大腸可利用越橘成分抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制研究

李國(guó)東　金俊超　張津?qū)帯×至_強(qiáng)　劉明

·論著·

大腸可利用越橘成分抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制研究

李國(guó)東金俊超張津?qū)幜至_強(qiáng)劉明

【摘要】目的利用植物化學(xué)物(phytochemicals)中的越橘提取物，制備大腸可利用越橘提取物(Colon-available cranberry extract，CACE)，并以此觀察CACE對(duì)H2O2誘導(dǎo)的DNA損傷的保護(hù)作用；并研究 CACE對(duì)人大腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力的影響及其分子機(jī)制。方法經(jīng)模擬上消化道環(huán)境消化吸收后，將越橘提取物制備成CACE。首先以MTT法檢測(cè)CACE對(duì)大腸癌Lovo細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。然后利用單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CACE對(duì)于過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的大腸癌細(xì)胞核損傷的保護(hù)作用；進(jìn)而用Matrigel基底膜侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CACE對(duì)Lovo細(xì)胞侵襲能力的影響，并通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)觀察CACE對(duì)于Lovo細(xì)胞周期的影響。最后利用Western-blot方法檢測(cè)CACE對(duì)Lovo細(xì)胞P53及VEGF蛋白表達(dá)的影響，同時(shí)使用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)方法檢測(cè)CACE對(duì)于Lovo細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響。結(jié)果MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果示：CACE濃度從20μg/ml增至120μg/ml，Lovo 細(xì)胞增殖率從90.64±3.11%降至38.54±3.13%。單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：以相同濃度的H2O2損傷Lovo細(xì)胞，CACE干預(yù)組較對(duì)照組的細(xì)胞DNA損傷明顯減輕，而且隨CACE濃度增加損傷進(jìn)一步減輕。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果發(fā)現(xiàn)：CACE增加了Lovo細(xì)胞在G1期的比例，但沒(méi)有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。穿膜侵襲實(shí)驗(yàn)顯示：穿膜細(xì)胞數(shù)量隨CACE濃度增加而減少；Western-blot結(jié)果：CACE能顯著降低大腸癌Lovo細(xì)胞P53和VEGF蛋白的表達(dá)，且隨濃度增加該作用進(jìn)一步增強(qiáng)；Real-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CACE抑制了VEGF的mRNA的表達(dá)。結(jié)論CACE在體外模型中能夠顯著抑制人大腸癌細(xì)胞系Lovo的增殖和侵襲，且對(duì)DNA損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制P53和VEGF的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

【關(guān)鍵詞】越橘；中草藥；結(jié)直腸腫瘤；抑制；分子機(jī)制

Research on the molecular mechanisms of colon-available cranberry extract(CACE) inhibiting the growth of colorectal cancer cell

LIGuo-dong，JINJun-chao，ZHANGJin-ning，

LINLuo-qiang.DepartmentofGeneralSurgery，theFourthAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity，Harbin150001，China

Correspondingauthor：LIUMing，Email：mliu35@aliyun.com

【Abstract】ObjectiveIn recent years，phytochemicals as cancer chemopreventive treatment of colorectal cancer have been widespread concerned.In this study，we used cranberry extract，which is one of phytochemicals，to prepare Colon-available cranberry extract(CACE)，and to observe protection effect of CACE on the DNA damage induced by H2O2.The effects of CACE on colorectal cancer cell proliferation and invasive ability were observed.Moreover，the molecular mechanisms of CACE in colorectal cancer cell proliferation and invasion were detected.MethodsBy imitating the environment of upper gastrointestinal tract digestion and absorption，cranberry extract was prepared into CACE.First of all，the effect of CACE on growth inhibition was detected in colorectal cancer Lovo cell line determined by the MTT methood.Single cell gel electrophoresis experiment was used to test the protective effects of nucleus by CACE in colorectal cancer cells induced by hydrogen peroxide damage.Next，the Matrigel basement membrane invasion experiment was carried to exam CACE influence on Lovo cell invasive ability.Flow cytometry technique was also used to observe the influence of CACE on Lovo cell cycle.Western blot was further used to detect CACE impact on Lovo cell P53 and VEGF protein expression.Meanwhile，real-time fluorescent quantitative PCR method was used to detect CACE VEGF expression in Lovo cells.ResultsThe MTT experiment results showed that，with

