冰王燒燙膏對大鼠深Ⅱ度燒傷的修復(fù)及機(jī)制研究

馮啟凱，曲梅花，季萬勝，李　艷，辛　亭，黎瀚文，劉鳳嬌

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院,山東省高校應(yīng)用藥理學(xué)重點強(qiáng)化建設(shè)實驗室，山東 濰坊　261053;

2.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濰坊　261031)

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冰王燒燙膏對大鼠深Ⅱ度燒傷的修復(fù)及機(jī)制研究

馮啟凱1，曲梅花1，季萬勝2，李艷1，辛亭1，黎瀚文1，劉鳳嬌1

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院,山東省高校應(yīng)用藥理學(xué)重點強(qiáng)化建設(shè)實驗室，山東 濰坊261053;

2.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濰坊261031)

摘要：目的研究探討冰王燒燙膏對大鼠深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面的修復(fù)及機(jī)制。方法雄性Wistar大鼠60只，制備深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面的大鼠模型后，隨機(jī)分為燒燙膏組、京萬紅組、燒傷模型組，每組20只。測量大鼠燒傷后1、3、7、13、21 d皮膚創(chuàng)面的愈合率和血清TNF-α含量；燒傷后4d免疫熒光法測glut-2受體的表達(dá)變化。結(jié)果燒傷后1 d各組創(chuàng)面愈合率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)，7、13、21 d燒燙膏能明顯縮短燒傷大鼠皮膚創(chuàng)面愈合的時間，提高愈合率(P<0.01)。燒傷后1、3、7、13、21 d燒燙膏組大鼠血清 TNF-α水平呈明顯下降，與模型組比較差異有顯著性(P<0.05，P<0.01)。和模型組比較，燒燙膏組glut-2受體表達(dá)數(shù)目增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論冰王燒燙膏對燒傷皮膚創(chuàng)面具有良好的修復(fù)作用并可能與降低血清 TNF-α水平和增加glut-2受體表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：燒燙膏;燒傷;創(chuàng)面愈合;TNF-α; glut-2受體;熒光抗體反應(yīng)

冰王燒燙膏系運用白礦油、白芝麻油、冰片等為主藥制備而成的一種外用中藥復(fù)合乳劑，在燒傷臨床沿用多年，具有促進(jìn)表皮細(xì)胞、組織細(xì)胞再生，有效避免瘢痕形成，減輕燒燙傷對皮膚的損傷度的功效，然而其作用機(jī)制一直未明。本實驗通過觀察冰王燒燙膏對大鼠深Ⅱ度燒傷創(chuàng)的治療作用，探討其可能的作用機(jī)制，為進(jìn)一步促進(jìn)其在臨床廣泛推廣應(yīng)用提供實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗動物雄性Wistar大鼠60只，SPF級，重量200～220 g，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司實驗動物室提供，許可證號: SCXK魯20130001。

1.1.2主要試劑和試驗儀器冰王燒燙膏(平輿冰王生物工程有限公司，批號20140105)；京萬紅(天津達(dá)仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z12020440，批號211897)；硫化鈉(天津博迪化工股份有限公司)；腫瘤壞死因子-α酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(上海恒遠(yuǎn)生化試劑有限公司)；Anti-Glut-2R (北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(德國SIGMA公司)；奧林巴斯IX71顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1.2試驗方法

1.2.1大鼠分組及背部燒傷模型的制備wistar雄性大鼠60只，隨機(jī)分為三組即燒燙膏組，京萬紅組，燒傷模型組，每組20只。用8%硫化鈉溶液在實驗前24 h對大鼠背部兩側(cè)皮膚進(jìn)行脫毛，脫毛面積5 cm×6 cm左右，約1 min后用水充分清洗脫毛區(qū)，以防過度刺激皮膚。用3%戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)腹腔麻醉后將大鼠四肢盡量伸展，于俯臥位固定在木質(zhì)操作板上。室溫下，將注滿沸水直徑4 cm一端無堵頭的中空大離心管直立于大鼠脫毛部，與皮膚緊密接觸且保證水不流出。沸水與皮膚持續(xù)接觸15 s，將操作板及大鼠連同塑料管迅速翻轉(zhuǎn)，造成深Ⅱ度燒傷模型(經(jīng)病理組織學(xué)檢查)，立即腹腔內(nèi)注射乳酸鈉林格氏液5 mL抗休克[1]。

1.2.2創(chuàng)面處理及給藥燒燙膏組、京萬紅組每天早中晚3次分別涂以燒燙膏和京萬紅；模型組在相同時段涂無菌生理鹽水?？偨o藥時間持續(xù)4周。為防其舔舐傷口，所有大鼠造模后均在其頭頸部套自制紙硬殼項圈。在給藥期間，所有大鼠單獨分籠飼養(yǎng)，自由飲水并給予普通飼料喂養(yǎng)。

