茜草素抗結(jié)核分枝桿菌作用的實(shí)驗(yàn)研究

蔡智群 蔡杏珊 鄧 紅

(1廣州市胸科醫(yī)院 內(nèi)科，廣東 廣州 510095； 2廣州市天河區(qū)五山街社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，廣東 廣州 510640)

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·臨床實(shí)踐·

茜草素抗結(jié)核分枝桿菌作用的實(shí)驗(yàn)研究

蔡智群1蔡杏珊1鄧 紅2

(1廣州市胸科醫(yī)院 內(nèi)科，廣東 廣州 510095；2廣州市天河區(qū)五山街社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，廣東 廣州 510640)

目的:研究茜草素對結(jié)核分枝桿菌(Mycobaeterium tuberculosis, MTB)抑菌作用，為進(jìn)一步開發(fā)中藥新藥奠定基礎(chǔ)。方法：用敏感或耐一種或以上結(jié)核藥的結(jié)核菌株，用對倍稀釋法制備成不同濃度的含茜草素的藥物培養(yǎng)基, 最終測定藥物的最低抑菌濃度(MIC)及最低殺菌濃度(MBC)。結(jié)果：茜草素對全敏菌株的MIC是160 μg/mL, MBC是320 μg/mL, 對耐藥菌株的MIC是160或320 μg/mL，MBC是320或640 μg/mL。結(jié)論：茜草素對結(jié)核分枝桿菌有一定的抑菌活性，其中對全敏菌株可能有更好的抑菌效果。

茜草素；結(jié)核分枝桿菌；抑菌活性

我國肺結(jié)核的發(fā)病率位居世界第二位，據(jù)第四次全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果估計(jì), 我國約有5.5億人感染結(jié)核分枝桿菌, 在我國由于治療不當(dāng)或經(jīng)濟(jì)困難, 引起的耐藥病人高達(dá)27.8%, 自20世紀(jì)80年代來結(jié)核病疫情重新上升, 成為近年來最為重要的傳染病之一, 耐藥菌株流行是結(jié)核疫情日趨嚴(yán)重的主要原因。耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB)和廣泛耐藥結(jié)核病(extensivelydrug-resistant tuberculosis, XDR-TB)的出現(xiàn), 掀起了結(jié)核病第3次世界流行高峰[1], 對全球公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。研究新的抗結(jié)核藥刻不容緩。中藥博大精深，很多中藥有抗菌抑菌的作用。近年來，研究中藥的抗結(jié)核菌作用成為熱點(diǎn)。本文通過研究中藥茜草的乙醇提取物-1,2-二羥基蒽醌(茜草素)對結(jié)核菌的作用，旨在為研究新的抗結(jié)核中藥提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本的采集

結(jié)核桿菌試驗(yàn)菌株:來自2014年1月-2015年1月期間, 廣州市胸科醫(yī)院結(jié)核化驗(yàn)室臨床藥敏試驗(yàn)菌株。

1.2 試劑

茜草素：為合肥博美生物科技有限公司提供的含量為98%的茜草素(批號：01508538)。改良羅氏培養(yǎng)基：按《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》配制改良羅氏培養(yǎng)基[2]。

1.3 方法

挑選痰涂片抗酸染色陽性的臨床標(biāo)本, 經(jīng)4周初分離培養(yǎng)得到菌種鑒定為結(jié)核桿菌的菌株, 并對此菌株進(jìn)一步做臨床常規(guī)抗結(jié)核藥物藥敏試驗(yàn), 得到全敏感或耐藥(耐一種或以上一線結(jié)核藥：異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素、吡嗪酰胺、阿米卡星、左氧氟沙星、莫西沙星)臨床菌株。對倍稀釋法制備成不同濃度的含茜草素的藥物培養(yǎng)基, 藥物終濃度以預(yù)試驗(yàn)MIC確定中心濃度, 向兩側(cè)以對倍稀釋法遞增或遞減。

