骨形成蛋白9腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定＊

方 芳，張青藍(lán)，楊 孛，鄢國(guó)義，朱丹平

（重慶市中醫(yī)院／重慶市第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌科 400021）

骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins，BMP）屬轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子B超家族成員，在眾多生命活動(dòng)中均扮演重要角色。其中BMP9與糖、脂代謝中多個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)變環(huán)節(jié)有直接相關(guān)性。本課題組前期發(fā)現(xiàn)BMP9 基因表達(dá)異?？赡芘c2 型糖尿病（type 2diabetes mellitus，T2DM）代謝紊亂及胰島素分泌缺陷相關(guān)，結(jié)合Chen等［1］的研究，可推測(cè)：BMP9基因表達(dá)下降也許是導(dǎo)致T2DM 代謝異常的重要因素之一，增加其基因拷貝，可能使糖、脂代謝紊亂得到一定程度的改善。因此，課題組先行構(gòu)建BMP-9基因腺病毒表達(dá)載體及其穩(wěn)定的產(chǎn)毒細(xì)胞系，為后續(xù)觀察其對(duì)T2DM 糖、脂代謝異常的干預(yù)效應(yīng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 質(zhì)粒pCMV／BMP9 由Helm GA（University of Virginia Health System）饋贈(zèng)，質(zhì)粒pDV60含腺病毒Ad5纖維cDNA 由Nemerow GR 博 士（The Scripps Research Institue，California）饋贈(zèng)；293細(xì)胞系購(gòu)自上海易莎生物有限公司；脂質(zhì)體Lipofectamine2000購(gòu)自Invitrogen公司；EcoRⅠ、BamHⅠ酶購(gòu)自華美生物工程公司；T4DNA 連接酶購(gòu)自大連寶生物公司；Ploybrene、FBS均購(gòu)自Gibco公司；質(zhì)粒抽提及回收試劑盒購(gòu)自上海品美公司。

1.2 方法

1.2.1 去纖維腺病毒載體Ad5.BMP9.F構(gòu)建 質(zhì)粒pCMV／BMP9與腺病毒載體Ad5.F分別以EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切，切膠回收BMP9cDNA 與Ad5.F 線性載體片段，連接、轉(zhuǎn)化后，提取質(zhì)粒作酶切與測(cè)序鑒定。

1.2.2 Ad5.BMP9.F 包裝與滴度測(cè) 定 Lipofectamine2000介導(dǎo)Ad5.BMP9.F 轉(zhuǎn) 染293 細(xì) 胞，以 空 載 體Ad5.F 作 對(duì) 照（陰性對(duì)照組）；篩選直至肉眼可見(jiàn)抗性細(xì)胞克隆形成，挑選分隔良好的細(xì)胞克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，收集抗性細(xì)胞克隆上清測(cè)病毒滴度，留取滴度較高的細(xì)胞克隆及病毒原液備用。

1.2.3 腺病毒纖維cDNA 定點(diǎn)突變（F＋） 質(zhì)粒pDV60含腺病毒Ad5纖維cDNA 采用PCR 體外定點(diǎn)突變（PCR-SDM）法在pDV60上進(jìn)行定點(diǎn)突變，突變位點(diǎn)S408E、P409A（參見(jiàn)Xia-D 纖維結(jié)構(gòu)定位），致突變引物如下，結(jié)果經(jīng)測(cè)序鑒定。正向5′-CGC AGC CTT AAC CTC AGC-3′，反 向5′-GTT GGA GGC AGG CGT AGA-3′。

2 結(jié) 果

2.1 BMP9基因重組腺病毒載體鑒定

2.1.1 酶切鑒定 重組腺病毒載體Ad5.BMP9.F 經(jīng)EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切，獲得1 290bp的BMP9cDNA 片段，證實(shí)BMP9cDNA 已插入載體Ad5.F中且插入位點(diǎn)正確。

2.1.2 測(cè)序鑒定 經(jīng)酶切粗篩正確的重組質(zhì)粒送生工生物工程公司測(cè)序，證實(shí)目的基因序列與所贈(zèng)質(zhì)粒附注BMP9cDNA序列相同，見(jiàn)圖1。

