基于ELISA-生長曲線對食品中沙門氏菌定量檢測的研究

蘇遠科 張國林 李純鋼

沙門氏菌屬(salmonella)是一大群寄生于人類和動物腸道內(nèi)，生化反應和抗原構造相似的革蘭氏陰性桿菌［1，2］。據(jù)統(tǒng)計在世界各國的種類細菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首。國內(nèi)外對食品中沙門氏菌的檢測技術或檢測方法研究并不鮮見［3-5］。這些方法大都都是對沙門氏菌的定性檢測但是對沙門氏菌定量研究很少。目前，僅有SN/T0040-1992是沙門氏菌定量方法，原理是基于MPN法實現(xiàn)定量。SN/T0040-1992雖然可以定量檢測但是缺點操作繁瑣，需要稀釋三個梯度或更多，每個梯度3管共9管，每個管都要進行陰陽性判斷才能確定，耗時費力，同時，該方法由于從225 ml 10倍樣品稀釋液中取1 ml用來增菌培養(yǎng)存在漏檢風險。本課題以腸炎沙門氏菌為例對沙門氏菌定量研究模型進行探討，基于ELISA和細菌生長曲線應用的結合，研究沙門氏菌的定量，開發(fā)一種一種操作簡單有效能夠對樣品中沙門氏菌本底含量檢測的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗儀器:MiniVidas酶聯(lián)免疫分析儀制造商生物梅里埃，恒溫培養(yǎng)箱型號INE600制造商MEMMERT。

1.1.2 培養(yǎng)基:緩沖蛋白胨水(BP)海博生物批號20120509，亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)海博生物批號20120506，四硫磺酸鹽煌綠增菌液(TTB)海博生物批號20120309，亞硫酸鉍瓊脂(BS)海博生物批號20120417，DHL瓊脂海博生物批號20120315，3M菌落總數(shù)測試片規(guī)格型號 PertrifilimTM 6406批號2013-10TP。

1.1.3 菌株:腸炎沙門氏菌株(salmonella enteritidis)3代，大腸桿菌(escherichia coli)3代(購置中國工業(yè)菌種保藏中心)，奇異變形菌(P.mirabilis)2代(實驗室分離獲得)

1.2 方法

1.2.1 標準菌株活化:以無菌操作將菌株濾紙片放入10 mm緩沖蛋白凍水試管中，36℃培養(yǎng)過夜;培養(yǎng)液劃線接種平板BS，DHL培養(yǎng)24～48 h;挑去單菌落接種到盛有20 ml BPW的試管中培養(yǎng)18 h備用。

1.2.2 菌液的梯度稀釋及計數(shù):10倍梯度稀釋菌液(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8)，分別將10-5、10-6、10-7、10-8稀釋液1 ml接種測試片，每個梯度接種2片，放入培養(yǎng)箱36℃培養(yǎng)24～48 h后計數(shù)。

1.2.3 酶聯(lián)免疫分析儀測試值(熒光值)與沙門氏菌濃度函數(shù)關系建立:腸炎沙門氏菌株純化后挑去單菌落接種于緩沖蛋白胨水中10～20 ml 36℃培養(yǎng)12～18 h，分別進行10倍稀釋，5倍稀釋，4倍稀釋3倍稀釋和2倍稀釋。選取2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、1 000倍稀釋液使用Vidas檢測，同時使用3M細菌菌落計數(shù)測試片對培養(yǎng)液10-5，10-6，10-7進行計數(shù)。然后建立Vidas測試值與沙門氏菌濃度(取對數(shù)值)數(shù)學函數(shù)關系式。

1.2.4 沙門氏菌在兩種培養(yǎng)液中的生長曲線繪制:使用不同濃度沙門氏菌分別接種TTB(1、10、50、150、 380 cfu/ml)、SC(0.58、5.8、20、58、200、580 cfu/ml)增菌液100 ml于42℃和36℃培養(yǎng)間隔1或2 h取樣，使用測試片對沙門氏菌計數(shù)，培養(yǎng)至16～20 h。繪制不同接種濃度沙門氏菌在兩種培養(yǎng)液中的生長曲線。

1.2.5 生長曲線對人為污染樣品的檢測:選用樣品常溫和冷鮮豬和雞肉25 g進行人為污染，放入25 ml增菌液均質1 min，然后加入剩下的200 ml增菌液置于36℃和42℃培養(yǎng)，分析建立的方法對人為污染樣本檢出的的誤差。

