PI3K／Akt抑制劑對(duì)雞朊蛋白過表達(dá)DF-1細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響

萬學(xué)瑞，朱曼玲，楊潤霞，劉桂林，劉 磊，吳 潤

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州730070）

PI3K／Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路廣泛存在于細(xì)胞中，Akt是此通路中的一個(gè)關(guān)鍵分子，活性主要由PI3K的產(chǎn)物調(diào)控。胞外信號(hào)可以通過激活受體酪氨酸激酶（RTK）或G蛋白偶聯(lián)受體而激活PI3K，其產(chǎn)物使Akt磷酸化，p-Akt可在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)磷酸化多種蛋白質(zhì)分子，通過改變下游分子的磷酸化狀態(tài)參與細(xì)胞的生長、增殖和存活。PI3K／Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞生長增殖的重要因素，使細(xì)胞維持周期運(yùn)行［1］。渥曼青霉素（wortmannin，WM）是絲狀真菌繩狀青霉（Penicillium funiculosum）的代謝產(chǎn)物，可特異性、不可逆的抑制PI3K活性，阻斷PI3K／Akt信號(hào)通路。

細(xì)胞型朊蛋白（cellular prion protein，Pr PC）是由細(xì)胞自身基因編碼，普遍表達(dá)在真核細(xì)胞膜上的GPI錨定蛋白［2］。哺乳動(dòng)物細(xì)胞型朊蛋白錯(cuò)誤折疊形成異常癢病型朊蛋白（scrapie prion protein，Pr PSC）可致傳染性海綿狀腦病，但在非哺乳動(dòng)物體內(nèi)卻未見發(fā)?。?］。多項(xiàng)研究已證明哺乳動(dòng)物細(xì)胞型朊蛋白具有多種生理功能，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡、侵襲、黏附、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、銅離子代謝和氧化應(yīng)激等過程［4-10］，但具體機(jī)制還不清楚。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)雞細(xì)胞型朊蛋白（ChPr PC）表達(dá)及分布規(guī)律同哺乳動(dòng)物Pr PC相似［11］，通過構(gòu)建雞細(xì)胞型朊蛋白過表達(dá)的雞成纖維（DF-1）穩(wěn)定細(xì)胞系（DF-1-PrP）證實(shí)其可促進(jìn)DF-1細(xì)胞黏附、增殖和侵襲，抑制其凋亡［12］，進(jìn)一步應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)雞細(xì)胞型朊蛋白過表達(dá)DF-1細(xì)胞的Akt基因表達(dá)量明顯高于DF-1細(xì)胞，推測雞細(xì)胞型朊蛋白可能參與Akt的激活，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞生長與抑制細(xì)胞凋亡［13］。為了證實(shí)這一推測，本研究擬利用渥曼青霉素阻斷PI3K／Akt信號(hào)通路，探討其對(duì)雞細(xì)胞型朊蛋白過表達(dá)DF-1細(xì)胞黏附、增殖、侵襲和凋亡的影響及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 DF-1細(xì)胞、DF-1-Pr P細(xì)胞（Ch Pr PC過表達(dá)DF-1細(xì)胞）和DF-1-NC細(xì)胞（導(dǎo)入空表達(dá)載體pCDNA3.1的DF-1細(xì)胞），均由本實(shí)驗(yàn)室保存或構(gòu)建。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清（FBS，Hy Clone公司），鼠尾膠原（杭州生友生物技術(shù)有限公司）；G418、DMEM、無血清培養(yǎng)基（GIBCO公司），渥曼青霉素（Alexis公司），噻唑藍(lán)（MTT）、臺(tái)盼藍(lán)（上海酶聯(lián)生化試劑有限公司），Annexin V-FICT／PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（上海貝博生物公司），Transwell小室（Costar公司），牛血清白蛋白（BSA，西安依科生物技術(shù)有限公司），其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器 MyCyclerTMThermal Cycler EN-61010 PCR儀（美國BIO-RDA公司），Light Cycler 480Ⅱ熒光定量PCR儀（美國Roche公司）；酶標(biāo)儀680（美國BIO-RAD公司），F(xiàn)ACSCalibur flow cytometer（美國BD公司）等。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) DF-1-PrP、DF-1-NC和DF-1細(xì)胞用含10%胎牛血清、青霉素（100 U·m L-1）和鏈霉素（100 U·m L-1）的DMEM培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%以上時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化傳代，傳3代穩(wěn)定后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 黏附試驗(yàn) 將鼠尾膠原用6 mmol·L-1無菌乙酸配制成6.25 mg·L-1的溶液，50 μL·孔-1加入96孔培養(yǎng)板，4℃過夜制備基底膜，吸出孔中殘余液體，加入50μL無血清培養(yǎng)基37℃孵育30 min水化基底膜。將對(duì)數(shù)生長期的DF-1-Pr P、DF-1-NC和DF-1細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×105·m L-1，100 μL·孔-1分別接種于包被鼠尾膠原的孔中，再加入渥曼青霉素使其終濃度分別為0、10、20、50、100、200 nmol·L-1，每組4個(gè)重復(fù)，37℃5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞，以包被牛血清白蛋白（BSA）為對(duì)照。細(xì)胞培養(yǎng)1 h后，用PBS溶液小心的洗細(xì)胞3次，按照MTT比色法測定培養(yǎng)板各孔的光吸收值（A值），試驗(yàn)重復(fù)3次。應(yīng)用如下公式分別計(jì)算各組細(xì)胞的黏附率：黏附率（%）＝［（處理組A值／BSA對(duì)照組A值）-1］×100%。

