CD8α在雄性牦牛主要免疫器官的分布

張 倩，楊 琨，黃玉風(fēng)，潘陽(yáng)陽(yáng)，余四九，何俊峰，劉鵬剛，崔 燕

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州730070）

牦牛（Bos grunniens）被譽(yù)為高原之舟，生活在海拔3 km以上的青藏高原，高寒、缺氧及強(qiáng)輻射是高原地區(qū)最主要的應(yīng)激因子，應(yīng)對(duì)這些生態(tài)壓力，牦牛機(jī)體免疫和健康狀況發(fā)揮至關(guān)重要的作用。流行病學(xué)調(diào)查表明，牦牛疫病主要為細(xì)菌性傳染病和寄生蟲病，呈散發(fā)性發(fā)生，治療后未形成流行［1-3］。牦牛具有較好的抗寒抗病能力，因此對(duì)其免疫器官研究具有特殊的意義和價(jià)值。胸腺為機(jī)體中樞免疫器官，是T淋巴細(xì)胞的發(fā)育、成熟的場(chǎng)所［4-5］。脾、淋巴結(jié)及血結(jié)為次級(jí)免疫器官，是T細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)發(fā)生的場(chǎng)所［6-8］。本課題組前期對(duì)牦牛胸腺及脾的增齡性形態(tài)特征進(jìn)行了初步研究［9-10］。有學(xué)者報(bào)道牦牛血結(jié)微細(xì)結(jié)構(gòu)與脾更相似［11］，有關(guān)牦牛免疫器官內(nèi)相關(guān)免疫活性分子及細(xì)胞仍未見報(bào)道。

CD8分子最初發(fā)現(xiàn)于鼠類［12］，是細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）重要的表面標(biāo)記物，一般以二聚體形式：αα同型和αβ異型存在于細(xì)胞表面［13-14］。CD8分子通過(guò)α鏈可穩(wěn)定CTL與靶細(xì)胞結(jié)合，參與CTL活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和胸腺細(xì)胞陽(yáng)性選擇過(guò)程，β鏈一般不直接參與CD8分子生物功能，而是輔助α鏈完成有效信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的發(fā)生［15］。CD8α＋CTL通過(guò)其TCR識(shí)別靶細(xì)胞表面抗原肽-MHCI類分子復(fù)合物，介導(dǎo)人和動(dòng)物機(jī)體抗胞內(nèi)寄生菌、病毒、某些真菌感染以及抗腫瘤，具有CTL表位的疫苗能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的保護(hù)性免疫應(yīng)答［16-17］。對(duì)生理?xiàng)l件下，牦牛以CD8α＋T淋巴細(xì)胞為主的T細(xì)胞亞群進(jìn)行組織分布研究及定量檢測(cè)，將為揭示傳染病的致病與免疫機(jī)理以及研制安全高效疫苗提供重要的理論指導(dǎo)和評(píng)價(jià)依據(jù)。CD8分子在免疫器官的數(shù)量及分布研究主要集中在牛［18-19］、羊［20］、兔［21］、貓［22］、袋鼠［23］等動(dòng)物，有關(guān)牦牛CD8分子研究未見報(bào)道。

本研究采用RT-PCR法克隆牦牛CD8α基因序列，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blot及免疫組織化學(xué)SP法對(duì)成年牦牛胸腺、脾、腸系膜淋巴和血結(jié)內(nèi)CD8αm RNA及蛋白的表達(dá)進(jìn)行分析，初步了解成年雄性牦牛的機(jī)體免疫狀態(tài)及其抵抗病原體（細(xì)菌、病毒及寄生蟲）的主動(dòng)防御能力，以期為適時(shí)免疫、致病機(jī)理和疾病防治等研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

2014年9月中旬在青海西寧屠宰場(chǎng)采集3歲成年健康雄性牦牛胸腺、脾、位于空腸的腸系膜淋巴結(jié)及血結(jié)，各5頭份。部分放入4%中性多聚甲醛，用于石蠟切片免疫組化。部分迅速放入液氮中過(guò)夜，次日移至-80℃冰柜中保存，以備下一步提取組織中的RNA和蛋白質(zhì)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 牦牛CD8α基因測(cè)序引物（yak CD8α）根據(jù)GenBank登錄的黃牛（Bos taurus，BC151259.1）、印度水牛（Bubalus bubalis，XM＿006074749.1）、藏羚羊（Pantholops hodgsonii，XM＿005954881.1）、綿羊（Ovis aries，XM＿004007263.1），用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，根據(jù)測(cè)序所得牦牛CD8α（KP030823.1）和牦牛β-actin（DQ838049）內(nèi)參基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)熒光定量引物，由TaKaRa公司合成（表1），序列分析使用NCBI中的BLAST［24］、MEGA5［25］和DNAman［26］軟件。