1.2.6 干擾試驗:選擇大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，單核細胞增生李斯特氏菌，變形桿菌作為干擾菌。設置兩組相同的樣品，第1組如同驗證試驗部分，只添加一定濃度的腸炎沙門氏菌到樣品中，第2組在第1組的基礎上添加干擾菌混合液包括大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌，單增李斯特氏菌和變形桿菌，每種干擾菌的添加量均是目標菌10倍以上。操作同驗證試驗部分，在SC增菌液中增菌10 h，使用vidas對增菌液檢測。每種干擾菌的添加量均是目標菌10倍以上。操作同驗證試驗部分，在SC增菌液中增菌10 h，使用vidas對增菌液檢測。

2 結果

2.1 vidas檢測值與菌濃度關系及驗證 本文發(fā)現(xiàn)，Vidas測試值與沙門氏菌濃度(對數(shù)值)函數(shù)關系為y =0.102x3-0.648x2+1.563x+5.826，相關系數(shù)R2= 0.994，X值適應范圍0.2～3.8，對應沙門氏菌濃度范圍約106～108cfu/ml，即vidas對沙門氏菌檢測底限約在106cfu/ml，而菌濃度超過108cfu/ml會出現(xiàn)x值鈍化狀態(tài)，可能與抗原抗體結合飽和有關。取經(jīng)過一系列稀釋梯度的腸炎沙門氏菌液6管分別對其進行vidas檢測和使用3 M測試片計數(shù)進行了驗證試驗。通過驗證發(fā)現(xiàn)，vidas檢測計算值與測試片所得值相對誤差最小0.13%，最大2.50%，平均相對誤差1.33%。見圖1、表1。

2.2 腸炎沙門氏菌在TTB和SC中生長曲線的建立我們比較腸炎沙門氏菌若干梯度在sc增菌液36℃培養(yǎng)生長曲線發(fā)現(xiàn)，生長曲線對數(shù)期的中后期培養(yǎng)8～10 h是進行vidas檢測較好時機，而vidas最佳檢測區(qū)間在沙門氏菌濃度在106cfu/ml到108cfu/ml，這時各梯度生長曲線區(qū)分度分較好，進入平穩(wěn)期曲線則近于粘合。橫坐標為培養(yǎng)時間(h)縱坐標我們發(fā)現(xiàn)腸炎沙門氏菌在TTB培養(yǎng)基中生長曲線的對數(shù)期要短些，培養(yǎng)12 h后基本進入穩(wěn)定期。其中接種1 cfu/ml為例經(jīng)過2 h的調(diào)整期進入對數(shù)期，經(jīng)過約14 h后進入穩(wěn)定期，不同接種濃度沙門氏菌在調(diào)整期都是2 h，不

圖1 Vidas測試值橫坐標與菌濃度縱坐標(取對數(shù)值)函數(shù)關系

表1 驗證試驗中通過vidas檢測得到數(shù)值代入公式計算值與實測值對比分析

同的是濃度越高對數(shù)期時間越短更早的進入穩(wěn)定期。見圖2、3。

圖2 腸炎沙門氏菌若干稀釋梯度在SC增菌液36度培養(yǎng)生長曲線

圖3 腸炎沙門氏菌若干稀釋梯度在TTB增菌液42度培養(yǎng)生長曲線

2.3 通過生長曲線對人為污染樣品的檢測 本文發(fā)現(xiàn)，在SC增菌液中，冷鮮豬肉模擬樣品相對誤差較大，其余樣本誤差均在10%以內(nèi);在TTB增菌液中，冷鮮豬肉模擬樣品相對誤差在28.6%，而其他樣本誤差均在10.0%以內(nèi)。見表2～5。