1.2.3 侵襲試驗(yàn) 用6.25 mg·L-1鼠尾膠原溶液包被Transwell小室，4℃過夜風(fēng)干，吸出殘余液體，加入50μL無血清培養(yǎng)基，37℃孵育30 min。用0.25%的胰蛋白酶消化處于對(duì)數(shù)生長期的DF-1-Pr P、DF-1-NC和DF-1細(xì)胞，無血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞（1×105·m L-1）。在下室中加入400μL按1∶1混合的完全培養(yǎng)液和條件培養(yǎng)液（DF-1細(xì)胞生長至80%以上融合，換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后收集培養(yǎng)上清液，過濾除菌），上室中加入100μL細(xì)胞懸液，再加入渥曼青霉素使其終濃度分別為0、10、20、50、100、200 nmol·L-1，每組4個(gè)重復(fù)，37℃5%的CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)基，擦凈上室細(xì)胞，取出Transwell用PBS洗2次，95%的乙醇溶液固定細(xì)胞15 min，風(fēng)干；加4 g·L-1的臺(tái)盼藍(lán)溶液染色20 min，PBS洗3次，倒置顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野的細(xì)胞，取平均數(shù)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長期的DF-1-PrP、DF-1-NC和DF-1細(xì)胞（1× 105·m L-1），100μL·孔-1接種96孔培養(yǎng)板中，加入渥曼青霉素使其終濃度分別為0、10、20、50、100、200 nmol·L-1，以DMEM培養(yǎng)液為空白對(duì)照，每組3個(gè)重復(fù)。細(xì)胞培養(yǎng)12、24、36、48、60 h后，每孔加入20μL MTT（5 mg·m L-1）溶液，置于CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h后吸出孔內(nèi)液體，再加入150μL DMSO振蕩10 min。用酶標(biāo)儀檢測，讀取OD490nm處的吸光值。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 在對(duì)數(shù)生長期的DF-1-PrP、DF-1-NC和DF-1細(xì)胞中加入渥曼青霉素使其終濃度分別為0、10、20、50、100、200 nmol·L-1，作用24 h后，消化收集細(xì)胞（1× 107·m L-1），按Annexin V-FICT／PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，冷PBS洗細(xì)胞2次，加入200μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，再加入10 μL Annexin V-FITC和5μL PI，輕搖混勻，孵育15 min；上述溶液中加入300μL結(jié)合緩沖液充分混勻，立即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.6 不同渥曼青霉素濃度下PRNP基因的轉(zhuǎn)錄量檢測 在對(duì)數(shù)生長期的DF-1-Pr P、DF-1-NC和DF-1細(xì)胞中加入渥曼青霉素使其終濃度分別為0、10、20、50、100 nmol·L-1，作用24 h后，收集細(xì)胞提取總RNA。利用本實(shí)驗(yàn)室建立的雞PrPC基因mRNA定量RT-PCR檢測方法，檢測PRNP基因mRNA表達(dá)量［13］。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件One-Way分析（Anova）或t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以±s表示，P＜0.05，P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 渥曼青霉素以劑量依賴方式抑制DF-1-PrP細(xì)胞黏附

