天然抗氧化劑茶多酚與維生素C抗氧化活性分析

孫 敏，鄭月月，孫婷婷，靳文娟

（安康學(xué)院 化學(xué)化工系，陜西 安康 725000）

綠茶中含有多種天然成分，如茶多酚、葉綠素、咖啡堿、氨基酸、維生素等。茶多酚約占茶葉干物質(zhì)總量的18%~36%，是兒茶素類、花色苷類、黃酮類、黃酮醇類和酚酸類的總稱，茶葉的色香味和抗氧化保健功能主要源于茶多酚[1]，維生素C是水溶性的維生素，也屬于天然抗氧化劑[2]，食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)—食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)（GB2760—2011）允許VC作為抗氧化劑添加到飲料中，而茶多酚除具有抗氧化作用外，還具有抑菌[3]和防止食品褪色[4]等作用，是一種優(yōu)良的食品添加劑。

本文采用工藝簡(jiǎn)單、提取溫度低、浸提時(shí)間短的超聲波浸提法從綠茶中提取茶多酚，得到了茶多酚含量為64.1%的茶多酚提取液，并經(jīng)過純化處理后得到了易于保存的茶多酚粉末，對(duì)比分析了同質(zhì)量濃度下茶多酚與維生素C對(duì)羥基自由基、超氧根陰離子自由基的清除能力，為茶多酚在飲料類食品生產(chǎn)中作為抗氧化劑進(jìn)行添加提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

紫外可見分光光度計(jì)（UV-6100PC，天津市泰斯特儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（Dk-2000-3l，天津市泰斯特儀器有限公司）；超聲波清洗器（KH2200E，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司，超聲功率80W，超聲頻率40KHz）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA，上海雅榮生化儀器設(shè)備有限公司）；循環(huán)水式真空泵（Shz-d3，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

茶葉（安康市售本地茶）、三氯甲烷、乙酸乙酯、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、甲硫氨酸、維生素C、丙酮、過氧化氫、水楊酸、氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）、核黃素、無水乙醇、甲醇等均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑、分析純；緩沖溶液（自制）。

1.2 茶多酚提取液的制備

取5g過40目篩后的茶末于三角瓶中，超聲提取工藝條件為：提取時(shí)間40min，提取溫度70℃，提取溶劑為70%的乙醇，料液比為1∶30[5]，減壓過濾，濾液即為茶多酚提取液。

1.3 茶多酚提取液的純化

取茶多酚提取液適量，用等體積的三氯甲烷萃取三次，棄去三氯甲烷層，用兩倍體積的乙酸乙酯再振搖提取兩次，合并乙酸乙酯溶液，減壓蒸餾回收乙酸乙酯[6]，濃縮液經(jīng)大孔吸附樹脂（D101）分離純化（洗脫液為60%的乙醇）后，濃縮、烘干，得淺黃褐色茶多酚粉末。

1.4 茶多酚含量的測(cè)定

參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 8313-2002茶多酚測(cè)定法，測(cè)得純化干燥后的茶多酚粉末中茶多酚的百分含量平均值為64.10%。具體實(shí)驗(yàn)過程為：取茶多酚粉末0.1 g，加蒸餾水定容至50 mL。取1 mL加蒸餾水4 mL、酒石酸亞鐵溶液5 mL，充分混合，再加pH7.5的緩沖液至25 mL的容量瓶定容，用10 mm比色杯，在波長(zhǎng)540 nm處，以試劑空白溶液作參比，測(cè)定吸光度（A）。茶葉中茶多酚的含量，以干態(tài)質(zhì)量百分率表示，按下式計(jì)算：

茶多酚(%)=(A×1.957×2)/100×L1/(L2×M×m)。

式中，L1——試液的總量，mL；L2——測(cè)定時(shí)的用液量，mL；M——試樣的質(zhì)量，g；m——試樣干物質(zhì)含量百分率，%；A——試樣的吸光度；1.957——用10mm比色杯，當(dāng)吸光度等于0.50時(shí)，每毫升茶湯中含茶多酚相當(dāng)于1.957mg。

1.5 茶多酚抗氧化活性的測(cè)定

取維生素C粉末和茶多酚粉末，用蒸餾水配置成質(zhì)量濃度為0.05~2.0 mg/mL的溶液，采用改進(jìn)的NBT法和Fenton反應(yīng)法，分別測(cè)定茶多酚和維生素C對(duì)超氧根陰離子自由基和羥基自由基的清除能力。

