亞硝酸鈉短期暴露對雄性小鼠生殖的影響

何杰明 王麗麗 王尚明 張 斌 王 寧，＊ 徐 軍

1.北京市中關(guān)村中學(xué) （100086）；2.國家人口計生委科學(xué)技術(shù)研究所

亞硝酸鹽廣泛存在于熏制和腌制食品中，人體接觸亞硝酸鹽的機會也不斷增加［1］。越來越多的基礎(chǔ)和臨床研究提示亞硝酸鹽可以影響人類的健康，研究主要集中于亞硝酸鹽對肝、腎等組織的影響，亞硝酸鹽的致癌性等方面。硝酸鹽、亞硝酸鹽可能與人類先天畸形之間存在病因關(guān)聯(lián)［2］。目前由于男性精液質(zhì)量的下降導(dǎo)致不孕不育明顯呈上升趨勢，并且呈現(xiàn)低齡化傾向［3］。因此，本研究通過探討亞硝酸鈉對雄性小鼠生殖功能的影響，從而闡釋亞硝酸鹽與男性生殖力的關(guān)聯(lián)性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇8周齡雄性昆明小鼠［SPF級，SCXK－（軍）2007－004］50只，體重25～30g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供。在SPF級動物實驗室恒溫恒濕屏障環(huán)境飼養(yǎng)觀察1周后進(jìn)行實驗。

1.2 主要試劑和儀器

亞硝酸鈉由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，批號20140103；DMEM／F12培養(yǎng)液，Wincent公司生產(chǎn)，批號：319080－cl；顯微鏡，Olympus公司，日本。

1.3 溶液配制

國家規(guī)定肉制品中亞硝酸鹽的殘留量≤30～50 mg／kg，按此換算小鼠的等效劑量做為本底對照組小鼠給藥劑量。分別配制0.01、0.2、0.4、0.8mg／ml亞硝酸鈉溶液。每日灌胃給藥100μl，達(dá)到0.2 mg／（kg·d）。再分別設(shè)低［4mg／（kg·d）］、中［8 mg／（kg·d）］、高［16mg／（kg·d）］3個劑量組為實驗組，并設(shè)正常對照組［4］。各組動物以體重均衡隨機分組。

1.4 臟器系數(shù)、指數(shù)計算方法

臟器系數(shù)＝臟器重量（g）／體重（100g）；肝脾指數(shù)＝肝重量（g）／脾重量（g）

1.5 試驗方法

1.5.1 動物處理方法 每組10只，按照相應(yīng)劑量每天灌胃給藥，連續(xù)5d，飼養(yǎng)37d后，期間觀察染毒和飼養(yǎng)期間小鼠的生長發(fā)育、體重增長情況。稱量雄性小鼠體重，摘眼球取血，斷脊處死，解剖各種組織器官，睪丸、附睪分別稱重計算睪丸臟器系數(shù)。

1.5.2 精子計數(shù) 取出附睪計數(shù)精子，觀察其活動度。精子分析方法為雙側(cè)附睪稱重后，置于2ml DMEM培養(yǎng)液（37℃ 預(yù)溫）的小平皿中，用眼科剪剪碎，吸管吹打，于顯微鏡下觀察計數(shù)［5］。

1.5.3 病理學(xué)觀察 每只小鼠一側(cè)睪丸使用多聚甲醛固定做常規(guī)病理學(xué)切片、HE染色，觀察睪丸組織病理學(xué)形態(tài)改變。

1.6 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 亞硝酸鈉短期暴露對小鼠體重和主要組織器官的影響

由表1可見，雄鼠在短期喂食亞硝酸鹽后，與正常對照組相比，本底對照組體重增加明顯，低中高劑量組小鼠體重增加尤為明顯（P＜0.05）。肝和脾的組織重量增加，肝、脾的臟器系數(shù)增加明顯（P＜0.05）。肝脾指數(shù)變化不明顯。

