冬蟲夏草菌培養(yǎng)物抗氧化活性研究*

趙聃聃，黃羅冬，索菲婭，吳長(zhǎng)奎，盧 帥，葉 星

（1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046；2.云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650091）

冬蟲夏草菌培養(yǎng)物抗氧化活性研究*

趙聃聃1，2，黃羅冬2，索菲婭1**，吳長(zhǎng)奎1，2，盧 帥1，葉 星1

（1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046；2.云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650091）

采用清除DPPH自由基法、普魯士藍(lán)法2個(gè)指標(biāo)研究冬蟲夏草菌培養(yǎng)物不同極性相的抗氧化活性。結(jié)果表明，冬蟲夏草菌培養(yǎng)物的正丁醇相E、乙酸乙酯相D、氯仿相C、石油醚相B均有良好的DPPH自由基清除能力，且清除自由基能力與濃度呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系，隨著濃度的增加抗氧化活性不斷增強(qiáng)。正丁醇相E、乙酸乙酯相D、氯仿相C、石油醚相B的IC50值分別為0.083 mg·mL-1、0.132 g·mL-1、0.081 mg·mL-1、0.143 mg·mL-1，均大于水相F、醇提物A，其中正丁醇相E和氯仿相C的清除能力最強(qiáng)。總還原能力的強(qiáng)弱大小依次為乙酸乙酯相D、氯仿相C、正丁醇相E、石油醚相B，且前三者均比水相F、醇提物A總還原能力強(qiáng)，其中乙酸乙酯相D最強(qiáng)，氯仿相C次之。綜上，冬蟲夏草菌不同極性相具有較強(qiáng)的抗氧化能力，正丁醇、乙酸乙酯、氯仿部位抗氧化效果明顯，可以作為最佳提取溶劑。

冬蟲夏草；培養(yǎng)物；提取物；不同極性相；抗氧化活性

冬蟲夏草Ophiocordyceps sinensis(Berk.)G.H. Sung,J.M.Sung,Hywel-Jones&Spatafora，是冬蟲夏草菌寄生在鱗翅目蝠蛾屬Hepialus幼蟲后形成子座及其幼蟲尸體的復(fù)合體[1]。作為藏族民間用藥已有上千年歷史[2]，同時(shí)作為國(guó)家二級(jí)保護(hù)的名貴藥材被廣泛使用，與人參、鹿茸并列為中國(guó)的三大補(bǔ)品[3]。在傳統(tǒng)中醫(yī)中，認(rèn)為冬蟲夏草性溫、味甘、平，入肺、腎經(jīng)，具益精氣、補(bǔ)虛損，止咳嗽。藥理研究表明冬蟲夏草具有抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫力、降血壓、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌[4-11]等多種藥理作用。

抗氧化物質(zhì)是指能夠清除氧自由基，抑制或消除以及減緩氧化反應(yīng)的一類物質(zhì)。天然抗氧化劑也稱生物抗氧化劑，主要是指在生物體（動(dòng)物、植物、微生物）內(nèi)合成的具有抗氧化作用或誘導(dǎo)抗氧化劑產(chǎn)生的一類物質(zhì)[12-14]。隨著對(duì)氧自由基與疾病關(guān)系的理論研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)氧化損傷與癌癥、炎癥、衰老、心腦血管疾病、糖尿病及其并發(fā)癥、肺纖維化、神經(jīng)退行性疾病等[15-18]諸多疾病均有密切關(guān)系，并認(rèn)為是導(dǎo)致衰老的重要原因之一，因而抗氧化劑的應(yīng)用價(jià)值日益受到重視。但由于人工合成抗氧化劑的安全性問(wèn)題，人們將注意力重新轉(zhuǎn)向天然植物。天然抗氧化劑基本上是水溶性的，在實(shí)際應(yīng)用時(shí)需加以改進(jìn)，確保在油脂中的分散性，以保證其抗氧化的效果[19]。到目前為止對(duì)冬蟲夏草的抗氧化活性的研究已有大量的報(bào)道，大多數(shù)以野生冬蟲夏草為研究材料，但由于野生冬蟲夏草材料稀缺，導(dǎo)致其應(yīng)用受到限制。冬蟲夏草無(wú)性型中國(guó)被毛孢則可以在實(shí)驗(yàn)條件下無(wú)限發(fā)酵擴(kuò)大，具有很強(qiáng)的市場(chǎng)前景，但對(duì)無(wú)性型菌株抗氧化研究較少。故本研究以冬蟲夏草菌培養(yǎng)物為研究材料，采用清除DPPH自由基法、普魯士藍(lán)法對(duì)冬蟲夏草菌不同極性相進(jìn)行抗氧化能力的初步評(píng)價(jià)，探索冬蟲夏草菌菌絲體抗氧化活性成分在不同極性相的分布，以期為進(jìn)一步研究冬蟲夏草菌抗氧化活性成分提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

