5 甲砜霉素組腫瘤病變Fig.5 The lesion of autopsy and histopathological examination in the thiamphenicol group

2.8 藥物對雛雞先天性感染ALV-J血細(xì)胞指標(biāo)的影響

在1到5日齡連續(xù)用藥5 d后，黃芪多糖組的白細(xì)胞總數(shù)和淋巴細(xì)胞總數(shù)均比另外兩組高，而甲砜霉素組的白細(xì)胞總數(shù)和淋巴細(xì)胞總數(shù)顯著低于另兩組，在第三次用完藥后，各組之間白細(xì)胞總數(shù)和淋巴細(xì)胞總數(shù)差異不明顯（圖7）。

3 討 論

自J亞群白血病被發(fā)現(xiàn)以來，國內(nèi)外眾多學(xué)者對該病進(jìn)行了大量研究，包括該病的病原學(xué)［14］、流行病學(xué)［15-16］、致瘤機制［17］和診斷方法［18-19］等方面，但是目前尚無有效防制該病的疫苗或藥物，只能通過種群凈化。鑒于我國雞的養(yǎng)殖數(shù)量大，品種多，該病感染重，短期內(nèi)難以實現(xiàn)全部凈化，尋找凈化輔助藥物具有特殊意義。黃芪多糖提取于中藥材黃芪，能增強機體的細(xì)胞及體液免疫，促進(jìn)免疫器官的發(fā)育［20-21］，還具有直接協(xié)助機體抗腫瘤作用［7-10］。前期體外試驗［11］結(jié)果表明0.003 9～0.062 5 mg·m L-1的黃芪多糖可以抑制ALV-J在DF1細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。本試驗中，黃芪多糖組早期白細(xì)胞總數(shù)和淋巴細(xì)胞總數(shù)均比另外兩組高，雖然黃芪多糖組在體重和新城疫抗體水平與病毒對照組無顯著差異，但是該組的腫瘤發(fā)生率（4／35）比病毒對照組（7／35）低，說明黃芪多糖雖然不能完全抑制ALV-J導(dǎo)致的腫瘤發(fā)生，但對ALV-J的致瘤作用具有一定的防制效果?？梢杂糜谟r雞的保健，尤其是用于白血病未凈化雞群的保健。

圖6 病毒感染對照組腫瘤病變Fig.6 The lesion of autopsy and histopathological examination in the positive group

圖7 血常規(guī)中白細(xì)胞（A）和淋巴細(xì)胞（B）數(shù)檢測結(jié)果Fig.7 The results of leukocyte detection（A）and lymphocyte detection（B）

甲砜霉素是第二代氯霉素類抗生素，雖然已消除氯霉素所導(dǎo)致的再生障礙性貧血（白血?。５跃哂信c氯霉素相同的不良反應(yīng)，即免疫抑制及影響造血功能［13］。在1～5日齡連續(xù)用藥5 d后，與另外兩組相比，該藥能顯著降低血液中的白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的含量。42日齡時免疫器官（脾和法氏囊）指數(shù)顯著降低，尤其是對法氏囊的抑制作用極為明顯。甲砜霉素組前期體重比另外兩組高，這可能與甲砜霉素作為抗生素具有抑制大腸桿菌等病原菌感染及促生長作用有關(guān)，但是60 d之后甲砜霉素組的平均體重則顯著低于黃芪多糖組和病毒對照組，這可能與甲砜霉素的免疫抑制作用，造成雛雞抵抗力下降，腫瘤發(fā)生率顯著升高有關(guān)。甲砜霉素組的腫瘤發(fā)生率（10／35）明顯高于另外兩組，腫瘤類型多，可見血管瘤、髓樣細(xì)胞瘤、淋巴肉瘤、纖維肉瘤和腺癌。另外，該組腫瘤病程進(jìn)展快，病變程度也更加嚴(yán)重，這些都充分說明甲砜霉素對ALV-J的致瘤作用具有明顯的促進(jìn)作用。該試驗也進(jìn)一步說明盡管白血病的發(fā)生主要與ALV感染有關(guān)，但許多誘發(fā)因素對腫瘤的發(fā)生也具有重大影響。鑒于在生產(chǎn)中甲砜霉素被廣泛應(yīng)用于育雛雞的保健，以防治雞沙門菌、大腸桿菌及支原體感染，因此，該藥帶來的副作用應(yīng)引起人們的高度重視，建議2周齡以內(nèi)的雛雞不要應(yīng)用甲砜霉素。

4 結(jié) 論

育雛早期應(yīng)用甲砜霉素會導(dǎo)致雛雞免疫抑制，促進(jìn)ALV-J的致瘤作用，患病雞腫瘤呈多樣化。黃芪多糖對ALV-J致腫瘤具有一定的抑制作用，但未發(fā)現(xiàn)對病毒血癥的影響。

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