細(xì)胞黏附試驗(yàn)結(jié)果如表1所示，渥曼青霉素濃度為0 nmol·L-1時(shí)，各細(xì)胞黏附率均最高，且DF-1-Pr P細(xì)胞黏附率比DF-1-NC細(xì)胞和DF-1細(xì)胞分別高26.04%和26.18%，差異極顯著（P＜0.01），隨著渥曼青霉素濃度的升高，各細(xì)胞的黏附率均顯著下降。渥曼青霉素濃度10～50 nmol·L-1時(shí)，DF-1-Pr P細(xì)胞黏附率極顯著（P＜0.01）高于DF-1和DF-1-NC細(xì)胞；100 nmol·L-1時(shí)，DF-1-Pr P細(xì)胞黏附率顯著（P＜0.05）高于DF-1和DF-1-NC細(xì)胞；渥曼青霉素濃度達(dá)到200 nmol·L-1時(shí)，DF-1-PrP、DF-1-NC和DF-1細(xì)胞的黏附率無顯著差異；當(dāng)渥曼青霉素濃度200 nmol·L-1時(shí)，3種細(xì)胞的黏附率分別被抑制了87.46%、72.65%和84.32%。

2.2 渥曼青霉素以劑量依賴方式抑制DF-1-Pr P細(xì)胞侵襲

細(xì)胞侵襲試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，渥曼青霉素濃度為0 nmol·L-1時(shí)，各細(xì)胞的侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)最多，其侵襲力最強(qiáng)，隨著渥曼青霉素濃度的升高，細(xì)胞的侵襲力顯著下降，但同一渥曼青霉素濃度下DF-1-Pr P細(xì)胞侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)顯著高于DF-1-NC和DF-1細(xì)胞（P＜0.05或P＜0.01）。當(dāng)渥曼青霉素濃度高于100 nmol·L-1時(shí)，DF-1-Pr P、DF-1-NC和DF-1細(xì)胞均不見侵襲穿膜細(xì)胞。

表1 不同濃度渥曼青霉素對(duì)細(xì)胞黏附率的影響Table 1 Effects of different concentration wortmannin（WM）on cell adhesion rates %

表2 不同濃度渥曼青霉素對(duì)細(xì)胞侵襲（侵襲細(xì)胞數(shù)）的影響Table 2 Effects of different concentration wortmannin on cell invasion（Cell numbers of invasion）

2.3 渥曼青霉素以劑量和時(shí)間依賴方式抑制DF-1-Pr P細(xì)胞增殖

應(yīng)用MTT法檢測細(xì)胞的增殖，結(jié)果顯示（圖1），不加渥曼青霉素時(shí)，DF-1-Pr P、DF-1-NC和DF-1細(xì)胞增殖活性均高于其渥曼青霉素處理的增殖活性；隨著渥曼青霉素濃度的增加和作用時(shí)間的延長，增殖抑制作用明顯增強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯的時(shí)效和量效關(guān)系。同時(shí)在渥曼青霉素濃度低于50 nmol·L-1時(shí)，DF-1-Pr P細(xì)胞具有抗渥曼青霉素的能力，與DF-1-NC和DF-1細(xì)胞相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；而當(dāng)渥曼青霉素濃度大于50 nmol·L-1時(shí)其幾乎完全抑制了各細(xì)胞的增殖。