2.4 干擾實驗 本文發(fā)現(xiàn)，干擾試驗中對含有干擾菌的樣品檢測與不含干擾菌的檢測誤差平均值為0.17，相對誤差平均值在11.0%。見表6。

表2 加入系列濃度沙門氏菌的人為污染樣品在sc增菌液中增菌9 h后vidas檢測

表3 實際添加腸炎沙門氏濃度和檢測值比較分析 %

表4 加入系列濃度沙門氏菌的人為污染樣品在TTB增菌液中增菌9 h后vidas檢測

表5 實際添加腸炎沙門氏濃度和檢測值比較分析

表6 第1組樣品和第2組添加干擾菌的樣品的增菌液初始沙門氏菌濃度估算cfu/ml

3 討論

沙門氏菌是影響食品安全的主要微生物之一。沙門氏菌病是公共衛(wèi)生學上重要的人畜共患病之一，沙門氏菌引起的食物中毒在各國細菌性食物中毒中常列榜首，現(xiàn)有規(guī)定中食品中不得檢出沙門氏菌［6，7］。但是目前食品中沙門氏菌的定量檢測方法相對較少，且存在諸多的不足。本課題對鮮肉及制品中腸炎沙門氏菌定量檢測研究，基于沙門氏菌在選擇性增菌液中的生長曲線。選擇性增菌液對干擾菌會有一定的抑制作用，同時還能促進沙門氏菌的生長，這樣能夠更好的對目標菌的分離。通過生長曲線可以看出，無論接種濃度大小，都經(jīng)歷2 h停滯期(適應期)然后進入對數(shù)生長期，對數(shù)生長期隨著接種菌濃度增加而縮短，進過培養(yǎng)9～16 h不同接種濃度沙門氏菌基本上都到達平穩(wěn)期菌含量在(5～8)×108cfu/ml。在對數(shù)生長期不同接種濃度沙門氏菌形成斜率基本相同的平行斜線，如在SC增菌液中對數(shù)期生長曲線斜率在0.71～0.73。對數(shù)生長期某一定時間不同接種濃度的沙門氏菌增殖達到濃度形成一定斜率的直線，如SC增菌中培養(yǎng)9 h時得出方程y=1.028X-5.202相關系數(shù)R2=0.995，根據(jù)此方程和此時增菌液沙門氏菌濃度x可以計算出增菌液初始接種濃度。本文中使用vidas對增菌液濃度檢測根據(jù)檢測值與菌濃度數(shù)學模型y=0.102x3-0.648x2+1.563x+5.826相關系數(shù)R2=0.994(0.2＜x＜3.8)因為vidas檢測底限在106cfu/ml此時檢測值接近0.2，此方法在10 h時檢測限在2 cfu/ml附近。但是如果使用熒光定量PCR檢出限100 cfu/ml，能夠定量到1 cfu/100 ml［8-10］。

本方法是對鮮肉類及制品直接使用SC或TTB增菌根據(jù)標準SN/T0040-1992出口食品沙門氏菌屬(包括亞利桑那菌)計數(shù)檢驗方法。本使用腸炎沙門氏菌為模型進行的研究，如果擴展到其他類型沙門氏菌還需要具體探索其他菌在SC或TTB中的生長模型。同時，本文探索基于ELISA-生長曲線原理來對沙門氏菌定量研究的方法，也可擴展到對其他菌的定量研究。

1 陳玲，張菊梅，楊小鵑，等.南方食品中沙門氏菌污染調(diào)查及分型.微生物學報，2013，53:1326-1333.

2 滕要輝，索標，艾志錄，等.速凍食品中沙門氏菌和金黃色葡萄球菌多重PCR檢測方法的建立與應用.食品科學，2013，34:140-144.

3 顏成英等.腸炎沙門氏菌EMA-PCR檢測方法的建立.食品科學，2014，35:90-93.

4 劉景武，付素蘭，任天紅，等.免疫膠體金法與培養(yǎng)方法檢測沙門氏菌檢測結果研究.河北醫(yī)藥，2014，36:1021-1022.

5 張海霞，孫桂珍，王慧，等.食源性致病菌沙門氏菌與奇異變形桿菌二重PCR檢測方法的建立.泰山醫(yī)學院學報，2014，36:165-167.

6 楊娟，許美玲，許愛華，等.畜產(chǎn)品中沙門氏菌檢驗方法的研究進展.家禽科學，2011，33:51-53.

7 趙志偉，莫國東，韋平.畜禽生產(chǎn)中沙門氏菌病的防控意義.廣西畜牧獸醫(yī)，2011，27:75-77.

8 張沖，劉祥，陳計巒.實時熒光定量RT-PCR檢測沙門氏菌活菌.食品工業(yè)科技，2012，33:91-94.

9 杜雄偉，李葉，冮潔，等.肉制品中沙門氏菌invA基因實時熒光定量PCR檢測方法的建立.食品工業(yè)科技，2013，34:68-70，80.

10 楊柳，蘇明權，馬越云，等.熒光定量RT-PCR檢測沙門氏菌方法的建立.中國實驗診斷學，2011，15:17-20.