脫氫洛伐他汀對佐劑性關(guān)節(jié)炎的作用研究＊

鄧慶華，楊元娟△，周岐新，劉曉穎，顧 群

（1.重慶醫(yī)藥高等專科學(xué)校藥學(xué)院 401331；2.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室 400016）

脫氫洛伐他?。╠ehydrolovastatin，DLVT）是他汀類的一個(gè)新衍生物，前期的研究表明DLVT 在使用相當(dāng)于洛伐他汀的用量時(shí)，其調(diào)脂作用、改善脂肪肝的作用及抗炎作用強(qiáng)度與等劑量的洛伐他汀大致相當(dāng)，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值［1］。本實(shí)驗(yàn)以AA 小鼠為模型，進(jìn)一步觀察脫氫洛伐他汀對小鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）的治療作用，并探討作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑及儀器 藥品：DLVT 由重慶大新藥業(yè)股份有限公司提供，批號20120501。對照藥物：洛伐他?。╨ovastatin，LVT），由重慶大新藥業(yè)股份提供，批號20120501。陽性對照藥：酮洛芬（ketoprofen，KPF）由西南合成制藥股份有限公司提供，批號20120401。臨用時(shí)，用電子分析天平稱取一定量，在研缽內(nèi)研磨細(xì)后用0.5%的羧甲基纖維素鈉配成適當(dāng)?shù)娜芤簜溆?。弗氏完全佐劑（Freund′s complete adjuvant，F(xiàn)CA）由Sigma公司提供，10mL。儀器包括電子分析天平、YLS-7B足跖容積測量儀、3K30型超低溫離心機(jī)、臺式高速離心機(jī)、顯微鏡、DNP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀等。

1.2 動(dòng)物 昆明小鼠（20±2）g 60只，清潔級，雄性，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。批號SCXK（渝）2012001。

1.3 方法

1.3.1 分組及給藥 將60只小鼠隨機(jī)分為6組，即正常對照組、佐劑性關(guān)節(jié)炎模型（AA）組、DLVT 低劑量組（8.4 mg·kg-1·d-1）和高劑量組（16.8mg·kg-1·d-1）、LVT 組（8.4 mg·kg-1·d-1）、KPF 組（20 mg·kg-1·d-1），每組10 只。各藥物處理組小鼠造模后灌胃相應(yīng)藥物，正常組和模型組給予等體積0.5%的羧甲基纖維素鈉。

1.3.2 小鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型的建立［2］于第3天給予弗氏完全佐劑后30min，除正常對照組外，其余各組每只小鼠右后足跖皮內(nèi)注射FAC 0.1mL，正常對照組注射等量生理鹽水，造模后連續(xù)給予弗氏完全佐劑30d。

表1 DLVT 對AA 小鼠原發(fā)性、繼發(fā)性足腫脹的影響（±s，mL，n＝10）

表1 DLVT 對AA 小鼠原發(fā)性、繼發(fā)性足腫脹的影響（±s，mL，n＝10）

a：P＜0.01，與對照組比較；b：P＜0.05，c：P＜0.01，與AA 組比較。

組別原發(fā)性（mL）6h 18h 24h 8d繼發(fā)性15d 20d 24d 28d對照組 0.013±0.002 0.014±0.002 0.011±0.004 0.011±0.003 0.011±0.013 0.012±0.012 0.011±0.011 0.011±0.012 AA 組 0.523±0.054a 0.571±0.038a 0.641±0.042a 0.515±0.042a 0.335±0.054a 0.361±0.048a 0.383±0.042a 0.379±0.041a DLVT 低 劑 量 組 0.491±0.021b 0.465±0.025b 0.486±0.024b 0.398±0.023b 0.278±0.033b 0.285±0.025b 0.296±0.034b 0.288±0.033b DLVT 高 劑 量 組 0.382±0.024c 0.354±0.022c 0.378±0.029c 0.384±0.032c 0.264±0.024c 0.276±0.031c 0.278±0.039c 0.284±0.042c LVT 組 0.371±0.036c 0.367±0.029c 0.355±0.026c 0.372±0.025c 0.269±0.042c 0.279±0.036c 0.287±0.031c 0.286±0.026c KPF組 0.318±0.011c 0.355±0.022c 0.367±0.033c 0.325±0.019c 0.262±0.021c 0.259±0.032c 0.272±0.043c 0.260±0.029 c