圖1 BMP9基因測(cè)序圖

2.2 病毒滴度測(cè)定 脂質(zhì)體包裹Ad5.BMP9.F 同源重組腺病毒基因組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞15d后，光鏡及熒光顯微鏡下觀察到空斑形成，細(xì)胞變圓、腫脹、脫壁，細(xì)胞核變大等病變，轉(zhuǎn)染效率90%以上，見(jiàn)圖2。用Ad5.BMP9.F感染包裝細(xì)胞293細(xì)胞，約15d可見(jiàn)抗性細(xì)胞克隆，平均滴度6.0×105CFU／mL，最高滴度7.4×105CFU／mL。

圖2 轉(zhuǎn)染重組Ad5.BMP9.F載體15d后細(xì)胞形態(tài)變化（×100）

2.3 產(chǎn)毒細(xì)胞克隆鑒定 將293／BMP9細(xì)胞提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后用檢測(cè)引物進(jìn)行PCR，產(chǎn)物電泳于162bp處出現(xiàn)目的條帶，但陰性對(duì)照組RT-PCR產(chǎn)物電泳無(wú)目的條帶出現(xiàn)，證明BMP9基因已成功整合與轉(zhuǎn)錄。

圖3 BMP9基因RT-PCR鑒定

3 討 論

BMP屬轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族成員，因具強(qiáng)烈的骨誘導(dǎo)活性而受到關(guān)注，故目前研究多集中在其與骨疾病的關(guān)系及其調(diào)控骨再生的應(yīng)用上［2-3］。而事實(shí)上，BMP在眾多生命活動(dòng)中均扮演著重要角色，其能觸發(fā)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)原分化、維持腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)、調(diào)控造血干細(xì)胞數(shù)量及平衡內(nèi)皮細(xì)胞存亡等［4-8］。近期，通過(guò)高通量功能基因組篩選發(fā)現(xiàn)BMP9與糖、脂代謝中多個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)變環(huán)節(jié)有直接相關(guān)性，提示BMP9 還可能是一種新的糖、脂代謝調(diào)節(jié)因子［9-10］。Chen等［1］研究表明，BMP9能阻止磷酸烯醇式丙酮激酶（P-enolpyruvate carboxykinase，PEPCK）合成并激活絲／蘇氨酸激酶Akt，從而抑制肝內(nèi)糖異生并促進(jìn)肌糖原合成以降低血糖；同時(shí)，BMP9還能調(diào)控蘋(píng)果酸酶（malic enzyme，ME）與脂酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）的轉(zhuǎn)錄，這兩個(gè)酶均為涉及肝脂肪酸代謝的關(guān)鍵酶。BMP9可能通過(guò)對(duì)這些關(guān)鍵酶的調(diào)控而在糖、脂代謝中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。隨后的動(dòng)物體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)則證實(shí)了，BMP9具有部分類似胰島素的糖代謝調(diào)節(jié)作用［11］，并與B 細(xì)胞的胰島素分泌直接相關(guān)，而糖代謝紊亂與第一時(shí)相胰島素分泌缺陷又是T2DM 的主要特征。前期研究工作中發(fā)現(xiàn)在長(zhǎng)時(shí)間高糖狀態(tài)下，BMP9基因表達(dá)與血糖濃度呈異向變化趨勢(shì)，與急性胰島素對(duì)葡萄糖反應(yīng)（AIRg）呈同向變化趨勢(shì)，提示BMP9基因表達(dá)異?？赡芘cT2DM 糖代謝紊亂及胰島素分泌缺陷相關(guān)［12］。結(jié)合Chen等［1］的研究可推測(cè)：BMP9基因表達(dá)下降也許是導(dǎo)致T2DM 代謝異常的重要因素之一，增加BMP9基因拷貝，可能使糖、脂代謝紊亂得到一定程度的改善。