新鮮冬蟲夏草（O.sinensis）采自于西藏那曲，分離得到冬蟲夏草無(wú)性型菌株中華被毛孢（Hirsutella sinensisLiu et al）[20]，該菌株由云南大學(xué)中草藥生物資源研究生云百草實(shí)驗(yàn)室提供。

將冬蟲夏草菌于PPDA培養(yǎng)基（PDA+1%蛋白胨）上固體培養(yǎng)，15℃～18℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2個(gè)月，刮取菌絲體，烘干，粉碎過(guò)40目篩，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要儀器和試劑

索氏提取器，PTHW型電熱套，河南鞏義英峪予華儀器廠；HH-S型水浴鍋，河南鞏義英峪予華儀器廠；精密天平BCD-216TX、SHB-BA95型循環(huán)水式多用真空泵，河南鞏義英峪予華儀器廠；Spectrumlab 53型紫外分光光度計(jì)，上海精密科技有限公司；分液漏斗、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、RE-52A，上海亞榮生化儀器廠。二苯代苦味基肼自由基（DPPH·）、70%乙醇、95%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、鐵氰化鉀K3Fe(CN)6、三氯乙酸、FeCl3、蒸餾水、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、石油醚。

1.3 提取物的制備

冬蟲夏草有效成分提取分離過(guò)程見圖1。精確稱取冬蟲夏草菌培養(yǎng)物50.0 g，置于索氏提取器中，用70%乙醇索氏提取3次，每次3 h，合并提取液，減壓濃縮制成提取物，蒸干后得醇提物A為20.27 g。再用100 mL蒸餾水溶解，按照極性小到大依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇按1:1萃取，分別萃取3次，每次1 h。合并萃取液，減壓濃縮，得4個(gè)不同極性部位提取物，即石油醚相B為0.08 g、氯仿相C為0.08 g、乙酸乙酯相D為0.26 g、正丁醇相E為1.52 g、水相F為3.93 g，用蒸餾水分別制成1 mg·mL-1的不同極性相提取物，為母液，備用。

圖1 冬蟲夏草有效成分提取分離過(guò)程Fig.1 The extracted and separated processes of effective components from O.sinensis

1.4 抗氧化活性的測(cè)定

1.4.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定

參照Lee等[21]和Tsai等[22]清除DPPH自由基的方法，并進(jìn)行優(yōu)化。精密稱取DPPH標(biāo)準(zhǔn)品0.0206 g，用70%乙醇定容于50 mL，作為母液，備用。吸取10 mL母液，用70%乙醇定容于100 mL，配成濃度為0.0415 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)液。從DPPH標(biāo)準(zhǔn)液中精密移取3 mL、6 mL、9 mL、12 mL、15 mL的溶液，均用70%乙醇溶液定容至25 mL。以70%乙醇為對(duì)照，在波長(zhǎng)為517 nm下測(cè)溶液的吸光度，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

分別吸取配置好的不同極性部位母液0.06 mL、0.12 mL、0.18 mL、0.24 mL、0.3 mL、0.36 mL、0.42 mL、0.48 mL、0.54 mL、0.6 mL，定容至3 mL，置于25mL試管中，再加入3 mL DPPH標(biāo)準(zhǔn)液，混勻，暗反應(yīng)40 min，于517 nm處測(cè)其吸光值。按公式計(jì)算DPPH自由基清除率。最終以樣品溶液濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)，繪制清除率曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)回歸方程，計(jì)算IC50，通過(guò)比較IC50值判斷各極性部位清除DPPH自由基的能力。DPPH自由基清除率公式為（S）：

