響應(yīng)面法優(yōu)化水提銅色牛肝菌多糖工藝*

王心詩，邰麗梅，吳素蕊**，趙天瑞

（1.昆明理工大學(xué)云南省食品安全研究院，云南 昆明 650500；2.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221）

響應(yīng)面法優(yōu)化水提銅色牛肝菌多糖工藝*

王心詩1，邰麗梅2，吳素蕊2**，趙天瑞1

（1.昆明理工大學(xué)云南省食品安全研究院，云南 昆明 650500；2.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221）

針對(duì)野生銅色牛肝菌多糖的提取，通過單因素試驗(yàn)選取試驗(yàn)因素與水平，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面法分析建立二次回歸模型，對(duì)提取溫度、提取時(shí)間和料液比進(jìn)行優(yōu)化組合。結(jié)果表明，多糖提取的最佳工藝條件為：提取溫度49℃、提取時(shí)間3.6 h、料液比1∶40。在此最佳工藝條件下，野生銅色牛肝菌多糖得率為14.92%。

銅色牛肝菌；響應(yīng)面法；多糖；提取工藝

真菌多糖（Fungus polysaccharide） 一般是指從真菌的子實(shí)體、菌絲體及發(fā)酵液中分離出的，由10個(gè)以上單糖以糖苷鍵結(jié)合而成的天然高分子聚合物，是一種特殊的生物活性物質(zhì)，在人體內(nèi)起著非常重要的作用。大量的動(dòng)物和臨床研究表明，真菌多糖具有廣泛的生物活性，包括抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗病毒、降血糖、降血脂、抗輻射、抗?jié)?、抗凝血、增?qiáng)免疫力等，在國際上被稱為“生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑”[1-3]。我國豐富的食用菌天然資源和悠久的食用菌栽培、應(yīng)用歷史，對(duì)于食（藥）用菌多糖的研究與藥品、保健品的開發(fā)利用有著得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)[4]。隨著人們對(duì)食用菌多糖活性成分功能、營養(yǎng)的深入研究和提取工藝的不斷完善，食用菌多糖將在醫(yī)藥、保健品、食品、飲料以及其他領(lǐng)域得到越來越廣泛的應(yīng)用[5]。

銅色牛肝菌（Boletus aereus） 又名黑牛肝菌，屬于牛肝菌屬[6]，是一種可食用的蘑菇，營養(yǎng)成分豐富，具有“高蛋白、低脂肪、低熱量”等特點(diǎn)[7]。我國主要分布在四川、貴州、云南等地，國外主要分布在歐洲各國[8]，在巴斯克地區(qū)和意大利經(jīng)常被拿來食用，具有良好的食用和藥用價(jià)值。目前，銅色牛肝菌多以鮮食為主，深加工及對(duì)功能性成分分離利用的研究還不夠深入，因此有必要開展對(duì)銅色牛肝菌多糖的研究。

本文利用熱水浸提法提取野生銅色牛肝菌多糖，并且通過單因素試驗(yàn)及Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)、響應(yīng)面分析法[9]，優(yōu)化多糖的提取工藝，為這一野生銅色牛肝菌資源的綜合開發(fā)及利用提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

原料：野生銅色牛肝菌，購自云南省易門縣農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，凍藏備用。

試劑：葡萄糖、硫酸、苯酚、無水乙醇、丙酮，均為分析純。

儀器：高速多功能粉碎機(jī)（Q-250B3），上海冰都電器有限公司；電子天平（AL204），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4），金壇市科析儀器有限公司；循環(huán)多用真空泵SHZ-D（Ⅲ），鞏義市子華儀器有限責(zé)任公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（OSB-2100），上海愛朗儀器有限公司；雙束紫外可見分光光度計(jì)（TU1901），北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；大容量離心機(jī)（LXJ-ⅡB），上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 多糖的提取

銅色牛肝菌前處理：將篩選、清洗、除雜后的銅色牛肝菌烘干，粉碎過80目篩備用。

水提銅色牛肝菌多糖：準(zhǔn)確稱取過篩后的銅色牛肝菌粉末0.5 g，按一定料液比、溫度和時(shí)間提取多糖。水提結(jié)束后，真空抽濾，濾液真空濃縮至原體積1/4，加4倍體積的95%乙醇靜置過夜。于5 000 r·min-1離心15 min，棄上清液，沉淀用80%乙醇洗3遍，再用丙酮洗2遍，真空干燥后得粗多糖樣品[10]。進(jìn)行平行試驗(yàn)3次。