1.3.3 小鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型的評價(jià)［3］致炎前先用足跖容積測量儀分別測量小鼠左右足爪容積作為基礎(chǔ)值，分別在致炎后6、18、24h，8d，測量小鼠致炎側(cè)足爪容積，以致炎前后足跖容積之差為腫脹度，觀察AA 小鼠原發(fā)性病變；在致炎后第15、20、24、28天分別測量小鼠致炎對側(cè)足足爪容積，以致炎前后足跖容積之差為腫脹度，觀察AA 小鼠繼發(fā)性炎癥情況。致炎后15～28d，同時(shí)觀察小鼠前肢、后肢、耳、鼻和尾部病變的發(fā)生情況，并進(jìn)行評分，每只動(dòng)物的評分相加得關(guān)節(jié)炎指數(shù)。計(jì)算各組的關(guān)節(jié)炎指數(shù)來評價(jià)繼發(fā)性病變的嚴(yán)重程度。

1.3.4 小鼠爬梯實(shí)驗(yàn) 小鼠爬梯箱為白色塑料制成，結(jié)構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)化，內(nèi)含5級高2.5cm、寬10cm 的相同樓梯，內(nèi)壁高度恒定，以使小鼠在樓梯的所有水平都有相同的站立分布，在安靜、光線恒定的環(huán)境下進(jìn)行。致炎后30d將各組小鼠依次置于箱的底部，背朝樓梯放入。記錄3 min內(nèi)小鼠的爬梯數(shù)和站立數(shù)。每只動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后迅速放入清潔實(shí)驗(yàn)箱，以排除嗅覺暗示對下一只動(dòng)物的干擾。通過爬梯實(shí)驗(yàn)反映小鼠的運(yùn)動(dòng)活性。

1.3.5 MTT 法檢測LPS誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)［4］30 d后脫頸處死小鼠，無菌取出脾臟，剔除脂肪和結(jié)締組織后捻碎，收集單個(gè)脾細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106／L。于96孔培養(yǎng)板上每孔加入100μL脾細(xì)胞懸液，在分別加入100μL 含5 mg／L脂多糖（LPS）的RPMI1640培養(yǎng)液。置37 ℃濕度飽和的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，終止培養(yǎng)前4h每孔加入5 mg／mL的MTT 10μL，震蕩后繼續(xù)培養(yǎng)4h，培養(yǎng)結(jié)束后取出96孔板，離心，吸棄上清液，每孔加入100μL 二甲基亞砜，置搖床上低速震蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀570nm 處測量各孔的吸光度（A）值，每份樣品做3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果以3個(gè)復(fù)孔A值平均值表示。

1.3.6 小鼠非致炎側(cè)踝關(guān)節(jié)病理檢查 30d眼球取血處死小鼠后剪取左踝關(guān)節(jié)，10%的甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，制作標(biāo)本，蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.3.7 小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1、NO 的檢測 造模30d后麻醉小鼠，摘除眼球取血。離心取血清，按照雙抗體兩步夾心ELISA 試劑盒說明書操作，分別檢測小鼠血清中TNF-α、IL-6、TL-1、NO 細(xì)胞因子的水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，組內(nèi)比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DLVT 對AA 小鼠原發(fā)性炎癥的影響 AA 組小鼠致炎后不同時(shí)段致炎側(cè)足腫脹度均顯著高于對照組（P＜0.01），致炎后第24小時(shí)足腫脹達(dá)到高峰。各藥物組從致炎6h后均發(fā)揮藥效，DLVT（8.4、16.8 mg·kg-1·d-1）灌胃給藥可抑制AA 小鼠的原發(fā)性足腫脹，與AA 組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），見表1。與AA 組比較，DLVT（8.4、16.8mg·kg-1·d-1）灌胃給藥可抑制AA 小鼠繼發(fā)性足腫脹，并減少多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)。見表1、2。

表2 脫氫洛伐他汀對AA 小鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎 指數(shù)的影響（±s，n＝10）

表2 脫氫洛伐他汀對AA 小鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎 指數(shù)的影響（±s，n＝10）

a：P＜0.01，與對照組比較；b：P＜0.05、c：P＜0.01，與AA 組比較。

組別15d 20d 24d 28d對照組0.41±0.15 0.32±0.12 0.21±0.14 0.11±0.12 AA組 5.18±0.82a 6.49±0.68a 6.88±0.91a 5.29±0.75a DLVT低劑量組 4.63±0.52 5.85±0.81b 5.94±0.68c 3.87±0.73c DLVT高劑量組 4.63±0.55 4.78±0.73c 5.98±0.62b 3.85±0.65c LVT組 4.56±0.77 4.76±0.64c 4.57±0.81c 3.68±0.74c KPF組 4.83±0.62 4.58±0.52c 4.63±0.61c 3.27±0.86 c

2.2 脫氫洛伐他汀對AA 小鼠爬梯活動(dòng)的影響 與正常組比較，AA 組小鼠運(yùn)動(dòng)活動(dòng)功能明顯下降，舉足站立和爬梯數(shù)減少（P＜0.05）。與AA 組比較，DLVT（16.8mg·kg-1·d-1）灌胃給藥可明顯增強(qiáng)AA 小鼠站立和爬梯能力。見表3。