1.2.3觀察指標(biāo)(1)大體觀察每次換藥時肉眼對比觀察各組燒傷創(chuàng)面水腫滲出程度,是否有分泌物及創(chuàng)周紅腫等。(2)觀察創(chuàng)面愈合率按照Nagelschmidt法，于燒傷后不同時間用透明塑料薄膜覆蓋于大鼠創(chuàng)面描記創(chuàng)面邊緣，用規(guī)格相同紙殼按照描記的邊緣剪下同樣大小的面積進(jìn)行稱重。創(chuàng)面愈合判斷標(biāo)準(zhǔn)是痂皮自行脫落且有新生上皮形成。以燒傷第1天的面積作為原始面積，以后各時間點測量的面積均和原始面積比。創(chuàng)面的面積轉(zhuǎn)換為紙殼的重量，計算公式如下：

創(chuàng)面愈合面積百分比 =(原始燒傷面積-各時間點創(chuàng)面面積)/原始燒傷面積×100%。

記錄實驗后1、3、7、13、21 d各組大鼠創(chuàng)面愈合情況并對各組大鼠創(chuàng)面的平均愈合天數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計和計算。

1.2.4TNF-α的檢測各組隨機(jī)選取大鼠10只于燒傷后1、3、7、13、21 d經(jīng)眼內(nèi)眥采集靜脈血1 mL，室溫靜置于離心管15 min自凝，3 000 r·min-1(r=16 cm)，離心10 min后取上層血清，于-80℃保存?zhèn)溆谩Ｑ逯械腡NF-α表達(dá)水平用ELISA法檢測，具體按說明書所述方法操作。

1.2.5Glut-2受體的表達(dá)燒傷后4 d各組隨機(jī)選取大鼠10只頸椎脫臼處死，取末端回腸2～3 cm，于4%多聚甲醛固定24 h，石蠟切片，抗原修復(fù)，封閉，37℃孵育1 h，Glut-2R(兔抗鼠，1∶200)+ 0.03% TritonX-100 室溫過夜，PBS漂洗，熒光二抗FITC(山羊抗兔，1∶200)，37℃避光孵育1.5 h，PBS漂洗，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取10個高倍視野(200×)，記錄每個視野陽性細(xì)胞數(shù)目，取其平均值。

2結(jié)果

2.1創(chuàng)面大體觀察燒傷后1 d，對照組大鼠創(chuàng)面顏色呈瓷白色，腫脹，滲出、創(chuàng)周紅腫最明顯。燒燙膏組與京萬紅組基本相似，僅有少許滲出及創(chuàng)周紅腫。3 d后各組大鼠創(chuàng)面干燥，京萬紅組開始先后結(jié)痂，痂下未見異常分泌物。燒燙膏組無結(jié)痂，沿?zé)齻吘売?。各組大鼠均未見不良反應(yīng)。

2.2創(chuàng)傷愈合率測定燒傷后1 d各組大鼠愈合率均較小，各組比較創(chuàng)面愈合率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)；3 d后燒燙膏藥組創(chuàng)面愈合率與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)，京萬紅組與模型組比較，有顯著差異(P< 0.01)；7、13、21 d燒燙膏組和京萬紅組愈合率均高于模型組(P< 0.01)；燒燙膏組和京萬紅組的平均愈合時間與模型組比較有明顯差異(P< 0.01),見表1。

±s，n=10)

注：與模型組比較*P< 0.05，**P<0.01。

2.3燙傷膏對燙傷大鼠血清中 TNF-α水平的影響燙傷后1、3、7、13、21 d，燒燙膏和京萬紅組大鼠血清 TNF-α水平呈明顯下降，與模型組比較差異有顯著性(P<0.05，P<0.01),見表2。

注：與模型組比較*P<0.05 ，**P<0.01。

2.4大鼠glut-2受體表達(dá)比較空腸glut-2受體主要分布在腸上皮細(xì)胞基底膜[2]。燒燙膏組大鼠上皮細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)為(10.83±2.23)，模型組大鼠的陽性細(xì)胞數(shù)為(6.68±1.67)，兩組比較差異具有顯著性意義(P<0.01)，燒燙膏組、京萬紅組大鼠表達(dá)glut-2的細(xì)胞數(shù)目無明顯差異，見表3，圖1。

±s)

注：與模型組比較,*P<0.05，**P<0.01。

注：A:燒燙膏組；B:京萬紅組；C:模型組。

3討論

本實驗結(jié)果顯示冰王燒燙膏在燒傷后3 d開始不同程度的提高大鼠創(chuàng)面愈合率，縮短創(chuàng)面愈合時間。證明冰王燒燙膏能顯著促進(jìn)燒燙傷創(chuàng)面愈合。