表1 亞硝酸鈉短期暴露后小鼠體重及身體系數(shù)指標(biāo)情況（）

表1 亞硝酸鈉短期暴露后小鼠體重及身體系數(shù)指標(biāo)情況（）

與正常對照組比較＊P＜0.05 ＊＊P＜0.01 與本底對照組比較＃P＜0.05 △P＜0.01

組別 例數(shù) 體重增加（g） 肝臟指數(shù) 脾臟指數(shù) 肝脾指數(shù)正常對照組 10 5.647±3.70 3.98±0.26 0.204±0.018 20.025±3.41本底對照組 10 7.738±3.07＊ 4.64±0.047＊＊ 0.202±0.030 20.345±1.52低 劑 量組 10 11.359±1.29＊＊＃ 4.88±0.50＊＊ 0.224±0.047 20.311±3.05中 劑 量組 10 11.837±3.37＊＊＃ 4.84±0.26＊＊ 0.237±0.039＊＊△ 20.892±3.08高 劑 量組 10 12.593±3.69＊＊＃ 4.89±0.21＊＊ 0.241±0.046＊＊△ 18.849±3.42

2.2 亞硝酸鈉短期暴露對小鼠生殖器官指數(shù)的影響

由表2可見，小鼠睪丸指數(shù)與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；亞硝酸鹽中高劑量組附睪指數(shù)低于對照組（P＜0.05）。

2.3 亞硝酸鈉短期暴露對小鼠計數(shù)精子和精子功能指標(biāo)的影響

由表3可見，與正常對照組相比，小鼠喂食亞硝酸鈉后精子總數(shù)明顯下降（P＜0.05）；實驗組與本底對照組相比，精子總數(shù)無差異（P＞0.05）。除高劑量暴露組c級精子比例下降有統(tǒng)計學(xué)差異，實驗組與正常對照組和本底對照的a、b、c級精子所占比例比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；實驗組精子活率與本底對照比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；與正常對照相比，中劑量和高劑量的亞硝酸鈉暴露使精子活率明顯下降（P＜0.05）。

表2 亞硝酸鈉短期暴露后小鼠睪丸和附睪臟器系數(shù)（）

表2 亞硝酸鈉短期暴露后小鼠睪丸和附睪臟器系數(shù)（）

與正常對照組比較＊P＜0.05 ＊＊P＜0.01與本底對照組比較＃P＜0.05 △P＜0.01

組別 例數(shù) 睪丸指數(shù) 附睪指數(shù)正常對照組 10 0.598±0.093 0.174±0.013本底對照組 10 0.562±0.064 0.172±0.009低 劑 量組 10 0.549±0.058 0.159±0.010中 劑 量組 10 0.537±0.070 0.156±0.004＊＊△高 劑 量組 10 0.533±0.028 0.156±0.004＊＊△

表3 亞硝酸鈉短期暴露后對小鼠附睪精子計數(shù)和精子活動力的影響（）

表3 亞硝酸鈉短期暴露后對小鼠附睪精子計數(shù)和精子活動力的影響（）

＊與正常對照組比較P＜0.05

組別 例數(shù) 精子計數(shù)（×106／ml） 精子活率（%） a級精子占比（%） b級精子占比（%） c級精子占比（%）正常對照組 10 21.235±3.28 57.183±5.36 15.426±3.71 23.145±5.90 18.851±5.49本底對照組 10 15.464±2.43＊ 51.234±3.22 13.781±7.50 22.231±6.63 15.537±6.04低 劑 量組 10 14.281±3.10＊ 50.342±5.63 13.187±6.15 22.741±7.04 15.743±5.30中 劑 量組 10 15.036±3.71＊ 49.551±8.20＊ 14.541±6.52 19.987±6.27 15.622±5.44高 劑 量組 10 16.325±1.04＊ 48.497±6.91＊ 14.055±7.82 19.547±8.82 13.946±5.48＊

