阿托伐他汀聯(lián)合L-4F對(duì)apoE缺失小鼠HDL功能及水平的影響

李 鵬，程 誠(chéng)，畢明輝，王月剛△，吳平生

（1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院心內(nèi)科，廣州510515；2.中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院內(nèi)科，廣東珠海519000）

冠心病嚴(yán)重危害人類健康，動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是其主要病理基礎(chǔ)。在AS 發(fā)生發(fā)展過程中氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)及血脂異常具有重要作用［1-2］，氧化應(yīng)激可促進(jìn)低密度脂蛋白（LDL）氧化修飾，導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷，進(jìn)而激活炎性因子，進(jìn)一步增加炎性反應(yīng)，促進(jìn)斑塊形成。所以，抗氧化、抗炎對(duì)于抗AS具有積極意義［3］。氧磷酸酶（PON1）是重要抗氧化酶，通過抑制低密度脂蛋白膽固醇（LDL-L）氧化修飾等途徑達(dá)到抗AS作用；髓過氧化物酶（MPO）是強(qiáng)致氧化物酶，通過破壞高密度脂蛋白膽固醇（HDL-L）逆轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，導(dǎo)致炎性反應(yīng)。本研究通過采用高脂飲食喂養(yǎng)appE缺失（apoE-／-）小鼠建立AS模型，比較阿托伐他汀聯(lián)合載脂蛋白A-I（apoA-I）模擬肽（L-4F）對(duì)AS小鼠血清PON1、MPO活性及LDL-C、HDL-C水平的影響，探討阿托伐他汀聯(lián)合L-4F抗AS機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)8周齡apoE-／-小鼠，雄性，體質(zhì)量18.5～21.5g，適齡、健康，共50只，SPF 級(jí)8 周齡C57BL／6J小鼠，體質(zhì)量18.5～21.5g，適齡、健康，共20只，均購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部。兩種小鼠均飼養(yǎng)在南方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)溫度控制在25 ℃，濕度7%，自動(dòng)通風(fēng)器保持室內(nèi)通風(fēng)。普通飼料及高脂飼料均購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 阿托伐他汀購(gòu)自輝瑞制藥有限公司，L-4F購(gòu)自深圳瀚宇藥業(yè)有限公司，L-氨基酸序列如下：ACDWFKAKYDAKVAEKFKEAF-NH2由深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司提供。乙酸苯酯購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；血清MPO 活性測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。AU-5421型生化自動(dòng)分析儀為日本Olympus公司生產(chǎn)；Universal 16R 型低溫冷凍高速離心機(jī)為美國(guó)Thermo公司生產(chǎn)；ND-1000Spectrophotometer型分光光度儀為美國(guó)生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 C57BL／6J小鼠20只給予常規(guī)飲食，作為正常對(duì)照組；apoE-／-小鼠給予高脂飲食［4］作為模型組（50只）。分別給予4周飲食后，選擇兩種小鼠各10只，檢測(cè)相應(yīng)的血清指標(biāo)，作為基線值。其余apoE-／-小鼠分為4組，模型對(duì)照組、阿托伐他汀組、L-4F 組、阿托伐他汀聯(lián)合L-4F組，每組10 只。正常對(duì)照組：普通飼料喂養(yǎng)，并給予灌服和（或）腹腔注射等體積生理鹽水。模型對(duì)照組：高脂飼料喂養(yǎng)，同時(shí)給予灌服和（或）腹腔注射等體積生理鹽水。阿托伐他汀組：在高脂飼料喂養(yǎng)基礎(chǔ)上，經(jīng)灌胃給藥阿托伐他汀1.3mg·kg-1·d-1。L-4F組：在高脂飼料喂養(yǎng)基礎(chǔ)上，腹腔注射給藥L-4Fmg·kg-1·d-1。阿托伐他汀聯(lián)合L-4F組：在高脂飼料喂養(yǎng)基礎(chǔ)上，經(jīng)灌胃給藥阿托伐他汀1.3 mg／kg和腹腔注射L-4Fmg·kg-1·d-1。實(shí)驗(yàn)第4 周，取正常對(duì)照組及模型組小鼠各10只在空腹12h狀態(tài)下采用乙醚吸入麻醉后死后，實(shí)驗(yàn)第8周同樣方法處死剩余小鼠，心臟采血，3 000r／min離心15min，取上清，置于-80 ℃冰箱保存，統(tǒng)一檢測(cè)血清各指標(biāo)。