為更好達(dá)成上述研究目的，選擇高效、穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染載體較為重要。BMP9主要在肝臟表達(dá)，然而，腺病毒具有較高的轉(zhuǎn)染效率及一定的親肝性。而更重要的是，如何進(jìn)一步提高其肝靶向性？近期研究表明在經(jīng)典的柯薩奇-腺病毒受體（coxsackie-adenovirus receptor，CAR）／整合素通路以外，腺病毒對(duì)肝細(xì)胞還有其特異的感染通路，并在腺病毒侵入肝細(xì)胞過(guò)程中起主導(dǎo)作用［12］。阻斷CAR／整合素通路，機(jī)體其他部位的基因?qū)朊黠@下降，在肝臟卻沒(méi)有影響［13］。因此，本研究擬采用PCR-SDM 致5型腺病毒纖維頭部的CAR 結(jié)合位點(diǎn)突變，由此阻斷CAR／整合素通路，此種改良的腺病毒將具有更強(qiáng)的肝靶向性。本研究基于此法成功構(gòu)建了攜BMP9基因的穩(wěn)定產(chǎn)毒細(xì)胞克隆，其最高病毒滴度可達(dá)7.4×105CFU／mL。

下一步，課題組擬將BMP9基因在T2DM 鼠體內(nèi)定向?qū)敫渭?xì)胞并特異表達(dá)，觀察其對(duì)T2DM 糖、脂代謝紊亂的干預(yù)效應(yīng)，同時(shí)從胰島素敏感性、激素分泌、酶活性調(diào)節(jié)及基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控等角度出發(fā)，就其作用機(jī)制進(jìn)行探討，從而為深入理解T2DM 代謝紊亂的發(fā)生機(jī)制及制訂新的治療策略提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］ Chen Y，Grzeqorewski KJ，Barash S，et al.An intgrated fuction genomics screening program reveals a role for BMP-9in glucose homeostasis［J］.Nat Biotechnol，2003，21（3）：294-301.

［2］ Carreira AC，Alves GG，Zambuzzi WF，et al.Bone morphogenetic proteins：structure，biological function and therapeutic applications［J］.Arch Biochem Biophys，2014，561（6）：64-73.

［3］ Mbalaviele G，Sheikh S，Stains JP，et al.Beta-catenin and BMP-2synergize to promote osteoblast differentiation and new bone formation［J］.J Cell Biochem，2005，94（2）：403-418.

［4］ Porlan E，Manuel Morante-Redolat J，Angeles Marques-Torrejon M，et al.Transcriptional repression of Bmp2by p21（Waf1／Cip1）links quiescence to neural stem cell maintenance［J］.Nat Neurosci，2013，16（11）：1567-1575.

［5］ Zeisberg M，Shah AA，Kalluri R.Bone morphogenic protein-7induces mesenchymal to epithelial transition in adult renal fibroblasts and facilitates regeneration of injured kidney［J］.J Biol Chem，2005，280（9）：8094-8100.

［6］ Karlsson S.Stem cell expansion：success and complexities［J］.Blood，2004，104（8）：2210-2211.

［7］ Roux C，Pisani DF，Ben Yahia H，et al.Chondrogenic potential of stem cells derived from adipose tissue：A powerful pharmacological tool［J］.Biochem Biophys Res Commun，2013，440（4）：786-791.

［8］ Derynck R，Akhurst RJ.BMP-9balances endothelial cell fate［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2013，110（47）：18746-18747.

［9］ Groop L.Bringing diabetes therapeutics to the big screen［J］.Nat Biotechnol，2003，21（3）：240-241.

［10］ Luan HY，Yang LM，Liu L，et al.Effects of platycodins on liver complications of type 2diabetes［J］.Mol Med Rep，2014，10（3）：1597-1603.

［11］ Sosa I，Cvijanovic O，Celic T，et al.Hepatoregenerative role of bone morphogenetic protein-9［J］.Med Sci Monit，2011，17（12）：HY33-HY35.

［12］ 方芳，鄭宏庭，劉理，等.2型糖尿病大鼠肝臟骨形成蛋白9基因表達(dá)的變化及意義［J］.中國(guó)臨床康復(fù)，2006，10（32）：66-68.

［13］ Smith T，Idamakanti N，Kylefjord H，et al.In vivo hepatic adenoviral gene delivery occurs independently of the coxsackievirus-adenovirus receptor［J］.Mol Ther，2002，5（6）：770-779.

［14］ Deng G，Huang XJ，Luo HW，et al.Amelioration of Carbon tetrachloride-induced cirrhosis and portal hypertension in rat using adenoviral gene transfer of Akt［J］.World J Gastroenterol，2013，19（43）：7778-7787.