作者單位：150001 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院普外科 普外科生物樣本庫(kù)

CACE concentr ation increasing from 20 ug/ml to 120 ug/ml，proliferation rate of Lovo cells falls from 90.64±3.11% to 38.54±3.13%.Single cell gel electrophoresis experiment showed that DNA damage of Lovo cells significantly reduces in the CACE intervention group compared to the control group after the cells were damaged with the same concentration of H2O2.Moreover，with increase in the CACE concentration the damage further reduced.The cell cycle was identified by Flow cytometry，and the results showed that CACE increased the proportion of Lovo cells in G1 phase.However，there was no discernible statistical significance(P>0.05).The Matrigel basement membrane invasion experiment showed that membrane cells reduced with the increase of concentration of CACE.CACE can significantly reduce the expression of colorectal cancer Lovo cells P53 and VEGF protein by Western blot results.With the increasing of concentration，the effect was further strengthened.The Real-time PCR experimental results showed that CACE inhibits VEGF mRNA expression.ConclusionThe CACE can significantly inhibit the proliferation and invasion of colorectal cancer in Lovo cell line，and CACE plays a protective role in DNA damage.The anti-proliferation mechanisms of CACE may be through inhibiting the expression of P53 and VEGF.

【Key words】Vaccinium vitis-idaea；Drugs，chinese herbal；Colorectal neoplasms；Inhibition；Molecular mechanism

結(jié)直腸癌(colorectal carcinoma，CRC)是臨床上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅我國(guó)及世界人民的健康和生命。近年，結(jié)腸癌全球發(fā)病率逐年增長(zhǎng)，已躍居全球腫瘤發(fā)病率第3～5位[1-2]。最近幾年，CRC的研究和治療雖然取得了可喜的進(jìn)展，眾多分子通路均被發(fā)現(xiàn)參與其發(fā)生、發(fā)展，但其治療效果并未顯著改善[3-4]。因此，發(fā)現(xiàn)并進(jìn)一步尋找并確定CRC早期干預(yù)靶點(diǎn)是目前研究的主要目標(biāo)之一。

植物化學(xué)物(phytochemicals)由種類繁多的化學(xué)物質(zhì)組成，根據(jù)其代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生過(guò)程將代謝產(chǎn)物分為初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物?？茖W(xué)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)植物化學(xué)物質(zhì)對(duì)于癌癥具有抑制作用[5]，但是對(duì)于其代謝產(chǎn)物的抗癌效果及機(jī)制很少報(bào)道。越橘(cranberry)是極好的健康食品之一，具有很強(qiáng)的抗氧化作用，研究表明，越橘中含有大量的酚類物質(zhì)，其中以類黃酮含量最高，而類黃酮具有抗氧化、抗癌的作用。本研究將越橘提取物制備成“大腸可利用的越橘提取物(CACE)”，并進(jìn)一步探索此類物質(zhì)的抗癌效果及機(jī)制。

材料和方法

一、大腸可利用越橘提取物(CACE)的制備

稱取100 mg越橘提取物(購(gòu)自西安天一生物技術(shù)有限公司)，用PBS定容至20 ml，加入人胃蛋白酶(Sigma Chem.Co.Ltd)終濃度為315 units/ml，37℃ 水浴搖床孵育；加入4.5 ml 胰酶(4 mg/ml)和膽鹽(25 mg/ml)混合物；用Parafilm 封口膜封住瓶口，37℃孵育2 小時(shí)，透析瓶外面的溶液代表可以達(dá)到結(jié)腸被大腸可利用的部分，收集后13，000 rpm 離心，保存于4℃冰箱備用。

二、方法

1.MTT檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)孔加入終濃度分為20 μg/ml、40 μg/ml、60 μg/ml 、80 μg/ml、120 μg/ml的CACE及80 μg/ml的越橘提取物，每種濃度設(shè)3孔重復(fù)，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液對(duì)照分別培養(yǎng)48 h和72 h；選擇490 nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)分光光度計(jì)上檢測(cè)各孔的吸光度，計(jì)算抑制率，繪制生長(zhǎng)曲線。

