JSI-124抑制STAT3通路阻滯食管癌Eca-109細(xì)胞增殖的研究

崔　凱，朱　濤△，王　競，張　濤，李小飛

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院胸腔外科,西安 710038； 2.南京軍區(qū)總醫(yī)院腫瘤科,南京 210002)

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JSI-124抑制STAT3通路阻滯食管癌Eca-109細(xì)胞增殖的研究

崔凱1，朱濤1△，王競2※，張濤1，李小飛1

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院胸腔外科,西安 710038； 2.南京軍區(qū)總醫(yī)院腫瘤科,南京 210002)

摘要：目的采用葫蘆素(JSI-124)阻斷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)信號通路傳導(dǎo)后，觀察其對人食管癌Eca-109細(xì)胞增殖的影響。方法不同濃度的JSI-124(0、0.6、1.2、2.5、5.0 μmol/L)處理Eca-109細(xì)胞后，利用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖水平、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法檢測STAT3及下游細(xì)胞周期蛋白D1轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)、Western blot法檢測食管癌Eca-109細(xì)胞中STAT3和抗凋亡因子bcl-2的表達(dá)以及使用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡率的變化。結(jié)果在Eca-109細(xì)胞中，經(jīng)JSI-124處理的Eca-109細(xì)胞中，STAT3的活化水平明顯降低；同時隨著JSI-124抑制濃度(0、1.2、2.5、5.0μmol/L)的增加，Eca-109細(xì)胞的總凋亡率也隨之增加(3.52%、19.26%、39.89%、55.22%)(P<0.05)。結(jié)論JSI-124 作為STAT3的選擇性抑制劑，可顯著抑制食管癌Eca-109細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。

關(guān)鍵詞：食管癌；葫蘆素；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3；增殖；凋亡

轉(zhuǎn)錄因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transduction and activator of transcription，STAT)家族的重要成員STAT3是表皮生長因子受體 (epidermal growth factor receptor，EGFR)下游重要通路JAK-STAT3的關(guān)鍵點[1]。STAT3基因的異常活化可使下游抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2與增殖相關(guān)因子細(xì)胞周期蛋白D1等表達(dá)改變,進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的異常增殖和腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化[2]。葫蘆素(cucurbitacin-I，JSI-124)是STAT3的抑制劑，但對其他信號通路中如蛋白激酶B和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶等相關(guān)因子無特殊影響。它抑制STAT3酪氨酸磷酸化形成p-STAT3(第705位酪氨酸磷酸化位點)，抑制STAT3形成二聚體，阻斷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，且體內(nèi)外未有明顯毒性現(xiàn)象出現(xiàn)[3]。目前報道指出，在某些類型的癌細(xì)胞的中，JSI-124對腫瘤的生長具有良好的抑制效用[4-5]，但其在食管癌中的報道少見，提示JSI-124未來在食管癌中有較強(qiáng)的研究前景。本研究以人食管癌Eca-109細(xì)胞為研究對象，探討JSI-124抑制STAT3后對食管癌增殖水平及凋亡水平的影響，為臨床應(yīng)用提供相關(guān)實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1試劑與儀器胰蛋白酶(Gibco公司，德國)，胎牛血清(Hyclone公司，美國),CCK-8(Dojindo公司,日本)，JSI-124(Calbiochem公司，美國)；一抗總STAT3、p-STAT3(Tyr705)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GADPH)(Cell Signaling Technology公司，美國)，Bcl-2抗體(Santa Cruz公司，美國)，二抗(Jackson公司，美國)；Trizol試劑(Invitrogen公司，美國)，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒(TaKaRa公司，日本)；所有引物均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；AnnexinV-EGFP 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。JSI-124由二甲基亞砜(上海偉進(jìn)生物科技有限公司生產(chǎn))稀釋到所需工作濃度。 主要實驗儀器：紫外分光光度計(UV1800 日本島津)，PCR儀(MJ Mini PCR，美國Bio-Rad)，流式細(xì)胞儀(COULTER EPICS XL，美國Beckman Coulter)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)凍存狀態(tài)的食管癌Eca-109細(xì)胞自液氮中取出，迅速置于37 ℃水浴中，使其盡快全部融化(慢凍快融)；無菌條件下將解凍后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，以離心半徑3 cm，1000 r/min離心5 min,棄上清，加入2 mL培養(yǎng)液(含20% 胎牛血清； pH 7.2～7.4)混勻；將細(xì)胞懸液滴入培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入4 mL培養(yǎng)液，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育(含5%CO2)，2～3 d傳代1次。實驗時取用對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.3CCK-8法待細(xì)胞密度達(dá)到培養(yǎng)皿90%后制成細(xì)胞懸液,5000個/孔接種于96孔板，將粉末狀JSI-124用二甲基亞砜充分溶解，配置成1000 μmol/L濃度的母液(二甲基亞砜終濃度≤0.01%)，現(xiàn)用現(xiàn)配，分別給予JSI-124不同濃度(0、0.6、1.2、2.5、5.0 μmol/L)，每個濃度設(shè)6個復(fù)孔，同時設(shè)調(diào)零組(僅含培養(yǎng)基)繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后加入CCK-8 20 μL/孔，繼續(xù)孵育2 h，測定每孔490 nm 波長處的光密度(OD)值，實驗重復(fù)3次。細(xì)胞抑制率(%)=[1-(OD實驗組-OD調(diào)零孔)/(OD對照孔-OD調(diào)零孔)]×100%。