1.2.2 多糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法[11]。

1.2.3 多糖得率的計(jì)算

采用重量法[12]測(cè)定，銅色牛肝菌多糖得率（Y）公式為：式中：m1表示銅色牛肝菌多糖質(zhì)量；m2表示銅色牛肝菌質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響

確定水浴時(shí)間3 h，料液比1∶40（g∶mL），研究提取溫度對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on polysaccharide extraction rate

由圖1可知，在溫度30℃～50℃，隨溫度升高，多糖提取率增加明顯；當(dāng)溫度超過50℃，隨著溫度上升，多糖提取率明顯下降。這與多糖本身的結(jié)構(gòu)及活性有關(guān)，3 h的高溫浸提可能會(huì)導(dǎo)致多糖的分子結(jié)構(gòu)降解，提取率降低[13-14]。由此可見，浸提溫度不宜太高，50℃為最適提取溫度。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

提取溫度50℃、料液比1∶40（g∶mL）時(shí)，研究不同提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on polysaccharide extraction rate

由圖2可知，隨浸提時(shí)間的延長，多糖提取率不斷增加，3 h～3.5 h提取率顯著增加；3.5 h以后，隨著時(shí)間增加，提取率趨于平緩，幾乎持平。多糖提取率與時(shí)間有密切關(guān)系，提取時(shí)間過短，銅色牛肝菌中的多糖無法充分溶出，影響提取效率；時(shí)間過長，可能會(huì)使部分已經(jīng)溶出的多糖在長時(shí)間高溫環(huán)境下發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，提取率降低[15]。因此，綜合考慮效率、能耗因素，選擇浸提時(shí)間為3.5 h。

2.1.3 料液比對(duì)多糖提取率的影響

在提取溫度50℃、提取時(shí)間3.5 h條件下，研究料液比對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 料液比對(duì)多糖提取率的影響Fig.3 Effectofsolid-to-liquidratioonpolysaccharideextractionrate

由圖3可知，隨著料液比的提高，多糖提取率先增加后減小。在料液比為1∶10～1∶30這個(gè)階段時(shí)，多糖提取率呈增加趨勢(shì)，并且在料液比1∶40時(shí)達(dá)到最大；在料液比為1∶40之后，提取率明顯下降，這說明在料液比為1∶40時(shí)，有效成分提取較充分。溶劑用量與多糖的溶出存在對(duì)應(yīng)的平衡關(guān)系，即有一個(gè)飽和溶出度的問題。若繼續(xù)提高料液比，會(huì)增加能量的消耗，延長濃縮的時(shí)間，損失量相對(duì)也會(huì)增加[16-17]。因此，確定1∶40為最佳料液比。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

通過單因素試驗(yàn)，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[18-20]，進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)優(yōu)化多糖提取工藝。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 試驗(yàn)因素與水平Tab.1 Factors and levels of the experiment

試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。如表2所示，析因試驗(yàn)的試驗(yàn)號(hào)為1號(hào)～12號(hào)，零點(diǎn)試驗(yàn)的試驗(yàn)號(hào)為13號(hào)～15號(hào)，其中自變量取值在A、B、C構(gòu)成的三維頂點(diǎn)為析因點(diǎn)；區(qū)域中心點(diǎn)為零點(diǎn)，重復(fù)零點(diǎn)試驗(yàn)3次，估計(jì)試驗(yàn)誤差。

擬合得到多糖得率的預(yù)測(cè)值對(duì)各因素的回歸方程為：

Y=14.98-0.45A+0.18B+0.023C-0.41AB+0.024AC -（1.275E-003）BC-2.51A2-1.09B2-0.83C2。對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Experimental design and yield

由表3可知，各因素和響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，試驗(yàn)誤差較小，模型方差可較好地反應(yīng)真實(shí)試驗(yàn)值。該模型R2=0.9984，表明試驗(yàn)方法可靠；R2Adj= 0.9955，變異系數(shù)CV/%=0.78，表明多糖提取率模型擬合性好，可用于預(yù)測(cè)提取銅色牛肝菌多糖的工藝試驗(yàn)結(jié)果。模型的P值小于0.0001，銅色牛肝菌多糖提取率的回歸模型結(jié)果極為顯著。失擬項(xiàng)F值為3.18，模型計(jì)算結(jié)果與檢驗(yàn)結(jié)果的差異不顯著。由表3中P值可知，A、B、AB、A2、B2、C2對(duì)多糖提取率有顯著影響，且各試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系。