式中：A0為空白對(duì)照；Ai為反應(yīng)液吸光值；Aj為溶液本地吸光值。

1.4.2 總還原力的測(cè)定

參照Oyaizu[23]研究葡萄糖胺總還原能力的測(cè)定方法。分別吸取配置好的不同極性部位母液0.04 mL、0.08 mL、0.12 mL、0.16 mL、0.2 mL、0.24 mL、0.28 mL、0.32 mL、0.36 mL、0.4 mL，定容至2 mL，依次加入0.4 mL的pH 6.5磷酸緩沖、1.0 mL的1%K3Fe(CN)6，放置于50℃的水浴鍋中水浴20 min，取出后立即加入2.0 mL 10%的三氯乙酸終止反應(yīng)。取上述反應(yīng)液3.0 mL，加6.0 mL蒸餾水和0.4 mL的1%FeCl3，混勻，放置10 min，在700 nm處測(cè)其吸光值。吸光值越大表示總還原能力越強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)物的特性

將冬蟲夏草菌在15℃～18℃低溫下，在PPDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)1個(gè)月后，菌落基本形成，培養(yǎng)2個(gè)月后菌落直徑1 cm～2 cm，生長(zhǎng)緩慢，菌絲光滑緊密，質(zhì)地堅(jiān)硬，背面褐色。菌落紫褐色，中間有微微突起的瘤塊，見圖2。

2.2 DPPH自由基清除率的測(cè)定

2.2.1 DPPH標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

以DPPH質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖3。

由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到線性回歸方程為y=1.315x+ 0.010（R2=0.999）?？芍狣PPH溶液在質(zhì)量濃度為0.00498 mg·mL-1～0.0249 mg·mL-1時(shí)線性關(guān)系良好。

圖2 中華被毛孢的菌落形態(tài)Fig.2 The colony characteristics of Hirsutella sinensis

圖3 DPPH標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The standard curve of DPPH

2.2.2 不同極性部位DPPH自由基清除率的測(cè)定

以不同極性部位濃度為橫坐標(biāo)，清除率（平均值）為縱坐標(biāo)，繪制清除率曲線，如圖4。

圖4 不同極性部位DPPH自由基清除率Fig.4 The scavenging capacities of DPPH·from different polar parts of O.sinensis

不同極性部位均具有不同程度的DPPH自由基清除能力，不同極性部位的濃度與DPPH自由基清除能力基本上呈線性關(guān)系，隨著濃度的增加，清除能力逐漸增強(qiáng)。當(dāng)濃度達(dá)0.2 mg·mL-1時(shí)，醇提物A的清除率為34%，石油醚相B的清除率為52%，氯仿相C的清除率為80%，乙酸乙酯相D的清除率為65%，正丁醇相E的清除率為79%，水相F的清除率為32%。

2.2.3 不同極性部位IC50的測(cè)定

不同極性部位的清除能力均大于醇提物A、水相F，不同極性部位DPPH自由基清除率的IC50值見表1。

表1 不同極性部位DPPH自由基清除率的IC50值Tab.1 The IC50of DPPH scavenging capacities from different polar parts of O.sinensis

用IC50值來(lái)表示DPPH自由基清除率的大小，由表1可知，IC50由大到小依次為氯仿相C＞正丁醇相E＞乙酸乙酯相D＞石油醚相B＞醇提物A＞水相F。

由圖4、表1可以看出，氯仿相C和正丁醇相E清除DPPH自由基十分相近，由此可說(shuō)明冬蟲夏草菌菌絲體清除DPPH的能力多數(shù)集中于氯仿相C和正丁醇相E，為提取的最佳溶劑。

2.3 總還原力的測(cè)定

以不同極性部位的濃度為橫坐標(biāo)，700 nm處的吸光值（平均值）為縱坐標(biāo)，吸光值越大，其總還原能力就越大，繪制曲線圖，見圖5。

圖5 不同極性部位總還能力Fig.5 The total reduction capacities of different polar parts of O.sinensis