圖1 不同渥曼青霉素濃度對(duì)細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effects of different concentration wortmannin on cell proliferation

2.4 渥曼青霉素以劑量依賴方式促進(jìn)DF-1-Pr P細(xì)胞凋亡

細(xì)胞經(jīng)Annexin-V-FITC／PI雙染后流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)果顯示（圖2），在無渥曼青霉素處理時(shí)，DF-1-Pr P細(xì)胞總凋亡率（5.96%）低于DF-1-NC細(xì)胞（10.27%）和DF-1細(xì)胞（13.85%）。隨著渥曼青霉素濃度的增加，各細(xì)胞的總凋亡率均升高，而且呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系；渥曼青霉素濃度低于20 nmol·L-1以下時(shí)，對(duì)各細(xì)胞的凋亡率影響較小，當(dāng)渥曼青霉素濃度高于50 nmo·L-1時(shí)，渥曼青霉素濃度對(duì)各細(xì)胞的凋亡率影響非常大。在同一渥曼青霉素濃度下，DF-1-PrP細(xì)胞的凋亡率低于DF-1-NC和DF-1細(xì)胞；尤其渥曼青霉素濃度為100、200 nmol·L-1時(shí)，DF-1-NC和DF-1細(xì)胞幾乎全部凋亡，但DF-1-Pr P細(xì)胞仍有56.63%和15.54%的細(xì)胞存活，具有抗渥曼青霉素的能力。

圖2 不同濃度渥曼青霉素對(duì)細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effects of different concentration wortmannin on cell apoptosis

2.5 不同渥曼青霉素濃度下PRNP基因的轉(zhuǎn)錄量分析

利用本實(shí)驗(yàn)室建立的雞PRNP基因m RNA實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測方法，檢測DF-1-Pr P、DF-1-NC和DF-1細(xì)胞PRNP基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量，結(jié)果顯示（圖3），加入渥曼青霉素時(shí)各細(xì)胞PRNP基因的mRNA拷貝數(shù)均出現(xiàn)變化；隨著渥曼青霉素濃度的增加，PRNP基因的mRNA拷貝數(shù)呈現(xiàn)出下降的趨勢。在同一渥曼青霉素濃度下，DF-1-PrP細(xì)胞PRNP基因的mRNA拷貝數(shù)均顯著高于DF-1-NC和DF-1細(xì)胞。

圖3 不同濃度渥曼青霉素對(duì)PRNP基因mRNA拷貝數(shù)的影響Fig.3 Effects of different wortmannin concentration on mRNA copy number of PRNP