1.5.2 對(duì)羥基自由基（·OH）清除能力的測(cè)定

茶多酚對(duì)羥基自由基清除能力的測(cè)定方法。在具塞比色管中依次加入6mmol/L的硫酸亞鐵，6mmol/L的水楊酸溶液，不同濃度的茶多酚溶液，6mmol/L的過氧化氫溶液各2mL，在37℃水浴中加熱30min，冷卻室溫后于510nm處測(cè)定吸光度。茶多酚對(duì)羥基自由基清除能力的計(jì)算公式為：清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%，式中，A0為空白對(duì)照液吸光度；Ai為加入茶多酚溶液的吸光度；Aj為不加過氧化氫的吸光度[9-10]。平行測(cè)定三次，取其平均值。

維生素C對(duì)羥基自由基清除能力的測(cè)定方法同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶多酚的紅外圖譜表征

兒茶素類化合物為茶多酚的主體成分，占茶多酚總量的65%~80%。兒茶素類化合物主要包括表兒茶素（EC）、兒茶素（DL-C）、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）等物質(zhì)，其中，ECG和EGCG的含量最高，約占兒茶素類物質(zhì)總量的75%[11]，其化學(xué)結(jié)構(gòu)較為相似，如圖1所示，結(jié)構(gòu)上的主要區(qū)別在于羥基取代的數(shù)量和位置不同，圖2為本實(shí)驗(yàn)純化后的茶多酚粉末的紅外光譜圖（KBr壓片法）。

結(jié)合圖1、2可知，表兒茶素和表沒食子兒茶素都有兩個(gè)苯環(huán)和1個(gè)吡喃，且吡喃上都帶有1個(gè)羥基，3180~3610cm-1范圍內(nèi)的寬帶吸收，歸屬于苯環(huán)上的羥基吸收，羥基的變形振動(dòng)在1340~1420cm-1，1000~1750 cm-1范圍內(nèi)多峰結(jié)構(gòu)吸收，對(duì)應(yīng)于骨架振動(dòng)和取代基的變形振動(dòng)，754~870cm-1范圍內(nèi)的吸收峰可能是由1，3二取代苯上的-C-H變形振動(dòng)產(chǎn)生的，表兒茶素沒食子酸酯和表沒食子兒茶素沒食子酸酯的-C-O-，其伸縮振動(dòng)波數(shù)為1660~1690cm-1，與文獻(xiàn)[12]所述吻合。

2.2 茶多酚的抗氧化活性測(cè)定

相同質(zhì)量濃度的茶多酚和VC對(duì)超氧根陰離子及羥基自由基的清除作用的具體對(duì)比分析如圖3所示。

由圖3可知，茶多酚和VC對(duì)超氧根陰離子自由基和羥基自由基均有一定清除作用。當(dāng)茶多酚和VC的質(zhì)量濃度在0.05~0.8 mg/mL區(qū)間時(shí)，二者對(duì)超氧根陰離子自由基的清除能力都隨濃度的增加而明顯增大；當(dāng)質(zhì)量濃度高于0.8 mg/mL后，茶多酚和VC對(duì)超氧根陰離子的清除能力增長(zhǎng)緩慢，基本趨于穩(wěn)定，并且，當(dāng)質(zhì)量濃度小于0.4 mg/mL時(shí)，即在0.05~0.4 mg/mL的低濃度區(qū)，茶多酚對(duì)超氧根陰離子自由基的清除率高于VC，質(zhì)量濃度大于0.4 mg/mL時(shí)，VC對(duì)超氧根陰離子自由基的清除作用要高于茶多酚；另外，茶多酚和VC對(duì)羥基自由基的清除能力均隨濃度的增大而增加，且茶多酚對(duì)羥基自由基的清除能力要明顯優(yōu)于VC，且當(dāng)茶多酚質(zhì)量濃度為0.05~0.4 mg/mL時(shí)，其對(duì)羥基自由基的清除率隨濃度的增大提高迅速，在0.6~2.0mg/mL時(shí)，清除率增長(zhǎng)較慢，趨于穩(wěn)定。

3 結(jié)論

茶多酚與相同質(zhì)量濃度的VC對(duì)超氧根陰離子自由基和羥基自由基均有一定的清除能力，不同點(diǎn)在于：在0.05~0.4 mg/mL的低濃度區(qū)，茶多酚對(duì)超氧根陰離子自由基的清除率高于VC，當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.4 mg/mL時(shí)，VC對(duì)超氧根陰離子自由基的清除作用要高于茶多酚，但茶多酚對(duì)羥基自由基的清除率明顯高于同濃度下的VC。

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