由圖5可知，不同極性部位均具有一定的總還原能力，隨著不同極性部位濃度的增加，吸光值越大，且基本呈現(xiàn)線性關(guān)系，即總還原力與濃度呈線性關(guān)系，濃度越大，還原能力越強(qiáng)，其中乙酸乙酯相D遠(yuǎn)強(qiáng)于其他各相，氯仿相C次之。當(dāng)不同極性部位濃度達(dá)0.2 mg·mL-1時(shí)，醇提物A的吸光值為0.103，石油醚相B的吸光值為0.072，氯仿相C的吸光值為0.202，乙酸乙酯相D的吸光值為0.338，正丁醇相E的吸光值為0.159，水相F的吸光值為0.079。因而總還原能力為乙酸乙酯相D＞氯仿相C＞正丁醇相E＞醇提物A＞水相F＞石油醚相B，其中乙酸乙酯相D、正丁醇相E、氯仿相C總還原力均大于醇提物A、水相F，乙酸乙酯相D最高，氯仿相C次之。由圖5說(shuō)明乙酸乙酯相D聚集了具有總還原能力的物質(zhì)，為提取的最佳溶劑，其次是氯仿相C，同樣具有較強(qiáng)的總還原能力，可作為提取的溶劑。

3 結(jié)論與討論

自從1956年Harman[24]提出自由基學(xué)說(shuō)以來(lái)，自由基與疾病的關(guān)系越來(lái)越受到重視。當(dāng)體內(nèi)自由基與自由基清除劑之間平衡被破壞后，自由基或氧化劑會(huì)將細(xì)胞和組織分解，影響代謝功能，并會(huì)引起不同程度的健康問(wèn)題。

抗氧化研究已在各種蟲草中展開，杜秀菊等[24]用氯仿、乙酸乙酯、乙醇提取北蟲草子實(shí)體，并用化學(xué)發(fā)光法和抗H2O2損傷法評(píng)價(jià)了北蟲草的抗氧化性，說(shuō)明乙酸乙酯相提取物抗氧化活性較強(qiáng)且是保護(hù)PC12氧化損傷的有效部位。董秀英等[25]采用DPPH法對(duì)九州蟲草不同極性部位的抗氧化性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，表明九州蟲草具有較強(qiáng)的抗氧化性，其水相提取物、正丁醇相提取物、乙酸乙酯相提取物、石油醚提取物相都具有一定清除DPPH自由基的能力，其中乙酸乙酯相提取物的抗氧化活性強(qiáng)于其他相提取物。陳暢等[26]采用鄰苯三酚自氧化法比較研究了蒙山蟲草，蛹蟲草與冬蟲夏草的抗氧化活性，結(jié)果顯示3種蟲草均具有較強(qiáng)的抗氧化性，且抗氧化活性比較相近。隨后武守華等[27]對(duì)4種子囊菌甲醇提取物的抗氧化活性的研究中表明冬蟲夏草、古尼蟲草、蛹蟲草和黑柄炭角菌子實(shí)體的自由基清除能力、總還原力均高于菌絲體，但4種子囊菌的子實(shí)體的DPPH自由基清除能力無(wú)顯著差異。韓洪坤[28]對(duì)冬蟲夏草菌-中國(guó)被毛孢菌絲體水提物通過(guò)FRAP法、清除DPPH自由基能力、·OH的清除能力、螯合鐵離子能力進(jìn)行抗氧化活性研究，表明菌絲體具有抗氧化活性，但并未對(duì)菌絲的不同極性相進(jìn)行研究。從而表明冬蟲夏草無(wú)性型菌的水提物和醇提物都具有抗氧化活性。結(jié)果表明蟲草具有一定的抗氧化活性，且不同極性部位也有不同程度的抗氧化活性，可為研究冬蟲夏草抗氧化活性提供依據(jù)。