1.4Western blot法經(jīng)JSI-124不同濃度加入食管癌Eca-109 細(xì)胞中，用裂解液提取其總蛋白。將蛋白樣品和上樣緩沖液混合，100 ℃煮10 min；聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜，封閉2 h后加入相應(yīng)比例稀釋的一抗，置于4 ℃；過夜后Tris-HCl緩沖鹽溶液+吐溫洗膜3次；加入相應(yīng)比例稀釋的二抗，孵育1 h；Tris-HCl緩沖鹽溶液+吐溫洗膜2次，Tris-HCl緩沖鹽溶液溶液洗膜 1次后發(fā)光顯色； Quantity one 軟件進(jìn)行蛋白條帶的灰度值測定。實驗重復(fù)3次。

1.5RT-PCR法提取Eca-109細(xì)胞的總RNA，紫外分光光度計測定總RNA在260 和280 nm處的吸光值，計算核酸濃度，將提出的總RNA溶于DEPC水。根據(jù)TaKaRa RT-PCR試劑盒說明書對STAT3上游5′-ATA GCC GCT TCC TGC AAG AG-3′，下游5′-CGT CCG TGA GAG TTT TCT GC-3′；細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)上游5′-GAG ACC ATC CCC CTG ACG GC-3′，下游5′-CTC TTC CTC CTC CTC GGC GGC-3′進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，以GADPH上游5′-CCTTCATTGACCTCAACTA-3′，下游5′- GGAAGGCCATGCCAGTGAGC-3′為內(nèi)參。于2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行PCR產(chǎn)物的電泳鑒定。實驗重復(fù)3次。

1.6流式細(xì)胞儀法收集處于對數(shù)生長期的Eca-109細(xì)胞經(jīng)JSI-124不同濃度處理，培養(yǎng)24 h 后細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%收集細(xì)胞，磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞1次，去離子水按1∶4比例稀釋Buffer濃縮結(jié)合緩沖液，以離心半徑3 cm，2000 r/min 離心5 min后磷酸緩沖液再次洗滌，取1×109/L 細(xì)胞待檢。用250 μL結(jié)合緩沖液再次懸浮，從中取出195 μL 的懸液加入5 μL 經(jīng)異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白(Annexin V-FITC)，混勻后間隔3 min，再加入10 μL碘化丙錠溶液，混勻后室溫避光10 min，再加入300 μL稀釋過的結(jié)合緩沖液沖懸細(xì)胞，上機(jī)檢測，實驗重復(fù)3次。

2結(jié)果

2.1JSI-124抑制食管癌Eca-109細(xì)胞的生長增殖同一時間經(jīng)不同濃度JSI-124(0.6、1.2、2.5、5.0 μmol/L)處理Eca-109 細(xì)胞后，JSI-124對細(xì)胞的生長抑制率逐漸加大，而相應(yīng)濃度下，二甲基亞砜對細(xì)胞的生長無明顯效用。同一濃度的JSI-124處理Eca-109細(xì)胞48、72 h后，JSI-124對食管癌細(xì)胞的抑制水平也逐漸升高(P<0.05)。

表1JSI-124處理Eca-109細(xì)胞24、48、72 h后對

Eca-109細(xì)胞的抑制率

JSI-124濃度24h48h72h0μmol/L0.000.000.000.6μmol/L0.24±0.03a0.32±0.02ae0.51±0.02aef1.2μmol/L0.42±0.02ab0.53±0.03abe0.78±0.02abef2.5μmol/L0.57±0.02abc0.61±0.02abce0.81±0.02abcef5.0μmol/L0.63±0.01abcd0.71±0.01abcde0.96±0.01abcdef

a與0 μmol/L比較，P<0.05;b與0.6 μmol/L比較，P<0.5；c與1.2 μmol/L比較，P<0.05；d與2.5 μmol/L比較，P<0.05；e與24 h比較，P<0.05；f與48 h比較，P<0.05

2.2不同濃度JSI-124對Eca-109細(xì)胞STAT3 信使RNA水平表達(dá)的影響 以不同濃度的JSI-124處理Eca-109細(xì)胞48 h后，Eca-109細(xì)胞中STAT3 的信使RNA水平逐漸減少(F=13.650,P<0.05)(圖1)。