表3 DLVT 對AA 小鼠爬梯活動(dòng)及脾淋巴細(xì)胞增殖 的影響（±s，n＝10）

表3 DLVT 對AA 小鼠爬梯活動(dòng)及脾淋巴細(xì)胞增殖 的影響（±s，n＝10）

a：P＜0.01，與對照組比較；b：P＜0.05、c：P＜0.01，與AA 組比較。

組別 舉前足數(shù)（次／3min）爬梯數(shù)（次／3min）A 值（570nm）對照組10.6±2.4 14.7±4.0 0.451±0.062 AA 組 6.3±2.4a 7.6±3.1a 0.565±0.081a DLVT 低劑量組 7.6±3.5 10.7±3.2b 0.491±0.083b DLVT 高劑量組 8.9±2.8b 11.6±3.9c 0.486±0.091b LVT 組 9.4±2.5b 12.2±4.7c 0.475±0.086b KPF組 9.7±3.4b 11.6±3.5c 0.468±0.091 b

2.3 脫氫洛伐他汀對AA 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響 與對照組比較，AA 組小鼠脾淋巴細(xì)胞增值明顯增強(qiáng)（P＜0.05），而DLVT（8.4、16.8mg·kg-1·d-1）灌胃給藥可抑制LPS誘導(dǎo)的AA 脾淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)。見表3。

2.4 DLVT 對AA 小鼠非致炎側(cè)踝關(guān)節(jié)病理結(jié)果影響 對照組小鼠踝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)正常；AA 組踝關(guān)節(jié)滑膜上皮呈乳突狀增生，滑膜大量炎癥細(xì)胞浸潤，血管增生，關(guān)節(jié)軟骨破壞；DLVT低劑量組關(guān)節(jié)滑膜纖維組織中度增生伴少量炎癥細(xì)胞浸潤；DLVT 高劑量組關(guān)節(jié)滑膜纖維組織輕度增生伴少量炎癥細(xì)胞浸潤；LVT 組踝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)基本正常；KPF 組關(guān)節(jié)滑膜纖維組織輕度增生伴少量炎癥細(xì)胞浸潤。見圖1。

2.5 DLVT 對AA 小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1、NO 水平的影響 AA 組小鼠血清IL-6、IL-1、NO 及TNF-α含量均顯著高于對照組（P＜0.01），其余各給藥組小鼠血清IL-6、IL-1、NO及TNF-α含量均顯著低于AA 組（P＜0.01），見圖1、表4。

圖1 DLVT 對AA 小鼠非致炎側(cè)踝關(guān)節(jié)病理檢查結(jié)果（HE×100）

表4 小鼠血清中IL-6、IL-1、NO、TNF-α的檢測（±s，n＝10）

表4 小鼠血清中IL-6、IL-1、NO、TNF-α的檢測（±s，n＝10）

a：P＜0.01，與對照組比較；b：P＜0.01，與AA 組比較。

組別 IL-6（pg／mL） IL-1（pg／mL） NO（μmol／L） TNF-α（pg／mL）對照組 47.24±1.51 53.50±1.40 120.00±1.79 207.24±24.51 AA 組 102.14±1.44a 119.36±2.51a 168.85±2.41a 402.14±31.44a DLVT 低劑量組 80.94±1.24b 86.68±1.31b 141.86±2.73b 319.94±35.24b DLVT 高劑量組 82.21±1.59b 80.90±2.91b 134.86±2.12b 296.67±24.38b LVT 組 76.67±1.38b 88.43±0.79b 140.00±2.08b 282.21±31.60b KPF組 62.22±1.55b 67.49±1.22b 129.29±2.14b 262.22±42.58 b

3 討 論

近年的基礎(chǔ)和臨床研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物抑制類異戊二烯（isoprenoid）中間體如異戊二烯焦磷酸法尼酯（farnesylpyrophosphate，F(xiàn)PP）和類異戊二烯四異戊二烯焦磷酸 （geranylgeranylpyrophosphate，GGPP）合成，進(jìn)而抑制細(xì)胞內(nèi)類異戊二烯依賴的蛋白［5］，發(fā)揮抗心血管重構(gòu)、抗腫瘤、預(yù)防癡呆、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等多種作用，因而對身患代謝性疾病兼有風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）和Crohn′s 病患者具有良好臨床療效［6］。