2.Matrigel穿膜侵襲實(shí)驗(yàn)：按要求將matrigel 4℃過(guò)夜變成液態(tài)；用無(wú)血清的冷細(xì)胞培養(yǎng)基按1∶3稀釋，混勻，加入上室，每室50 μl；室溫下孵育一個(gè)小時(shí)；將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的大腸癌Lovo細(xì)胞，離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1~2遍，用含BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至1~10×105。取細(xì)胞懸液加入上室，每室200 μl；培養(yǎng)24小時(shí)，風(fēng)干，0.1%結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

3.彗星試驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1.25 ×105/ml密度接種于T-25培養(yǎng)瓶中，24 h后加入H2O2(75 μmol/ml)、H2O2(75 μmol/ml)與CACE(40 μg/ml、80 μg/ml、120 μg/ml)混合液、H2O2(75 μmol/ml)與CACE(80 μg/ml)混合液，培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞備用，將0.5%正常熔點(diǎn)的瓊脂糖100 μl滴于磨砂玻片面，迅速蓋上蓋玻片，4°C下凝固；將37°C 0.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖100 μl+10 μl細(xì)胞懸液(H2O2處理、H2O2與CACE聯(lián)合應(yīng)用處理、H2O2與越橘提取物聯(lián)合應(yīng)用處理)混勻，迅速鋪于第一層膠上，蓋片，移入冰箱使其固化，將玻片緩緩浸入新鮮配制的冰涼細(xì)胞溶解液中1.5 h。取出后，放入水平電泳槽中，倒入新鮮配制的冰冷電泳緩沖應(yīng)用液恒壓25 V，300 mA電泳25分鐘，涼干，熒光染料染色。結(jié)果使用FISH3.0拍攝(X40倍)照片，用CASP彗星圖像分析軟件進(jìn)行分析各圖片。

4.細(xì)胞周期分析：取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞，常規(guī)消化制成單細(xì)胞懸液，以1.25 ×105/ml密度接種于T-25 培養(yǎng)瓶中，24 h后加入不同濃度CACE及越橘提取物(80 μg/ml)培養(yǎng)24 h，收集所有細(xì)胞，清洗、固定、染液，計(jì)數(shù)10000個(gè)細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)相情況。

5.Western-blot檢測(cè)：將使用不同濃度的CACE及越橘提取物(80 μg/ml)處理過(guò)的細(xì)胞裂解提取蛋白，測(cè)定樣品蛋白濃度，取相同蛋白含量的樣品，用SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，封閉后加入一抗，二抗，DAB顯色。結(jié)果使用imageJ 進(jìn)行灰度分析。

6.Real-time PCR檢測(cè)：將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞加入不同濃度的CACE及越橘提取物(80 μg/ml)聯(lián)合培養(yǎng)24 h后Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，引物探針由上海生工生物有限公司合成。VEGF上游引物：5’CTTGCCTTGCTGCTCTAC3’；下游引物reverse：5’GATGTCCACCAGGGTCTC3’。內(nèi)參為GAPDH。PCR反應(yīng)體系及條件參照SYBR Premix Ex Taq 說(shuō)明書(shū)，結(jié)果應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

