免疫親和-HPLC 法測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中維生素B12

黃 娟，盧沛明

(國(guó)家青少年食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心/中食檢測(cè)研究院有限公司，廣東東莞 520808)

維生素B12是唯一一類含有主要礦物質(zhì)鈷的維生素，故又名鈷胺素，包括氰鈷胺、羥鈷胺、甲鈷胺、腺苷鈷胺。通常狹義上所指維生素B12是氰鈷胺，它是食品和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑中B12的主要形式。B12易溶于水，在吸收時(shí)需要與鈣結(jié)合，大部分為小腸所吸收，人體只能利用甲鈷胺和腺苷鈷胺，因此氰鈷胺要在體內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)化成這兩種形式才能被人體吸收利用。嬰幼兒缺乏維生素B12表現(xiàn)為精神情緒異常、表情呆滯、反應(yīng)遲鈍等，最后導(dǎo)致貧血［1］;嬰幼兒過(guò)量攝入維生素B12則易導(dǎo)致葉酸缺乏，有些會(huì)出現(xiàn)哮喘、濕疹、蕁麻疹、面部水腫等過(guò)敏性癥狀。因此我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)嬰幼兒品配方乳粉中B12的添加量有嚴(yán)格的規(guī)定，其中GB 14880—2012《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》［2］中兒童調(diào)制乳粉中B12的添加量為10～30μg/kg，相關(guān)產(chǎn)品國(guó)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)添加限量也在此范圍。目前市售嬰幼兒乳粉是營(yíng)養(yǎng)標(biāo)簽中B12的含量大部分在1.5～2.5μg/100g 之間。

現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)GB 5413.14—2010《嬰幼兒食品和乳制品中維生素B12測(cè)定方法》［3］采用微生物法，但由于測(cè)定周期長(zhǎng)、技術(shù)難度較大等缺點(diǎn)，大部分的檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)不能較好地開展。而另一現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.217—2008 《保健食品中維生素B12的測(cè)定》［4］的前處理過(guò)于簡(jiǎn)單，對(duì)嬰幼兒乳粉的除雜、提取效果不佳，檢出限(0.05μg/g)達(dá)不到要求，因此也不適用。筆者根據(jù)嬰幼兒乳粉的成分特點(diǎn)，對(duì)GB/T 5009.217—2008 的前處理過(guò)程進(jìn)行改進(jìn)，降低了基體雜質(zhì)的干擾，提高了檢測(cè)的靈敏度，實(shí)驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)單易掌握，能滿足日常嬰幼兒乳粉中B12含量的檢測(cè)要求。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 高效液相色譜儀(U-3000，美國(guó)Thermofisher 公司)，帶紫外檢測(cè)器;離心機(jī)(Sorvall ST16，美國(guó)Thermofisher 公司);氮吹儀(DC-24，上海安譜科學(xué)儀器有限公司);固相萃取裝置(20-Positiion Extraction Manifold，Waters 公司);免疫親和柱(EASI-EXTRACT vitaminB12，60mg，3mL，德國(guó)拜發(fā)公司)。

1.1.2 試劑 乙腈(色譜純，Honeywell)、甲醇(色譜純，Honeywell)乙酸鈉(AR，廣州試劑廠)、三氟乙酸(AR，廣州試劑廠);維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品(96.2%，Dr.Ehrenstorfer)。

1.2 色譜條件

色譜柱:Hypersil GOLD 250 ×4.6mm，5μm;柱溫30℃;流動(dòng)相:乙腈和水(15∶85)，梯度洗脫(表1);流速0.25mL/min;紫外檢測(cè)器361nm，進(jìn)樣量10μL。