1.2.2 mRNA的提取，反轉(zhuǎn)錄cDNA及PCR擴(kuò)增按照TRIzol（Invitrogen）總RNA抽提試劑說(shuō)明書提取各免疫器官總RNA。根據(jù)Invitrogen公司的Super Script TMⅢFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR試劑盒說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應(yīng)體系為20μL（模板1μL，上下游引物各0.5μL，Taq PCR Master Mix 10μL，無(wú)菌去離子水8μL。反應(yīng)結(jié)束后，取10μL PCR產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，紫外燈下觀察，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。DNA膠回收試劑盒（TaKaRa）回收PCR產(chǎn)物片段，回收產(chǎn)物送華大基因公司測(cè)序。

表1 PCR擴(kuò)增引物和熒光定量PCR引物Table 1 PCR primers used in the RT-PCR and real-time RT-PCR

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)免疫器官內(nèi)CD8α mRNA表達(dá) 使用羅氏熒光定量PCR Lightcycler 480儀器進(jìn)行。定量PCR反應(yīng)體系：SYBR Premax Taq（TaKaRa）10μL、上下游引物各0.5 μL、c DNA樣品1μL和滅菌超純水8μL。定量PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s，62℃退火10 s，72℃延伸15 s，共45個(gè)循環(huán)；95℃5 s，65℃1 min，40℃30 s。每個(gè)循環(huán)的退火及延伸階段采集熒光信號(hào)數(shù)據(jù)。擴(kuò)增結(jié)束后，立即進(jìn)行熔解曲線分析，系統(tǒng)自動(dòng)分析數(shù)據(jù)后生成熔解曲線，以確定樣品擴(kuò)增的特異性。根據(jù)熒光定量PCR給出的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線中的擴(kuò)增效率計(jì)算出定量結(jié)果，所得結(jié)果采用定量分析軟件進(jìn)行分析，目的基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增效率接近，為100%±5%，熒光定量PCR表達(dá)量用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析［27］。每管樣品設(shè)4個(gè)重復(fù)。

1.2.4 Western blot方法檢測(cè)免疫器官內(nèi)CD8α蛋白水平表達(dá) 采取的胸腺、脾、腸系膜淋巴結(jié)及血結(jié)組織在液氮中研磨后，按1 m L RIPA＋10μL PMSF·（100 mg）-1（Solarbio）的比例加入RIPA和PMSF（先加RIPA再加PMSF），勻漿約30 min。4℃1 200 g離心5 min，收集上清，用BCA法測(cè)定蛋白的含量。調(diào)整蛋白濃度，按比例加入4×SDS上樣緩沖液（Solarbio），沸水煮約10 min，使蛋白變性。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，每孔上樣量為10 μL，當(dāng)?shù)鞍着苤练蛛x膠，電壓由80 V切換為100 V直至電泳結(jié)束。用300 m A的電流在4℃冰箱內(nèi)電泳1～2 h，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF（Solarbio）膜。再以5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入一抗小鼠Anti-CD8（1／200）（MCA837GA，Ab D Serotec）及小鼠Anti-Actin（I-19，Santa Cruz）4℃孵育過(guò)夜，PBS洗后分別加入二抗羊抗鼠（sp-0024，Bioss）37℃孵育2 h。加入ECL曝光液（碧云天）顯色5～10 min觀察結(jié)果，以β-actin為內(nèi)參照。通過(guò)ImageJ軟件分析WB條帶的灰度值，進(jìn)而得出蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 免疫組化方法檢測(cè)免疫器官內(nèi)CD8α蛋白水平的表達(dá) 石蠟切片脫蠟至水，0.03%H2O2孵育10 min以封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，按免疫組織化學(xué)SP法程序進(jìn)行染色。一抗小鼠Anti-CD8（MCA837GA，Ab D Serotec）按1／50稀釋，4℃冰箱孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育10 min，SABC復(fù)合物室溫孵育10 min（Solarbio）。以上各步驟之間均用0.01 mol·L-1PBS，p H 7.3洗3 min×3次。AEC顯色30 min，脫水，透明，中性樹膠封片。應(yīng)用Olympus-71型光學(xué)顯微鏡觀察并照相。陰性對(duì)照用BSA取代一抗進(jìn)行孵育，其余步驟、條件均相同。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）。使用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。全部數(shù)據(jù)均用“±SE”表示，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著，P＞0.05為差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 RT-PCR及實(shí)時(shí)熒光定量PCR