結(jié)果

一、MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用MTT法檢測(cè)CACE抑制大腸癌細(xì)胞系Lovo生長(zhǎng)呈劑量反應(yīng)關(guān)系(圖1~2)?；旌吓囵B(yǎng)24小時(shí)，20 μg/ml、40 μg/ml、60 μg/ml、80 μg/ml、120 μg/ml組以及越橘提取物80 μg/ml組的大腸癌細(xì)胞OD值分別為0.91±0.03、0.76±0.04、0.50±0.08、0.47±0.02、0.41±0.03、0.43±0.05；抑制率分別為9.36±3.11%、25±4.17%、52.08±8.33%、55.21±2.09%、61.46±3.13%、59.37±5.21%?；旌吓囵B(yǎng)48小時(shí)，20 μg/ml、40 μg/ml、60 μg/ml、80 μg/ml、100 μg/ml組大腸癌細(xì)胞OD值分別為0.75±0.04、0.56±0.03、0.31±0.06、0.25±0.01、0.21±0.04、0.19±0.07；抑制率分別為26.04±4.17%、45.83±3.11%、71.87±6.26%、78.12±1.05%、82.29±4.17%、84.37±7.29%。結(jié)果使用SPSS V13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，不同濃度組間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：*為越橘提取物的濃度圖1　Lovo細(xì)胞OD值量化圖，可見(jiàn)以不同濃度的CACE及越橘提取物作用Lovo細(xì)胞，24、48小時(shí)后用酶標(biāo)儀測(cè)定各濃度組細(xì)胞OD值的變化隨CACE濃度的增加而逐漸降低，說(shuō)明細(xì)胞的增殖數(shù)量隨CACE濃度的增加而逐漸降低；圖2　Lovo細(xì)胞生長(zhǎng)抑制圖，可見(jiàn)不同濃度的CACE及越橘提取物作用24、48小時(shí)后對(duì)Lovo細(xì)胞抑制率隨CACE濃度的增加而逐漸增強(qiáng)

二、Matrigel 穿膜侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果

穿膜細(xì)胞數(shù)隨CACE濃度增加而減少，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后在X400光鏡下計(jì)數(shù)膜背面侵襲的細(xì)胞數(shù)(圖3~4)，0、40 μg/ml、80 μg/ml、120 μg/ml及80 μg/ml越橘提取物組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為25±2.5495、10.2±4.8683、10±1.2247、6.8±0.8367、5.2±0.9635結(jié)果使用SPSS V13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，不同濃度組間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：*為越橘提取物濃度；a圖為空白組；b圖為CACE 40μg/ml；c圖為CACE 80μg/ml；d圖為CACE 120μg/ml；e圖為越橘提取物80μg/ml圖3　細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)顯微鏡下圖像(×400)，可見(jiàn)以不同濃度的CACE(0、40、80、120μg/ml)及越橘提取物(80μg/ml)處理Lovo細(xì)胞，24小時(shí)后制備細(xì)胞懸液5×105，加入上室(200μg/室)，24孔板下室加入10%胎牛備清的培養(yǎng)液(500μg/室)，培養(yǎng)24小時(shí)后計(jì)數(shù)基底膜背面侵襲的細(xì)胞數(shù);圖4　CACE濃度與實(shí)測(cè)侵襲細(xì)胞數(shù)的曲線圖像，可見(jiàn)不同劑量的CACE及越橘提取物作用Lovo細(xì)胞24小時(shí)后，于×400光鏡下計(jì)數(shù)基底膜背面侵襲的細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)計(jì)數(shù)中間和四周共5個(gè)視野，求出其平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次

三、彗星試驗(yàn)結(jié)果

H2O2、H2O2與CACE混合應(yīng)用對(duì)Lovo細(xì)胞系處理后，經(jīng)彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表明，75 μmol/ml的H2O2處理Lovo細(xì)胞系后，尾矩值和Olive尾矩值分別為79.83±30.64、52.15±14.703(與對(duì)照組比，P<0.05)，說(shuō)明H2O2對(duì)DNA具有損傷作用。二者聯(lián)合應(yīng)用后：CACE+ H2O2組(40μg/ml+75μmol/ml)，尾矩值和Olive尾矩值分別為70.95±13.23、49.62±7.30(與H2O2組比，P>0.05)；CACE+ H2O2組(80μg/ml+75μmol/ml)，尾矩值和Olive尾矩值分別為28.66±5.26、30.18±4.20(H2O2組比，P<0.05)；CACE+H2O2組(120 μg/ml+75 μmol/ml)尾矩值和Olive尾矩值分別為20.81±11.11、22.28±7.98(與H2O2組比，P<0.05)；越橘提取物+ H2O2組(80 μg/ml+75 μmol/ml)尾矩值和Olive尾矩值分別為22.74±10.68、24.63±8.23(與H2O2組比，P<0.05)。表明CACE與越橘提取物能減少H2O2對(duì)人結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞損傷，且CACE減少DNA 的損傷有濃度依賴趨勢(shì)(圖5，表1)。