目前，對(duì)野生冬蟲夏草的抗氧化研究已有較多的報(bào)道，但對(duì)其無(wú)性型菌株中華被毛孢的研究較少，對(duì)其不同極性部位的抗氧化活性評(píng)價(jià)還未見報(bào)道。故本文采用清除DPPH自由基法、普魯士藍(lán)法對(duì)冬蟲夏草無(wú)性型菌株菌絲體不同極性部位抗氧化活性進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，氯仿相C、正丁醇相E對(duì)DPPH自由基清除能力強(qiáng)于其他各相，且二者清除能力相當(dāng)；乙酸乙酯相D的總還原能力強(qiáng)于其他各相，氯仿相C次之。結(jié)果顯示，菌絲體在不同極性部位中均有不同程度的抗氧化活性，極性大的水相F和極性小的石油醚相B抗氧化活性相比不明顯，因而冬蟲夏草菌抗氧化活性物質(zhì)可能集中在中極性部位，由此可知其抗氧化活性物質(zhì)可能是中極性物質(zhì)。綜合兩種方法的結(jié)果顯示，氯仿相C具有較好的抗氧化活性，在氯仿相中含有較多的生物堿，生物堿是一種天然的抗氧化物質(zhì)，可以認(rèn)為冬蟲夏草菌菌絲體中生物堿含量較多。

本試驗(yàn)僅限于對(duì)冬蟲夏草菌培養(yǎng)物醇提物進(jìn)行體外抗氧化活性研究，為研究冬蟲夏草菌活性成分分布打下基礎(chǔ)，為進(jìn)一步開發(fā)利用和研究冬蟲夏草資源提供一定的理論依據(jù)。下一步將對(duì)冬蟲夏草菌氯仿部位化學(xué)成分進(jìn)行分離純化，對(duì)其有效成分進(jìn)行分析鑒定，弄清其具有抗氧化活性的化學(xué)物質(zhì)，并對(duì)冬蟲夏草開展體內(nèi)抗氧化能力進(jìn)行探索，最終實(shí)現(xiàn)冬蟲夏草的可持續(xù)利用。

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Study on Antioxidant Activities of Cultured Ophiocordyceps sinensis

ZHAO Dan-dan1,2,HUANG Luo-dong2,SUO Fei-ya1,WU Chang-kui1,2,LU Shuai1,YE Xing1
(1.College of Life Science and Technology,Xinjiang University,Urumqi 830046,China; 2.Yunnan Herbal Laboratory,Institute of Herb Biotic Resources,Yunnan University,Kunming 650091,China)

In order to compare the different polar antioxidant activities of the fungus culture of Ophiocordyceps sinensis, DPPH scavenging method and Prussian blue method were used.The results showed that the fungus culture of Ophiocordyceps sinensis had significant scavenging capacity on DPPH radical in n-butanol phase E,ethyl acetate phase D, chloroform phase C,petroleum ether phase B.Meanwhile,the free radical scavenging ability and concentrations showed a linear relationship and with the concentration raised,the ability enhanced.The half maximal inhibitory concentration (IC50)were assayed as 0.083 mg·mL-1,0.132 g·mL-1,0.081 mg·mL-1and 0.143 mg·mL-1of n-butanol phase E,ethyl acetate phase D,chloroform phase C,petroleum ether phase B,respectively.The IC50were more active than aqueous phase F and alcohol extract A.The n-butanol phase E and chloroform phase C scavenging capacity were strongest.In addition, the total reduction capacities were investigated to different polar showed a good activities.And the extractive of ethyl acetate phase D,chloroform phase C,n-butanol phase E were stronger than aqueous phase F and alcohol extract A,the ethyl acetate phase D was the strongest,and the chloroform phase C was second.In short,different polarity phase had strong antioxidant activities,and the n-butanol,ethyl acetate and chloroform parts were used as the best extraction solvent.

Ophiocordyceps sinensis;culture;extract;different polarity phase;antioxidant activity

S646.9

A

1003-8310(2015)01-0065-05

10.13629/j.cnki.53-1054.2015.01.018

新疆維吾爾科技支疆項(xiàng)目（201091245）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31160073）；新疆教育廳高等學(xué)?？蒲杏?jì)劃（XJEDU2010I12）。

趙聃聃（1991-），女，在讀碩士研究生，研究方向主要是植物化學(xué)和藥用植物資源。E-mail:792120182@qq.com

**通信作者：索菲婭（1964-），女，碩士，副教授，主要從事植物資源評(píng)價(jià)、植物化學(xué)與新藥研發(fā)的研究。E-mail:sophi3106@sina.com.cn

2014-10-10