3 討 論

Akt的活性與抗細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞生長、增殖和能量代謝有關(guān)。在腫瘤細(xì)胞中Akt的表達(dá)量較正常細(xì)胞高，有加速白血病細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞程序性死亡的作用［14］，激活A(yù)kt還可改變細(xì)胞遷移和侵襲，提高卵巢腫瘤細(xì)胞的侵襲能力［15］。敲除小鼠的PrPC基因可明顯降低p-Akt表達(dá)量，加劇腦缺血后的神經(jīng)損傷［16］。Pr PC和p-Akt在胃癌組織中協(xié)同表達(dá)，p-Akt有可能在Pr PC介導(dǎo)的胃癌惡性表型中發(fā)揮作用［17］。但雞細(xì)胞型朊蛋白的生理功能及其機(jī)制還未見報(bào)道，為此作者構(gòu)建了Ch Pr PC過表達(dá)的雞成纖維細(xì)胞系DF-1-Pr P及空載體細(xì)胞系DF-1-NC。本試驗(yàn)中，作者應(yīng)用PI3K／Akt抑制劑渥曼青霉素阻斷該信號(hào)通路，探討其對(duì)Pr PC介導(dǎo)的細(xì)胞增殖、黏附、侵襲和凋亡過程的影響。結(jié)果顯示，渥曼青霉素濃度為0 nmol·L-1時(shí)，DF-1-Pr P、DF-1-NC和DF-1細(xì)胞的增殖、黏附、侵襲能力均最高，總凋亡率均最低；且DF-1-Pr P細(xì)胞增殖、黏附、侵襲能力均高于DF-1-NC細(xì)胞和DF-1細(xì)胞，而總凋亡率卻低于DF-1-NC細(xì)胞和DF-1細(xì)胞，差異顯著（P＜0.05），說明ChPrPC的過量表達(dá)可促進(jìn)DF-1-Pr P細(xì)胞增殖、黏附、侵襲，抑制其凋亡，這和PrPC在哺乳動(dòng)物中的功能相似［7］。隨著渥曼青霉素濃度的增加，DF-1-Pr P、DF-1-NC和DF-1細(xì)胞各自的PRNP基因mRNA表達(dá)量均減少，其增殖、黏附、侵襲能力相應(yīng)下降，而總凋亡率均升高，且呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，這證實(shí)了文獻(xiàn)報(bào)道的PI3K／Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞存活最重要的途徑之一［18］，ChPrPC至少部分是通過PI3K／Akt信號(hào)通路對(duì)DF-1細(xì)胞的增殖、黏附、侵襲和凋亡進(jìn)行調(diào)節(jié)的。但在低于100 nmol·L-1的同一渥曼青霉素濃度下，DF-1-Pr P細(xì)胞增殖、黏附、侵襲能力始終高于DF-1-NC細(xì)胞和DF-1細(xì)胞，而總凋亡率均低于DF-1-NC細(xì)胞和DF-1細(xì)胞，差異顯著（P＜0.05），說明ChPrPC的過量表達(dá)具有抗渥曼青霉素的能力。尤其在流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的試驗(yàn)中，渥曼青霉素濃度為100和200 nmol·L-1時(shí)，DF-1-NC和DF-1細(xì)胞幾乎全部凋亡，但DF-1-Pr P細(xì)胞仍有56.63%和15.54%的細(xì)胞存活，提示ChPrPC還可通過其他途徑調(diào)節(jié)DF-1細(xì)胞的凋亡。

T.W.Poh等研究渥曼青霉素對(duì)PI3K／Akt信號(hào)通路的作用，結(jié)果表明渥曼青霉素能負(fù)調(diào)控PI3K／Akt信號(hào)通路中的多種分子，包括PI3K和m TOR，使Akt去磷酸化從而下調(diào)Akt激酶活性［18-19］。作者采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測發(fā)現(xiàn)，隨著渥曼青霉素濃度的增加，DF-1-Pr P、DF-1-NC和DF-1細(xì)胞中PRNP基因mRNA表達(dá)量均減少，而在同一渥曼青霉素濃度下，DF-1-Pr P細(xì)胞中PRNP基因mRNA表達(dá)量均高于DF-1-NC細(xì)胞和DF-1細(xì)胞，表明Akt基因表達(dá)量與PRNP基因表達(dá)量相關(guān)聯(lián)，Akt對(duì)PrPC可能存在反饋調(diào)節(jié)，但其機(jī)制尚不明確。

總之，ChPrPC的過量表達(dá)可促進(jìn)DF-1細(xì)胞增殖、黏附和侵襲，抑制其凋亡；渥曼青霉素以劑量依賴方式抑制DF-1細(xì)胞中PRNP基因mRNA表達(dá)及其細(xì)胞的增殖、黏附和侵襲，誘導(dǎo)其凋亡，表明PI3K／Akt信號(hào)通路可能在Ch Pr PC介導(dǎo)DF-1細(xì)胞增殖、黏附、侵襲和凋亡過程中具有重要的作用。Ch Pr PC的過量表達(dá)可抗渥曼青霉素引起的細(xì)胞凋亡，提示PI3K／Akt信號(hào)通路并不是ChPrPC調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的唯一途徑。本研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明ChPrPC生理功能的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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