圖1JSI-124作用于Eca-109細(xì)胞后，STAT3在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)a與0 μmol/L JSI-124比較，P<0.05;STAT：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子；GADPH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

2.3JSI-124抑制Eca-109細(xì)胞STAT3及其相關(guān)蛋白的表達(dá)經(jīng)不同濃度JSI-124處理細(xì)胞24 h后，p-STAT3(Tyr705)的蛋白表達(dá)水平隨著抑制濃度的增加而逐漸減少，總STAT3蛋白表達(dá)不變，同時，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平隨著p-STAT3 蛋白水平的減少而下降(F=12.460,P<0.05)(圖2)。

2.4JSI-124提高食管癌Eca-109細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率以不同濃度的JSI-124處理Eca-109細(xì)胞24 h，結(jié)果顯示，JSI-124濃度的增加，Eca-109細(xì)胞的凋亡水平也不斷升高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。1.2 μmol/L、2.5 μmol/L、5.0 μmol/L JSI-124作用于Eca-109細(xì)胞的早期凋亡率、晚期凋亡率、總凋亡率均顯著高于0 μmol/L，5.0 μmol/L JSI-124作用于Eca-109細(xì)胞的早期凋亡率、晚期凋亡率、總凋亡率均顯著高于1.2 μmol/L、2.5 μmol/L，2.5 μmol/L總凋亡率均顯著高于1.2 μmol/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

圖2STAT3在JSI-124作用下翻譯水平的表達(dá)a與0 μmol/L JSI-124比較，P<0.05;STAT：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子；GADPH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

圖3流式細(xì)胞儀檢測不同濃度的JSI-124作用于Eca-109細(xì)胞后細(xì)胞的凋亡水平變化3a:0 μmol JSI-124；3b:1.2 μmol JSI-124；3c:2.5 μmol JSI-124； 3d:5 μmol JSI-124

表2JSI-124作用于Eca-109細(xì)胞24 h后的凋亡率

JSI-124濃度早期凋亡率晚期凋亡率總凋亡率0μmol/L3.00±0.300.52±0.123.52±0.351.2μmol/L16.52±0.92a2.74±0.9419.26±1.14a2.5μmol/L34.11±2.71a5.78±1.88a39.89±2.76ab5.0μmol/L48.55±4.15abc6.67±1.47ab55.22±4.33abcF22.03021.24922.078P0.0000.0010.000

a與0 μmol/L比較，P<0.05;b與1.2 μmol/L比較，P<0.05；c與 2.5 μmol/L比較，P<0.05

3討論

食管癌在我國是最常見的惡性腫瘤類型之一，現(xiàn)有對食管癌的治療手段中，外科及放射治療仍然是最重要的治療方式，但是食管癌的早期診斷率低下，且其易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)，因此食管癌患者在經(jīng)過外科及放射治療后多數(shù)存在預(yù)后不良，5年生存率也不令人滿意。因此，對于食管癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究很關(guān)鍵。近年來，基于對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的深入研究，人們認(rèn)識到食管癌的發(fā)生是眾多致癌因子的激活和抑癌因子失活的共同作用，某些關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子可以通過相應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而控制其下游多個基因的表達(dá)，影響腫瘤的生物學(xué)特性。這些轉(zhuǎn)錄因子就是影響相關(guān)基因表達(dá)的關(guān)鍵[6]，換言之，針對這些關(guān)鍵因子進(jìn)行各種干預(yù)，降低它們的表達(dá)水平，能級聯(lián)式影響其他相關(guān)基因的表達(dá)，抑制癌細(xì)胞生長、侵襲、轉(zhuǎn)移和促進(jìn)凋亡[7]。

STAT3在惡性腫瘤細(xì)胞中持續(xù)活化。有研究指出，STAT3的持續(xù)激活可能上調(diào)相關(guān)抗凋亡因子和細(xì)胞增殖相關(guān)因子的表達(dá)，可以刺激細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤組織血管生成，并參與腫瘤免疫逃逸[8]。另有研究發(fā)現(xiàn)，STAT3活化水平在肺癌細(xì)胞中明顯升高[9]，并且抑制STAT3活化后可提高胃癌[10]、卵巢癌[11]、惡性黑色素瘤[12]及白血病[13]細(xì)胞等腫瘤對藥物的化療敏感性。