分別提取牦牛胸腺、脾、腸系膜淋巴結(jié)及血結(jié)組織總RNA。擴(kuò)增得到包含CD8α編碼區(qū)序列的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為970 bp提交至GenBank（KP030823.1），CD8α熒光定量引物擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為213 bp，內(nèi)參β-actin熒光定量引物擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為207 bp（圖1）。使用DNAman軟件分析可知牦牛CD8αm RNA的編碼區(qū)為13～741 bp，全長(zhǎng)729 bp，編碼243個(gè)氨基酸。將牦牛CD8α蛋白與其他物種CD8α的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，顯示與黃牛（Bos taurus）同源性最高，為99.7%，與印度水牛（Bubalus bubalis）、藏羚羊（Pantholops hodgsonii）、山羊（Capra hircus）、綿羊（Ovis aries）、寬吻海豚（Tursiops truncatus）、野豬（Sus scrofa）、單峰駝（Camelus dromedarius）的同源性分別為96.9%、94.1%、92.3%、86.8%、80.6%、72.5%和71.6%（圖2，圖3）。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示：CD8αm RNA在牦牛胸腺、脾、腸系膜淋巴結(jié)及血結(jié)均有表達(dá)；且在胸腺相對(duì)表達(dá)量最高，分別是脾、血結(jié)及腸系膜淋巴結(jié)的6.13倍、8.23倍和40.71倍（P＜0.01）（圖4A）。

圖1 RT-PCR反應(yīng)結(jié)果Fig.1 The results of RT-PCR

圖2 獨(dú)立元素法構(gòu)建牦牛CD8α基因進(jìn)化樹Fig.2 The phylogenetic tree of yak CD8αwas constructed by independent element method

圖3 牦牛CD8α蛋白與其他物種氨基酸序列的多重比對(duì)Fig.3 The multiple alignment of amino acid sequences of yak CD8αwith other species

2.2 Western blot結(jié)果

分別提取牦牛胸腺、脾、腸系膜淋巴結(jié)及血結(jié)總蛋白，調(diào)整各組蛋白濃度后進(jìn)行Western blot。結(jié)果表明CD8蛋白在牦牛各淋巴組織均有表達(dá)，且在胸腺相對(duì)表達(dá)量最高，分別是脾、血結(jié)及腸系膜淋巴結(jié)的2.64倍、3.75倍和10.82倍（P＜0.01）（圖4B，4C）。

2.3 組織結(jié)構(gòu)觀察及免疫組織化學(xué)結(jié)果

胸腺CD8＋細(xì)胞在皮質(zhì)、髓質(zhì)都有分布（圖5A）；脾CD8＋細(xì)胞主要分布在動(dòng)脈周圍淋巴鞘和紅髓，脾小結(jié)周邊及內(nèi)部也有部分陽(yáng)性細(xì)胞（圖5B）；腸系膜淋巴結(jié)內(nèi)，CD8＋細(xì)胞主要分布在淋巴小結(jié)周邊及髓質(zhì)，淋巴小結(jié)內(nèi)部有少量分布（圖5C）；血結(jié)內(nèi)分布情況與腸系膜淋巴結(jié)類似，CD8＋細(xì)胞主要分布在淋巴小結(jié)周邊及髓質(zhì)，淋巴小結(jié)內(nèi)部有少量分布（圖5D）。

3 討 論

對(duì)牦牛CD8α序列測(cè)序結(jié)果顯示其編碼區(qū)全長(zhǎng)為729 bp，編碼243個(gè)氨基酸。將所得序列與Gen-Bank中其他物種氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，顯示牦牛與黃牛氨基酸序列同源性最高，其次為印度水牛、藏羚羊、山羊、綿羊、寬吻海豚、野豬，與單峰駝同源性最低。結(jié)果表明CD8α在同屬種動(dòng)物間同源性較高，牦牛其他免疫蛋白是否也存在相似的同源性有待研究。

圖4 CD8αmRNA及蛋白在牦牛免疫器官的表達(dá)Fig.4 The expression of CD8αmRNA and protein in yak immune organs