在RA 整個(gè)病理過程中都有細(xì)胞因子參與，它們構(gòu)成了一個(gè)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，可以互相調(diào)控，其中IL-1、IL-6、TNF-α為前炎性因子。研究發(fā)現(xiàn)，RA 患者關(guān)節(jié)中的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生大量TNF-α，患者關(guān)節(jié)滑液中TNF-α的濃度比健康人高，TNF-α刺激關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增生，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞向炎性關(guān)節(jié)區(qū)聚集，并大量釋放炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子，如IL-1、IL-6等，促進(jìn)膠原酶和基質(zhì)降解酶等金屬蛋白酶的產(chǎn)生，這些均刺激破骨細(xì)胞的分化和活性，導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)的損傷［13］。

IL-1是內(nèi)源性致熱原可誘導(dǎo)其他多種前炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，參與RA 的病理損害［8］。研究表明RA 患者血清及關(guān)節(jié)液中檢測出高水平的IL-1［9］，IL-1是RA 關(guān)節(jié)軟骨破壞最重要的一種細(xì)胞因子，促進(jìn)滑膜細(xì)胞核軟骨細(xì)胞合成并釋放PGE2和膠原酶，誘導(dǎo)RA 關(guān)節(jié)滑液細(xì)胞增殖及產(chǎn)生蛋白激酶，PGE2和膠原酶可引發(fā)滑膜炎性反應(yīng)、軟骨基質(zhì)的崩解。TNF-α與IL-1常常同時(shí)合成與分泌，還促進(jìn)對方的合成，對RA 共同起到“中心犯罪”的作用。大量研究也表明在RA 患者血清及關(guān)節(jié)液中的IL-6水平升高，活動(dòng)期患者滑液中IL-6含量是血清內(nèi)的1 000多倍，其阻滯劑能明顯改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以及臨床RA患者的癥狀［10］。

現(xiàn)代研究認(rèn)為NO 的過度合成是RA 發(fā)病機(jī)制的重要因素之一。研究發(fā)現(xiàn)在RA 和骨關(guān)節(jié)炎患者的滑膜液和血液中可檢測到大量NO 代謝產(chǎn)物亞硝酸鹽，推測NO 參與這兩種疾病關(guān)節(jié)炎癥的病理過程。DLVT 明顯減少NO 生成，抑制了關(guān)節(jié)炎癥的進(jìn)一步發(fā)展。

本研究顯示DLVT 減輕AA 小鼠原發(fā)性和繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎，減少多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)，增強(qiáng)AA 小鼠站立和爬梯能力，抑制AA 小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)，通過細(xì)胞因子的檢測進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，模型小鼠外周血清中的IL-6、IL-1、NO 及TNF-α水平顯著升高。從病理改變程度方面，DLVT 能有效控制AA 小鼠關(guān)節(jié)纖維增生和滑膜增生，減少炎癥細(xì)胞的浸潤。因此，DLVT 能控制AA 小鼠的病情發(fā)展，其明顯抑制促炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-1、NO 及TNF-α病理性的升高可能是DLVT 有效治療RA 的作用機(jī)制之一。

［1］ 鄧慶華，周岐新，陳勇，等.脫氫洛伐他汀的調(diào)脂和抗炎作用的關(guān)系［J］.中國新藥雜志，2011，20（2）：162-166.

［2］ 王貴林，朱路.生姜油對小鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的作用［J］.中藥藥理與臨床，2007，23（5）：94-95.

［3］ 徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：919-922.

［4］ Tomita T，Kakiuchi Y，Tsao PS.THR0921，a novel peroxisome proliferators activated receptor gamma agonist，reduces the severity of collagen-induced arthritis［J］.Arthritis Res Ther，2005，8（1）：10-18.

［5］ Ghittoni R，Paturssi L，Pirozzi K，et al.Simvastatin inhibits T-cell activation by selectively impairing the function of Ras super-family GTPases［J］.FASEBJ，2005，19（6）：605-607.

［6］ Zhou Q，Liao JK.Pleiotropic effects of statins-basic research and clinical perspectives［J］.Circ J，2010，74（5）：818-826.

［7］ 李可大.免疫調(diào)節(jié)和前炎性因子（TNF-α）在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的作用與意義［J］.中醫(yī)藥學(xué)刊，2004，22（10）：1844-1849，1865.

［8］ 唐恩潔.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)［M］.3 版.成都：四川大學(xué)出版社，2004：75-77.

［9］ Kokebie R，Aggarwal R，Lidder SA，et al.The role of synovial fluid markers of catabolism and anabolism in osteoarthritis，rheumatoid arthritis and asymptomatic organ donors［J］.Arthritis Res Ther，2011，13（2）：R50.

［10］ 魏偉，李曉輝，張洪泉.抗炎免疫藥理學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：283-284.

［11］ Abdin AA，Abd El-Halim MS，Hedeya SE，et al.Effect of atorvastatin with or without prednisolone on Freund′s adjuvant induced-arthritis in rats［J］.Eur J Pharmacol，2012，676（1／3）：34-40.