本研究采用JSI-124選擇性阻斷食管癌Eca-109細(xì)胞中的STAT3通路，以探知其對人食管癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。研究結(jié)果表明，JSI-124對Eca-109細(xì)胞增殖的影響與時間和劑量呈正比，且濃度一致的情況下，隨著藥物處理時間的延長，JSI-124對食管癌細(xì)胞的抑制率也呈不斷上升的趨勢。而選取不同濃度JSI-124 (0、0.6、1.2、2.5、5.0 μmol/L)分別作用于食管癌Eca-109細(xì)胞后，STAT3及下游的信號因子在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均與對照組有不同程度的影響，這與在乳腺癌[14]、鼻咽癌[15]、神經(jīng)母細(xì)胞瘤[16]及黑色素瘤細(xì)胞[17]中的研究結(jié)果相一致，提示抑制STAT3的活化能夠明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。本研究采用流式細(xì)胞儀法將不同濃度的JSI-124 處理Eca-109細(xì)胞后對細(xì)胞的凋亡水平進(jìn)行檢測，結(jié)果隨JSI-124 抑制濃度的增加，Eca-109細(xì)胞的早期凋亡水平和總凋亡水平均有所升高(P<0.05)，因此認(rèn)為，JSI-124能劑量依賴性的誘導(dǎo)人食管癌Eca-109細(xì)胞的凋亡，結(jié)合前部分實驗，可以證明JSI-124能特異性抑制STAT3因子，為臨床上針對食管癌靶向治療的研究提供可行性。

綜上所述，食管癌細(xì)胞中STAT3蛋白的表達(dá)是腫瘤治療的分子靶點，其抑制劑JSI-124可明顯抑制人食管癌Eca-109細(xì)胞的增殖，并且誘導(dǎo)其細(xì)胞的凋亡，提示STAT3抑制劑或可考慮作為食管癌患者的生物靶向治療手段,為JSI-124等STAT3抑制劑應(yīng)用于食管癌的基因治療提供了實驗研究基礎(chǔ)，可成為食管癌靶向治療的新策略。

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兼癥醫(yī)學(xué)

兼癥醫(yī)學(xué)是臨床醫(yī)學(xué)在應(yīng)用診斷、治療、預(yù)防的一種方法學(xué)。這方法學(xué)強(qiáng)調(diào)了“統(tǒng)一同一時體論”在醫(yī)療、教學(xué)、科研實踐上的重要性。統(tǒng)一性強(qiáng)調(diào)了共性(整體性)，同一時性明確了個性(差異性)。人是由系統(tǒng)、器官、組織、細(xì)胞、分子組成的自身整體的個體，也是宇宙間的獨立體，但是必須統(tǒng)一于宇宙。

兼癥醫(yī)學(xué)是講在疾病的個體，在空間里時間內(nèi)是怎樣發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸的。

疾病一旦發(fā)生在人類群體或個體時，同種疾病盡管有共同臨床表現(xiàn)，但也可有千奇百怪的現(xiàn)象發(fā)生?！敖y(tǒng)一同一時體論”可以完美解釋。

兼癥醫(yī)學(xué)在臨床上應(yīng)用最多的是對發(fā)病機(jī)制、診斷、治療進(jìn)行探討，其中又重點講述原發(fā)病、合并病、繼發(fā)病、并發(fā)癥、同源病、后遺癥和綜合征等在臨床實踐中的應(yīng)用。

———劉桂蕊

Study on JSI-124 Inhibition on the STAT3 Pathway to Block the Proliferation of Eca-109 Cells of Esophageal CanceCUIKai1，ZHUTao1，WANGJing2，ZHANGTao1,LIXiao-fei1.(1.DepartmentofThoracicSurgery,TangduHospital,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an,710038,China; 2.DepartmentofOncology,theGeneralHospitalofNanjingMilitaryRegion,Nanjing210002,China)

Abstract：ObjectiveTo explore the effect of inhibition of signal transduction and activator of transcription 3 (STAT3) with JSI-124 on the proliferation of Eca-109 cells of esophageal cancer.MethodsAfter treatment with JSI-1244(0,0.6,1.2,2.5,5.0 μmol/L),CCK-8 assay was used to detect the inhibitory rate of Eca-109 cells,STAT3 and p-STAT3 protein levels were tested by Western blot and the levels of STAT3 mRNA were tested by reverse transcription-polymerase chain reaction in Eca-109 cells. The flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of Eca-109 cells.ResultsSTAT3 activation level was obviously decreased in the JSI-124 treated Eca-109 cells. Along with the increase of the concentration level of JSI-1244(0,1.2,2.5,5.0 μmol/L),the cell apoptosis rate increased as well(3.52%,19.26%,39.89%,55.22%) (P<0.05).ConclusionJSI-124,as a STAT selective inhibitor,inhibits the cell proliferation and enhances the apoptosis rate of Eca-109 cells.

Key words：Esophageal cancer; Cucurbitacin; Signal transduction and activator of transcription 3; Proliferation; Apoptosis

收稿日期：2014-10-20修回日期：2015-08-25編輯：相丹峰

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.20.046

中圖分類號：R730.23

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)20-3772-04