2.4 亞硝酸鈉短期暴露對小鼠睪丸組織形態(tài)的影響

正常對照組中睪丸組織結(jié)構(gòu)形態(tài)正常（圖1a）。本底對照組中，睪丸組織均無明顯不良變化，與正常對照組基本一致（圖1b）。小鼠隨著喂食亞硝酸鈉劑量的增加，細(xì)精管出現(xiàn)病理性改變，部分曲細(xì)精管上皮排列紊亂，小鼠的睪丸出現(xiàn)病理性改變逐步增多，損傷逐步加強（圖1c、d）。高劑量組小鼠受到明顯影響，30%精曲小管內(nèi)生精上皮萎縮，曲細(xì)精管中生精細(xì)胞層數(shù)減少，各級生精細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子均減少，顯示睪丸組織受到明顯損傷（圖1e）。

圖1 亞酸鈉短期暴露對小鼠睪丸組織形態(tài)的影響

3 討論

亞硝酸鹽與人們生活、生產(chǎn)密切相關(guān)，是一種重要的食品添加劑，常用于肉類等食品加工中，它在紡織品印染行業(yè)、醫(yī)藥及獸醫(yī)行業(yè)中也有很廣泛的應(yīng)用［5］。有文獻(xiàn)報道，不少地區(qū)的飲用水中亞硝酸鹽含量超標(biāo)［6－8］，加上熏制和腌制食品及快餐食品的銷售量增加，致使人體接觸亞硝酸鹽機會增加，對人類健康的影響很值得關(guān)注。大量研究資料表明，由于亞硝酸鹽的強氧化性，人攝入后可導(dǎo)致組織缺氧而造成中毒，如攝入量大還可造成急性死亡。人類一次性攝入0.2～0.5g亞硝酸鹽可引起急性中毒，3g即可致死［9］。為此我國在《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760－1996）中規(guī)定了亞硝酸鹽在肉類制品中的限量為≤30mg／kg、在肉類罐頭中的限量為≤50mg／kg［11］。

近年來，男性生育力逐步下降，主要表現(xiàn)在精子密度和精液質(zhì)量等方面［1］。原因涉及多方面，職業(yè)因素、藥物、射線及心理影響等［3］。做為常見的環(huán)境污染物之一的亞硝酸鹽廣泛存在，人體每日從多種途徑可以接觸到亞硝酸鹽，接受著長期低劑量的亞硝酸鹽刺激。

本研究中當(dāng)雄性小鼠使用本底劑量后，小鼠體重和肝臟系數(shù)即明顯增加。隨著劑量的加大，脾臟系數(shù)逐步增大，顯微鏡下觀察肝臟、脾臟增生明顯，受損嚴(yán)重。亞硝酸鈉造成肝臟損傷的主要原因與其引發(fā)組織缺氧和自由基增多密切相關(guān)［5］。

本研究中雄性小鼠接受短期低劑量的亞硝酸鈉刺激后，睪丸指數(shù)無明顯變化。而附睪指數(shù)下降，附睪萎縮明顯。睪丸形態(tài)分析結(jié)果顯示睪丸生精細(xì)胞層數(shù)減少，睪丸組織形態(tài)受損。睪丸支持細(xì)胞是睪丸組織內(nèi)重要的非生殖細(xì)胞，除了可以影響每天產(chǎn)生的精子數(shù)量［12］，在精子的發(fā)育過程中也具有重要的調(diào)節(jié)作用［11］。此外，附睪中精子數(shù)目和精子活率均有明顯的下降，生殖功能受損。附睪除了保護(hù)、運輸和貯存精子外還能分泌附睪液，其中含有激素、酶等物質(zhì)，這些物質(zhì)有助于精子的成熟。該結(jié)果提示亞硝酸鈉可能對附睪中精子的成熟或儲存過程有影響。研究中，附睪中精子數(shù)目減少，附睪指數(shù)降低，可能與睪丸產(chǎn)生的精子少有關(guān)，而這種精子的減少可能就是因為暴露于亞硝酸鈉后導(dǎo)致睪丸內(nèi)支持細(xì)胞受損的結(jié)果。這可能是亞硝酸鈉所致生殖功能損傷的一個機制。亞硝酸鹽如何導(dǎo)致支持細(xì)胞損傷，對其他生殖細(xì)胞和生殖器官有無影響，以及影響的機制還需要進(jìn)一步研究。

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