1.3.2 血清中PON1、MPO 活性及LDL-L、HDL-L水平的測(cè)定 血清PON1活性測(cè)定參考Tang等［5］的檢測(cè)方法，以乙酸苯酯為底物，采用分光光度計(jì)法測(cè)定血清PON1 活性。血清MPO 活性根據(jù)南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定。血脂測(cè)定采用酶法用日本Au-5421型全自動(dòng)生化儀上測(cè)定血清LDL-C、HDL-C水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，所有計(jì)量資料以±s表示，兩樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，多組間總體均數(shù)比較，在方差齊時(shí)采用單向方差分析，方差不齊時(shí)采用Welch校正檢驗(yàn)。多個(gè)樣本均數(shù)間的多重比較方差齊時(shí)采用LSD 法檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Dunnett′sT檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠血清PON1、MPO 活性的比較

2.1.1 不同時(shí)間點(diǎn)組內(nèi)比較 正常對(duì)照組小鼠血清PON1、MPO 活性第8 周末與第4 周末相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。模型對(duì)照組小鼠血清PON1活性第8周末較第4周末明顯降低，而小鼠血清MPO 活性第8周末較第4周末明顯升高（均P＜0.01）。見表1。

2.1.2 同時(shí)間點(diǎn)組間比較 模型對(duì)照組與正常對(duì)照組同期相比，小鼠血清PON1、MPO 活性在第4周末時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），第8周末時(shí)模型對(duì)照組小鼠血清PON1活性明顯低于正常對(duì)照組（P＜0.01），而小鼠血清MPO 活性則明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.01）。阿托伐他汀組、IL-4組小鼠第8周末血清PON1 活性顯著高于同期模型對(duì)照組（均P＜0.01），MPO 活性顯著低于模型對(duì)照組，但血清PON1活性顯著低于同期正常對(duì)照組（P＜0.01），而血清MPO 活性顯著高于同期對(duì)照組（P＜0.01）。而L-4F組與同期阿托伐他汀組比較二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。阿托伐他汀聯(lián)合L-4F組小鼠第8周末血清PON1活性較同期模型對(duì)照組、阿托伐他汀組及L-4F 組均顯著增加（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.05），而血清MPO 活性較同期模型對(duì)照組、阿托伐他汀組和L-4F組顯著降低（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01），與同期對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.2 各組小鼠血清LDL-C、HDL-C水平

2.2.1 不同時(shí)間點(diǎn)組內(nèi)比較 正常對(duì)照組小鼠第8周末血清LDL-C、HDL-C水平與第4周末均無明顯差異（均P＞0.05）。模型對(duì)照組小鼠血清LDL-C水平第8周末顯著高于第4周末（P＜0.05）。而血清HDL-C 水平小鼠第8周末顯著低于第4周末（P＜0.05）。見表2。

表1 對(duì)apoE-／-小鼠血清PON1、MPO 活性的影響（±s）

表1 對(duì)apoE-／-小鼠血清PON1、MPO 活性的影響（±s）

a：P＜0.01，與同組第4周末比較；b：P＜0.05，c：P＜0.01，與同期正常對(duì)照組同期比較；d：P＜0.05，e：P＜0.01，與同期AS模型組比較；f：P＜0.05，g：P＜0.01，與同期阿托伐他汀比較；h：P＜0.05，i：P＜0.01，與L-4F組比較；-：此項(xiàng)無數(shù)據(jù)。

組別 n PON1活性第4周末（U／mL） 第8周末（U／mL）MPO 活性第4周末（U／L） 第8周末（U／L）正常對(duì)照組 10 120.51±7.46 117.34±8.32 26.54±2.46 29.34±2.32模型對(duì)照組 10 116.75±9.21 96.69±6.26ac 32.75±2.21 48.69±3.26ac阿托伐他汀組 10 - 107.12±7.53ce - 39.02±2.53ce L-4F組 10 - 104.75±6.14ab - 41.75±5.23ce阿托伐他汀聯(lián)合L-4F組 10 - 115.68±8.48efh - 32.68±3.28eg i