注：a圖為對(duì)照組；b圖為越橘提物(80 μg/ml)+H2O2組;c圖為CACE(120 μg/ml)+H2O2組;d圖為CACE(80 μg/ml)+H2O2組;e圖為CACE(40 μg/ml)+H2O2組;f圖為 H2O2組圖5　Lovo細(xì)胸慧星實(shí)驗(yàn)圖(FISH 3.0拍攝)可見(jiàn)空白對(duì)照組沒(méi)有DNA損傷；H2O2組DNA損傷最重，慧尾亮度最高；加入CACE后相同濃度H2O2對(duì)DNA的損傷明顯減輕，且CACE濃度增加損傷進(jìn)一步減輕，慧尾減小、亮物變低。

表1　CASP彗星圖像分析軟件對(duì)各組的彗星圖像進(jìn)行分析結(jié)果

注：與對(duì)照組比較，a為P<0.05；與H2O2組比較，b為P<0.05；與CACE+ H2O2組(80μg/ml+75μmol/ml)比較，c為P<0.05。

注：*為越橘提取物的濃度圖6　越橘提取物及不同濃度組CACE對(duì)P53及VEGF蛋白表達(dá)的影響免疫印跡圖；圖7　不同濃度組的CACE對(duì)P53表達(dá)差異免疫印跡量化圖；圖8　不同濃度組的CACE與VEGF蛋白表達(dá)差異免疫印跡量化圖。

四、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

不同濃度CACE(0、40 μg/ml、80 μg/ml、120 μg/ml)及 80 μg/ml越橘提取物培養(yǎng)24h，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)相情況：G1期細(xì)胞比例分別為61.77±7.04%、63.66±8.35%、66.68±7.13%、67.85±6.51%、65.50±6.91%、；G2期細(xì)胞比例分別為7.25±4.22%、6.78±3.90%、7.44±2.46%、9.03±0.98%、15.23±10.55%；S期細(xì)胞比例分別為30.98±4.96%、29.56±5.01%、25.87±4.88%、23.12±5.53%、19.27±6.61%。越橘提取物組與空白組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；G1 期細(xì)胞比例隨CACE濃度增加而增加，S期細(xì)胞比例隨CACE濃度增加逐漸下降，但各組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明越橘提取物與CACE對(duì)Lovo細(xì)胞的周期無(wú)明顯影響。

五、Western-blot結(jié)果

CACE組及越橘提取物處理24小時(shí)的Lovo細(xì)胞系，VEGF及P53蛋白的表達(dá)均有所降低，且 CACE組中，隨著濃度的增加其作用逐漸增強(qiáng)。結(jié)果如圖6~8所示。

六、熒光定量PCR結(jié)果

VEGF表達(dá)量隨CACE濃度的增加而降低，與對(duì)照組比較，P<0.05，說(shuō)明CACE在40~120 μg/ml之間能夠抑制VEGF的表達(dá)。各處理組間雖有隨CACE濃度增加VEGF表達(dá)有減少趨勢(shì)，但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P>0.05說(shuō)明無(wú)明顯濃度依賴性(圖9)。

圖9　不同濃度的CACE對(duì)VEGF表達(dá)的抑制作用實(shí)時(shí)定量PCR圖

討論

越橘的應(yīng)用已有多年的歷史，但隨著近年來(lái)對(duì)越橘研究的不斷增多，其廣泛的抗腫瘤作用才逐漸受到關(guān)注。越橘屬植物中分離鑒定的化學(xué)成分主要為黃酮類、萜類等物質(zhì)。黃酮類化合物主要包括花色苷、黃酮醇和槲皮素類成分，黃酮類成分為本屬植物的主要活性成分。眾多試驗(yàn)研究說(shuō)明越橘具有抗癌防癌功能，包括胃癌、腸癌等消化道腫瘤。一般認(rèn)為越橘具有抗癌的作用主要與其含有原花青素有關(guān)。最近的一項(xiàng)研究結(jié)果提示，越橘的抗癌作用還與其他酚類或非酚類成分有關(guān)[6]。但由于沒(méi)有考慮到消化道對(duì)越橘提取物的消化和吸收，可能會(huì)引起對(duì)越橘提取物作用的評(píng)價(jià)有所偏差。本試驗(yàn)為了盡可能減少這種偏差，我們?cè)隗w外模擬消化道環(huán)境，將越橘提取物制備成大腸可利用的物質(zhì)。雖然，這種模擬的消化過(guò)程并不能真正代表人類的消化道，比如整個(gè)消化道的長(zhǎng)度、蠕動(dòng)及復(fù)雜的酶系統(tǒng)等，也不能模擬胃腸的微生物環(huán)境。但是我們模擬了胃和小腸的關(guān)鍵消化過(guò)程對(duì)越橘提取物的作用，比以往的研究更加真實(shí)的反映了越橘化學(xué)預(yù)防作用。為越橘進(jìn)入臨床研究打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