深度燒傷創(chuàng)面的修復(fù)是一個全身性復(fù)雜有序、精密調(diào)控的過程，多種細(xì)胞炎癥介質(zhì)和生長因子在創(chuàng)面愈合過程中相互協(xié)調(diào)。在眾多的炎癥介質(zhì)中，作為啟動炎癥反應(yīng)關(guān)鍵分子的TNF-α、IL-1、IL-6起重要作用[3]。其中TNF-α可刺激外周血多形核白細(xì)胞(PMN)生成、釋放和趨化反應(yīng)，并活化產(chǎn)生大量毒性產(chǎn)物損傷組織細(xì)胞，同時TNF-α又可作用于肝細(xì)胞抑制白蛋白的生成和促進(jìn)某些急性期蛋白合成[4]。所以TNF-α作為重要的促炎癥因子，其水平的高低與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，在燙傷3 d后，燒燙膏各組能顯著降低血清中 TNF-α含量。說明冰王燒燙膏能夠抑制炎癥介質(zhì) TNF-α釋放，減輕創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

下丘腦—垂體—腎上腺系統(tǒng)在重度燒燙傷后被激活，糖皮質(zhì)激素、兒茶酚胺等釋放增加，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)高代謝反應(yīng)，表現(xiàn)為基礎(chǔ)能量消耗增加、糖酵解增強(qiáng)[5]等；另一方面，炎癥因子又可導(dǎo)致葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)減少、線粒體功能障礙等，使葡萄糖攝取和利用減少[6]，嚴(yán)重影響燒傷患者預(yù)后。故藥物促進(jìn)創(chuàng)面愈合同時糾正機(jī)體的代謝異常狀態(tài)一直受到研究者的重視。易化性葡萄糖轉(zhuǎn)運載體(glut-2)具有低親和力和高米氏常數(shù)的特點，是葡萄糖運載的理想載體，在肝細(xì)胞和腸細(xì)胞中，發(fā)揮葡萄糖感受器的作用[7]。所有在血糖調(diào)節(jié)中起重要作用的組織如小腸、胰腺、腎及肝，都表達(dá)glut-2[8]。glut-2通過對葡萄糖的高度敏感性，確保了大量葡萄糖進(jìn)出細(xì)胞的雙向流動，有效調(diào)節(jié)葡萄糖濃度。本實驗中，給予冰王燒燙膏外涂后，大鼠空腸上皮細(xì)胞基底膜glut-2陽性細(xì)胞數(shù)目與模型組數(shù)目相比明顯升高。表明給予冰王燒燙膏后葡萄糖攝取和利用增加，進(jìn)而提供炎癥反應(yīng)及創(chuàng)面愈合所需的能量和營養(yǎng)，促進(jìn)愈合。

結(jié)果表明，冰王燒燙膏可顯著提高大鼠深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面的愈合率，縮短創(chuàng)面愈合時間，加速創(chuàng)面愈合，對于燒傷具有良好的治療作用，并且可能與降低TNF-α含量，升高glut-2受體的表達(dá)有關(guān)，具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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Study on repairing effect and mechanism of ice king burn-scald ointment

on deep grade II burn in rats

FENG Qi-kai1,QU Mei-hua1,JI Wan-shen1, et al

(1．DepartmentofPharmacology，WeifangMedicalCollege，WeifangShandong261053，China;

2.AffiliatedHospitalofWeifangMedicalUniversity,WeifangShandong261031，China)

Abstract：ObjectiveTo investigate repairing effect and mechanism of Ice king Burn-scald ointment on deep grade II burn wounds in rats.MethodsBurned skin wound was made in 60 wistar male rats in accordance with the literature.The rats were randomly divided into 3 groups: the burn-scald ointment treated group,the jingwanhong ointment treated group,the model group,with 20 rats in each group.Samples were collected after 1,3,7,13,21 days of burn to determine healing rates and serum levels of TNF-α content.Expression changes of glut-2 receptor were detected by immunofluorescence 4 days after burn.ResultsThere were no significant difference in the healing rates of the wound among the 3 groups after 1 day (P> 0.05).The healing rates of the wound were significantly higher in the burn-scald ointment group and the model group (P< 0.01) after 7,11,13,and 21 days.Compared with model group,glut-2 receptor expression was increased in the burn-scald ointment group,and the difference was statistically significant (P<0.01).ConclusionIce king Burn-scald ointment shows a notable repairing effect on burn wound.The mechanism may be associated with decreased serum levels of TNF- α content and increased glut-2 receptor expression.

Key words:ice kingburn-scald ointment; burn; wound healing; TNF-α;glut-2 receptor; fluorescent antibody technique

(收稿日期：2014-06-12，修回日期：2014-08-21)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.02.009

通信作者:曲梅花，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)內(nèi)分泌藥理學(xué)，E-mail: qumeihua@ hotmail.com

作者簡介:馮啟凱，男，碩士研究生

基金項目:國家教育部留學(xué)回國人員科研啟動基金(2011年第43批)