表2 對(duì)apoE-／-小鼠血清LDL-C、HDL-C水平的影響（±s）

表2 對(duì)apoE-／-小鼠血清LDL-C、HDL-C水平的影響（±s）

a：P＜0.05，與同組第4周末比較；b：P＜0.05，c：P＜0.01，與同期正常對(duì)照組同期比較；d：P＜0.05，e：P＜0.01，與同期模型對(duì)照組比較；f：P＜0.01，與同期L-4F組比較。-：此項(xiàng)無數(shù)據(jù)。

組別 n LDL-C第4周末（mmol／L） 第8周末（mmol／L）HDL-C第4周末（mmol／L） 第8周末（mmol／L）正常對(duì)照組10 0.47±0.11 0.54±0.12 2.44±0.46 2.54±0.21模型對(duì)照組 10 8.42±1.01 9.78±1.13a 2.85±1.21 2.48±0.32a阿托伐他汀組 10 - 8.21±1.08ce - 2.84±0.37d L-4F組 10 - 9.54±1.05c - 2.58±0.45阿托伐他汀聯(lián)合L-4F組 10 - 7.76±1.02cef - 3.08±0.48 cef

2.2.2 同時(shí)間點(diǎn)組間比較 阿托伐他汀組第8周末小鼠血清LDL-C水平顯著高于同期正常對(duì)照組（P＜0.01），較同期模型對(duì)照組顯著降低（P＜0.05）。而小鼠血清HDL-C 水平較同期模型對(duì)照組顯著升高（P＜0.05）。L-4F組第8周末小鼠血清LDL-C、HDL-C水平與同期模型對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。阿托伐他汀聯(lián)合L-4F組小鼠第8周末血清LDL-C水平較模型對(duì)照組、L-4F組顯著降低（均P＜0.01），而血清HDL-C水平顯著升高（P＜0.01）。見表2。

3 討 論

目前關(guān)于AS發(fā)病機(jī)制研究較多，但尚未有一致結(jié)論［6-7］。在AS發(fā)生發(fā)展過程中氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)及血脂異常具有重要作用，HDL的抗AS作用主要表現(xiàn)在其促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)，但其抗氧化抗炎功能也發(fā)揮重要作用［8-9］。阿托伐他汀為HMG-CoA 還原酶選擇性抑制劑，通過抑制HMG-CoA 還原酶和膽固醇在肝臟的合成，降低血漿膽固醇和脂蛋白水平，并能不同程度地提高血漿HDL-C和載脂蛋白A1的水平。L-4F具有促膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)作用以及改善血管舒張功能、減輕AS程度、抑制炎癥因子分泌以及內(nèi)皮保護(hù)等作用［10-11］。PON1活性及MPO 活性可反映HDL的抗氧化抗炎功能。

PON1是HDL重要的抗氧化酶之一，可抑制LDL 被氧化修飾及脂質(zhì)過氧化物堆積，從而發(fā)揮抗AS 的作用。動(dòng)物研究［12］發(fā)現(xiàn)，PON1 敲除鼠易發(fā)生AS，而且與正常鼠相比，其HDL和LDL 更容易被氧化。本研究也發(fā)現(xiàn)AS模型組血清PON1活性較正常對(duì)照組明顯下降，與以上結(jié)論一致。MPO是一種強(qiáng)氧化酶，以H2O2作為底物，可產(chǎn)生硝基化等中間產(chǎn)物，中間產(chǎn)物以apoA-I為靶點(diǎn)，使得結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，促進(jìn)氧化。與AS模型對(duì)照組比較，各藥物組血清PON1活性顯著升高，而MPO 活性顯著降低，兩藥聯(lián)用比單藥應(yīng)用有顯著差異，提示阿托伐他汀和L-4F均有助于升高血清PON1活性、降低血清MPO 活性，從而改善HDL的抗氧化功能，兩藥聯(lián)用可以更進(jìn)一步改善HDL抗氧化功能，優(yōu)于單藥使用。這為臨床應(yīng)用提供了新的思路和方向。

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