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果和Western blot結(jié)果顯示，在牦牛胸腺、脾、腸系膜淋巴結(jié)及血結(jié)內(nèi)，均有CD8αmRNA和蛋白的表達(dá)，說(shuō)明在正常生理?xiàng)l件下，CD8α基因和蛋白廣泛表達(dá)于牦牛各免疫器官；CD8αm RNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量在牦牛胸腺中最高，脾、血結(jié)次之，腸系膜淋巴結(jié)最低，表明CD8α基因和蛋白的表達(dá)在牦牛各組織器官中存在差異，這與W.Zhang等［19］對(duì)周邊免疫器官研究結(jié)果相符，即CD8蛋白在脾表達(dá)量高于血結(jié)，腸系膜淋巴結(jié)最低。推測(cè)這種差異性可能由于胸腺是負(fù)責(zé)T淋巴細(xì)胞分化和成熟的中樞免疫器官，CD4-CD8-前T細(xì)胞從骨髓或肝臟進(jìn)入胸腺皮質(zhì)，進(jìn)行陰性和陽(yáng)性選擇，之后轉(zhuǎn)化為CD4＋CD8＋表型，最后約5%T細(xì)胞經(jīng)過(guò)受體重排，轉(zhuǎn)化為成熟CD4＋或CD8＋T細(xì)胞，向血液及其他淋巴組織（如淋巴結(jié)、脾及黏膜相關(guān)淋巴組織）遷移［28］。因此，大量不成熟 的雙陽(yáng)性CD4＋CD8＋及成熟單陽(yáng)性CD8＋T淋巴細(xì)胞的共同存在，使胸腺細(xì)胞CD8表達(dá)量較高。另外，本研究結(jié)果顯示CD8αmRNA和蛋白在血結(jié)與脾表達(dá)量高于腸系膜淋巴結(jié)，這與前人對(duì)牛［19，29］、羊［30］的研究結(jié)果相似。這種差異可能由于脾和血結(jié)是分布在血液循環(huán)通路上的免疫器官，而淋巴結(jié)分布在淋巴循環(huán)通路上，T淋巴細(xì)胞表達(dá)不同的趨化因子及其受體。CD8αmRNA和蛋白在血結(jié)的表達(dá)量與脾極為相似，但顯著高于腸系膜淋巴結(jié)，另外，W.Zhang等學(xué)者研究表明，在血結(jié)內(nèi)免疫分子CD4及MHC II的表達(dá)量均高于脾［19］，提示血結(jié)可能與脾和腸系膜淋巴結(jié)一樣，在細(xì)胞免疫方面發(fā)揮重要作用。

免疫組化試驗(yàn)結(jié)果表明，在正常生理?xiàng)l件下，胸腺CD8＋細(xì)胞在皮質(zhì)、髓質(zhì)都有分布，這與前人的研究結(jié)果類似［18，23］。另外，在脾CD8＋細(xì)胞主要分布在動(dòng)脈周圍淋巴鞘和紅髓髓索；腸系膜淋巴結(jié)內(nèi)分布情況與血結(jié)類似，CD8＋細(xì)胞主要分布在淋巴小結(jié)周邊及髓質(zhì)。這與前人對(duì)不同動(dòng)物CD8＋細(xì)胞在次級(jí)免疫器官分布的研究結(jié)果相似［18，21，23］，即陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在T細(xì)胞依賴區(qū)：動(dòng)脈周圍淋巴鞘及紅髓、淋巴結(jié)小結(jié)周邊及淋巴索。推測(cè)這些位置可能是抗原捕獲發(fā)生的主要部位，CD8＋T細(xì)胞主要在此執(zhí)行殺傷病毒感染細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷效應(yīng)。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，少量CD8＋細(xì)胞分布在脾、腸系膜淋巴結(jié)及血結(jié)的生發(fā)中心，這與 W.Zhang［19］等及B.H.Thorp等［20］結(jié)論不一致，他們認(rèn)為次級(jí)免疫器官的生發(fā)中心無(wú)CD8陽(yáng)性表達(dá)，這個(gè)有爭(zhēng)議的結(jié)果可能與抗體特異性相關(guān)，也可能由于動(dòng)物機(jī)體在應(yīng)對(duì)不同外來(lái)抗原（寄生蟲、細(xì)菌及病毒）時(shí)所處的免疫狀態(tài)有差異而致。另外資料顯示，次級(jí)淋巴器官的淋巴濾泡內(nèi)分布有一定數(shù)量樹突細(xì)胞，并且這種樹突細(xì)胞表面攜帶CD8標(biāo)記物［31］，這與本研究的結(jié)果相似。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果顯示，CD8αm RNA及蛋白在雄性牦牛各免疫器官中均有表達(dá)，且在胸腺表達(dá)量最高，脾、血結(jié)次之，腸系膜淋巴結(jié)表達(dá)量最低（P＜0.01）。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，CD8＋T細(xì)胞在胸腺皮質(zhì)、髓質(zhì)均有分布；在脾主要分布在動(dòng)脈周圍淋巴鞘和紅髓髓索；在腸系膜淋巴結(jié)及血結(jié)內(nèi)，則主要分布在淋巴小結(jié)周邊及髓索。以上結(jié)果提示，牦牛胸腺為CD8＋T細(xì)胞主要的輸出器官，其輸出量可能影響次級(jí)淋巴器官內(nèi)T細(xì)胞含量；血結(jié)可能與淋巴結(jié)及脾一樣，在細(xì)胞免疫發(fā)揮同等重要的作用。這些數(shù)據(jù)將為牦牛免疫遺傳學(xué)和免疫生物學(xué)等相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

圖5 CD8在牦牛免疫器官表達(dá)的免疫組織化學(xué)結(jié)果200×Fig.5 Immunohistochemistry of CD8 in yak immune organs 200×

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