表1 流動(dòng)相梯度

1.3 樣品前處理

稱取試樣5.000g (精確到0.001g)于50mL 容量瓶中，加入30mL 乙酸鈉緩沖溶液(50mmol/L，pH4.0，40℃)振搖混勻后，用乙酸鈉緩沖溶液定容。超聲提取15min，然后將提取液用濾紙過(guò)濾，取濾液30mL 待凈化。免疫親和柱放置在固相萃取裝置上，待柱中原緩沖溶液流完時(shí)立即倒入濾液，以2mL/min 的速度流出，棄去流出液，并用10mL 純水以5mL/min 的速度洗滌柱子，待水流完，用洗耳球吹干免疫親和柱。用5mL 甲醇以1 滴/s 的速度洗脫目標(biāo)物，并置于氮吹儀上(60℃)吹干。加200μL 純水定容后上機(jī)。標(biāo)準(zhǔn)品譜圖見圖1、樣品譜圖和加標(biāo)樣譜圖見圖2。

圖1 維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品譜圖

圖2 乳粉中維生素B12譜圖(A 圖為樣品、B 圖為加標(biāo)樣)

2 檢測(cè)條件的優(yōu)化

2.1 流動(dòng)相的選擇

按照GB/T 5009.217—2008 中流動(dòng)相為0.025%三氟乙酸(pH 值為2.6)和乙腈，筆者將0.025%三氟乙酸(pH 值=2.6)換成純水，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示目標(biāo)物的相應(yīng)沒(méi)有發(fā)生明顯的變化?？紤]到流動(dòng)相pH 偏低對(duì)色譜柱的壽命有影響，故將流動(dòng)相調(diào)整為水和乙腈。

2.2 流速的選擇

通常高效液相色譜的流動(dòng)相流速為1mL/min，筆者嘗試比較不同流速時(shí)目標(biāo)物的相應(yīng)發(fā)現(xiàn)，隨著流動(dòng)相流速的降低，目標(biāo)物的靈敏度和響應(yīng)顯著增加(圖3)。相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，在不同流速下，標(biāo)準(zhǔn)品的峰高從1.855 上升到2.690，峰面積也增加110%?？紤]到實(shí)驗(yàn)總消耗時(shí)限，選擇0.25mL/min 作為最終方法確認(rèn)的實(shí)驗(yàn)條件。

圖3 不同流動(dòng)相流速時(shí)維生素B12譜圖

3 結(jié)果與分析

3.1 線性范圍和檢出限

稱取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，5%乙醇水配制濃度為1mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，然后用水稀釋成濃度為0、0.01、0.02、0.10、0.20、0.50、1.00μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.520 8 +0.000 7，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9，說(shuō)明在0.01～1μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。噪比為3 時(shí)，樣品中最低檢出濃度為5μg/kg。

3.2 準(zhǔn)確性

取嬰幼兒乳粉樣品，按照1.3 中步驟處理樣品，同時(shí)進(jìn)行3 個(gè)水平加標(biāo)實(shí)驗(yàn)(表2)，測(cè)定樣品的加標(biāo)回收率80.0%～90.0%，符合GB 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》附錄F 中＜0.1mg/kg 的組分含量回收率范圍在60%～120%的要求。

表2 回收率測(cè)定結(jié)果

3.3 方法的重復(fù)性與穩(wěn)定性

取不同濃度的樣品分別進(jìn)行測(cè)定6 次(表3)，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.3%～1.6%，說(shuō)明本方法重復(fù)性好。將處理好的樣品放入4℃的冰箱中避光保存，在12h 內(nèi)測(cè)定結(jié)果未見有顯著性差異。

表3 不同濃度樣品重復(fù)測(cè)定結(jié)果

4 討論

本文所建立的免疫親和—高效液相色譜法較微生物檢驗(yàn)方法來(lái)說(shuō)，易于操作和掌握，重復(fù)性和穩(wěn)定性較好，流動(dòng)相的變化更有利于延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，檢出限能滿足日常嬰幼兒乳粉的檢測(cè)，能應(yīng)用在日常檢驗(yàn)工作中，大大提高工作效率。

［1］王華，陳輝，李雪梅，等.維生素B12功能及營(yíng)養(yǎng)作用研究［J］.中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2007，2:57-58.

［2］GB 14880—2012 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)［S］.

［3］GB 5413.14—2010 嬰幼兒食品和乳制品中維生素B12測(cè)定方法［S］.

［4］GB/T 5009.217—2008 保健食品中維生素B12的測(cè)定［S］.