癌癥的發(fā)生是一個(gè)多階段過(guò)程，植物化學(xué)物幾乎可以在每一個(gè)階段抑制腫瘤的發(fā)生。自由基是生物體內(nèi)活性較高的物質(zhì)，特點(diǎn)是反應(yīng)無(wú)專一性，幾乎與生物體內(nèi)所有物質(zhì)如糖類、蛋白質(zhì)、DNA、堿基、磷脂和有機(jī)酸等都能反應(yīng)，且反應(yīng)速率快，人體內(nèi)的每一個(gè)細(xì)胞都會(huì)受到過(guò)多的氧自由基傷害，如果這種損傷不能及時(shí)得到修復(fù)，長(zhǎng)此下去就會(huì)導(dǎo)致組織和器官功能失常，從而出現(xiàn)各種疾病，氧自由基攻擊細(xì)胞的DNA，導(dǎo)致基因突變，從而成為癌變的基礎(chǔ)；還有很多化學(xué)性的致癌物質(zhì)，在體內(nèi)也可以轉(zhuǎn)變?yōu)檠踝杂苫?，作用于?xì)胞、組織，使它們發(fā)生癌變。一直以來(lái)，研究者們把工作重點(diǎn)放在了水果中的維生素C、維生素E 以及胡蘿卜素上，然而酚類復(fù)合物和類黃酮才是水果中最主要的抗氧化劑。本實(shí)驗(yàn)彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表明CACE能減小H2O2對(duì)人結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞系造成的DNA 損傷，且有濃度依賴趨勢(shì)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的清除自由基的機(jī)理有兩種：一種是增強(qiáng)抗氧化酶活性，迅速消滅自由基，比如超氧化物岐化酶和過(guò)氧化氫酶就是存在于人體正常組織當(dāng)中的清除氧自由基的重要酶系統(tǒng)；另外一種方法是直接攝入抗氧化劑。據(jù)報(bào)道：蔬菜及水果中的主要的抗氧化物質(zhì)是多酚類及黃酮類化合物，來(lái)源于蘋(píng)果中的維生素C的抗氧化性僅占總的抗氧化能力的0.4%。實(shí)驗(yàn)表明越橘中含有大量的酚類物質(zhì)，其中以類黃酮含量最高。黃酮類化合物是一類在植物界廣泛分布的多酚類天然產(chǎn)物。研究表明，黃酮類化合物具有抗氧化、抗癌、抗心腦血管疾病、抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等多種生理功能及藥理作用[7]。

腫瘤轉(zhuǎn)移是連續(xù)的多步驟的過(guò)程，大量研究表明侵襲是貫穿腫瘤轉(zhuǎn)移全過(guò)程的重要步驟。我們通過(guò)Matrigel 穿膜侵襲實(shí)驗(yàn)觀察到了CACE對(duì)大腸癌細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果表明在40～120 μg/ml之間組穿膜細(xì)胞數(shù)隨CACE濃度增加而減少，說(shuō)明CACE對(duì)大腸癌細(xì)胞侵襲能力具有抑制作用，且具有濃度依賴性，但本研究并未發(fā)現(xiàn)CACE對(duì)Lovo細(xì)胞的周期的明顯影響。