圖4、圖5、圖6為各因子交互作用三維響應(yīng)面曲面圖和等高線圖。由圖4可知，在相同提取時(shí)間，隨著提取溫度升高，得率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)；在提取溫度一定時(shí)，隨提取時(shí)間延長，得率呈逐漸增加趨勢(shì)，這與單因素試驗(yàn)結(jié)果一致。另外，提取時(shí)間與提取溫度之間的交互作用對(duì)銅色牛肝菌多糖得率有顯著影響，且提取溫度影響的顯著性大于提取時(shí)間。由圖5可知，提取溫度與料液比的交互作用較顯著，提取溫度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響的顯著性大于料液比。由圖6可知，提取時(shí)間與料液比的交互作用不顯著，且提取時(shí)間影響的顯著性大于料液比。比較3組圖可知，提取溫度對(duì)銅色牛肝菌多糖提取率的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，提取時(shí)間的影響較為顯著，而料液比的影響不顯著，表現(xiàn)為曲線較為平滑。3個(gè)因素對(duì)多糖提取率的影響及各個(gè)因

素間的交互影響與回歸分析結(jié)果吻合。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Tab.3 Results of variance analysis of regression model

圖4 提取溫度與時(shí)間及其相互作用對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.4 Response surface and contours of the effect of temperature and time on polysaccharide extraction rate

圖5 提取溫度與料液比及其相互作用對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.5 Response surface and contours of the effect of temperature and solid-to-liquid ratio on polysaccharide extracting rate

2.2.2 響應(yīng)面分析檢驗(yàn)

根據(jù)上述優(yōu)化條件得到最佳提取工藝條件：提取溫度49.01℃、提取時(shí)間3.55 h、料液比1∶40.12，通過回歸方程得出預(yù)測(cè)值為15.0155%?？紤]實(shí)際操作可行性，將多糖的提取條件修正為：提取溫度49℃、提取時(shí)間3.6 h、料液比1∶40。進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，多糖的平均得率為14.92%，與預(yù)測(cè)值相差0.096%，說明該方程與實(shí)際情況擬合較好，充分說明了采用響應(yīng)面優(yōu)化的提取條件準(zhǔn)確可靠，能用于指導(dǎo)銅色牛肝菌多糖的提取。

圖6 提取時(shí)間與料液比及其相互作用對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.6 Response surface and contours of the effect of time and solid-to-liquid ratio on polysaccharide extracting rate

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法優(yōu)化水提銅色牛肝菌多糖的工藝，最佳提取工藝為：提取溫度49℃、提取時(shí)間3.6 h、料液比1∶40，在此條件下銅色牛肝菌多糖得率為14.92%。

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Optimization of the Extraction Technique of Boletus aereus Polysaccharide via Response Surface Analysis

WANG Xin-shi1,TAI Li-mei2,WU Su-rui2,ZHAO Tian-rui1
（1.Yunnan Institute of Food Safety,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China; 2.Kunming Edible Fungi Institute of All China Federation of Supply and Marketing Cooperatives,Kunming 650221,China)

In this paper,aiming at the extraction of Boletus aereus,experiment factors and levels were firstly selected by onefactor tests.The optimum extraction conditions for extraction temperature and time,solid-to-liquid ratio were studied according to the mathematics model built by using Box-Behnken central composite design and response surface methodology(RSM).The results showed that the optimum conditions of Boletus aereus extraction were:extraction temperature of 49℃,extraction time of 3.6 h and ratio of material to water of 1∶40,then the yield rate of Boletus aereus was 14.92%.

response surface methodology;Boletus aereus;polysaccharides;extraction technology

S646.9

A

1003-8310（2015）01-0060-05

10.13629/j.cnki.53-1054.2015.01.017

國家科技支撐計(jì)劃課題（2012BAD36B02）。

王心詩（1989-），女，在讀碩士研究生，主要研究方向?yàn)槭称穬?chǔ)藏與加工方向研究。

**通信作者：吳素蕊（1979-），女，碩士，副研究員，主要從事食用菌科學(xué)與工程研究。

2014-11-10