眾多研究表明，VEGF與P53在幾乎所有惡性腫瘤組織中都有高度表達(dá)，較高的VEGF與P53蛋白的表達(dá)反映了高水平的細(xì)胞增殖狀態(tài)。當(dāng)實(shí)體腫瘤處于生長(zhǎng)旺盛時(shí)期，局部的氧供無(wú)法滿足腫瘤細(xì)胞存活和生長(zhǎng)需要，微環(huán)境就會(huì)缺氧。缺氧能激活多種血管生成相關(guān)因子表達(dá)[8]，此時(shí)新生血管的生成有利于腫瘤細(xì)胞的生存并增強(qiáng)其浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力，而新生血管形成和血管通透性增加被認(rèn)為是血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子相關(guān)疾病主要發(fā)病因素[9]。因此對(duì)缺氧的適應(yīng)和新生血管的形成是惡性腫瘤發(fā)展過(guò)程的關(guān)鍵步驟。VEGF可以通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖、遷移，促進(jìn)新生血管的生成和腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，是目前所知的作用最強(qiáng)的促進(jìn)VEGF表達(dá)上調(diào)，能使結(jié)腸癌組織血管的生成增加，為腫瘤的生長(zhǎng)提供更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有利于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移[10]。另有研究顯示：VEGF反義核苷酸能夠通過(guò)降低VEGF基因的表達(dá)，抑制人大腸癌HT-29細(xì)胞的體外增殖，并對(duì)其具有一定的凋亡誘導(dǎo)作用[8]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示存在于蔓越橘中的植物化學(xué)物質(zhì)通過(guò)天然組合，被消化吸收后具有極強(qiáng)的抗氧化性、抑制腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的活性，并通過(guò)一系列體外模型證實(shí)了CACE 在大腸癌發(fā)生、發(fā)展和侵襲等方面的功效，從而闡明了其化學(xué)預(yù)防機(jī)制。本研究將為開(kāi)發(fā)研制天然、綠色抗腫瘤新藥開(kāi)辟?gòu)V闊的前景。

參考文獻(xiàn)

[1]Binefa G，Rodriguez-Moranta F，Teule A，et al.Colorectal cancer：From prevention to personalized medicine.World J Gastroenterol，2014，20：6786-6808.

[2]Walker AS，Zwintscher NP，Johnson EK，et al.Future directions for monitoring treatment response in colorectal cancer.J Cancer，2014，5：44-57.

[3]Tammana VS，Laiyemo AO.Colorectal cancer disparities：issues，controversies and solutions.World J Gastroenterol，2014，20：869-876.

[4]McKeown E，Nelson DW，Johnson EK，et al.Current approaches and challenges for monitoring treatment response in colon and rectal cancer.J Cancer，2014，5：31-43.

[5]Chahar MK，Sharma N，Dobhal MP，et al.Flavonoids：A versatile source of anticancer drugs.Pharmacogn Rev，2011，5：1-12.

[6]Youdim KA，Martin A，Joseph JA.Incorporation of the elderberry anthocyanins by endothelial cells increases protection against oxidative stress.Free Radic Biol Med，2000，29：51-60.

[7]Juranic Z，Zizak Z.Biological activities of berries：from antioxidant capacity to anti-cancer effects.Biofactors，2005，23：207-211.

[8]Vaupel P.The role of hypoxia-induced factors in tumor progression.Oncologist，2004，9(5)：10-17.

[9]Pourgholami MH，Morris DL.Inhibitors of vascular endothelial growth factor in cancer.Cardiovasc Hematol Agents Med Chem，2008，6：343-347.

[10]Hoenig MR，Bianchi C，Rosenzweig A，et al.Decreased vascular repair and neovascularization with ageing： mechanisms and clinical relevance with an emphasis on hypoxia-inducible factor-1.Curr Mol Med，2008，8：754-767.

(本文編輯：馬天翼)

李國(guó)東，金俊超，張津?qū)?，?大腸可利用越橘成分抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制研究[J/CD].中華結(jié)直腸疾病電子雜志，2015，4(2)：144-150.

(收稿日期：2015-02-11)

通訊作者：劉明，Email： mliu35@aliyun.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81372612)；國(guó)家自然科學(xué)青年基金(81302059)；黑龍江省留學(xué)歸國(guó)科學(xué)基金(LC2013C35)；黑龍江省教育廳面上項(xiàng)目(12541300)；哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院杰出青年基金

DOI：10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2015.02.08