用分析天平準(zhǔn)確稱取茜草素40 mg，加入吐溫(促溶劑)80，溶解于1 mL蒸餾水中，至藥物終濃度為 40 mg/mL。滅菌試驗(yàn)，驗(yàn)證無菌后再行稀釋，加入未凝固的改良羅氏培養(yǎng)基內(nèi)，使其在培養(yǎng)基中的濃度為40 μg/mL、80 μg/mL、160 μg/mL、320 μg/mL、640 μg/mL。每個(gè)濃度的含藥培養(yǎng)基均制10管。將敏感及耐藥的結(jié)核桿菌懸液稀釋成 103mg/mL，在每個(gè)含茜草素 MGIT 培養(yǎng)管中接種 103mg/mL 菌懸液 0.1 mL同時(shí)接種不含藥的空白管，設(shè)立H37RV(ATCC2794)標(biāo)準(zhǔn)菌株為陽性對照管，最終測定其MIC及MBC。

1.4 MIC及MBC判斷標(biāo)準(zhǔn)

空白對照管培養(yǎng)基結(jié)核分枝桿菌正常生長, 以肉眼觀察, 含藥試驗(yàn)管以培養(yǎng)陰性的最低藥物濃度作為此受試菌的茜草素單藥MIC。MBC是指在體外試驗(yàn)中，抗菌藥物能使活菌生長減少99%以上的最小濃度。采用MIC試驗(yàn)的培養(yǎng)基，同樣的方法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)測定最小殺菌濃度，即先測出MIC，再依次將未見細(xì)菌生長的各管培養(yǎng)物分別吸取0.1 mL傾倒于改良羅氏培養(yǎng)基中，在37 ℃溫箱中再孵育。

2 結(jié) 果

茜草素對全敏菌株的MIC是160 μg/mL, MBC是320 μg/mL, 對耐藥菌株的MIC是160或320 μg/mL，MBC是320或640 μg/mL，見表1。

表1 茜草素在敏感結(jié)核菌株及耐一種或多種結(jié)核藥結(jié)核菌株的MIC及MBC值

注：異煙肼(INH)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)、鏈霉素(SM)、吡嗪酰胺(PZA)、阿米卡星(AMK)、左氧氟沙星(LOF)莫西沙星(MOX)；R即藥敏結(jié)果為耐藥，S藥敏結(jié)果為敏感，/表示該藥物無藥敏結(jié)果

3 討 論

結(jié)核病，尤其是耐藥結(jié)核的蔓延是世界上主要公共健康問題之一。世界衛(wèi)生組織認(rèn)定的27個(gè)耐多藥/廣泛耐藥結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家中, 我國已高居榜首[1]。Yang等[3]對1993-2011期間出版的95篇符合標(biāo)準(zhǔn)的文章進(jìn)行薈萃分析顯示,我國初治患者中結(jié)核耐藥率為27.9% (95% CI, 25.6%-30.2%),復(fù)治患者結(jié)核耐藥率為 60.3% (95% CI, 56.2%-64.2%)。目前, 我國每年估計(jì)有耐多藥肺結(jié)核和廣泛耐藥肺結(jié)核新發(fā)患者12萬和1萬例。 因此, 我國耐藥結(jié)核病的形勢非常嚴(yán)峻。

茜草始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，1995年版藥典記載：茜草為茜草科植物茜草(Rubia Cordifolia L.)的干燥根及根莖，又名活血草、拉拉藤、地血、血見愁、過山龍、活血丹等。主產(chǎn)于陜西渭南、河南嵩縣、安徽、河北邢臺、山東等地。春秋二季采挖，除去泥沙，干燥。味苦，性寒，歸肝心經(jīng)，具有涼血止血，行血祛瘀，止咳祛痰通經(jīng)之功效。用于吐血，衄血，崩漏下血，外傷出血，經(jīng)閉瘀阻，關(guān)節(jié)痹痛，跌打腫痛等。茜草屬植物的化學(xué)成分以蒽醌及其甙類化合物為主，此外還有萘醌類、萜類、己肽類、多糖類等。19世紀(jì)以來，國內(nèi)外學(xué)者就開始對茜草的化學(xué)成分、藥理作用進(jìn)行了大量的研究。特別是日本學(xué)者系川秀治從茜草中分離出高效低毒的抗癌成分及具有顯著升白作用的茜草雙脂人工合成后，更引起了人們對茜草的深入研究。中國茜草梗部所含化學(xué)成分主要為蒽醌苷類化合物。本研究發(fā)現(xiàn)茜草素濃度為320 μg/mL，對MTB作用明顯，在全敏菌株的MIC值為160 μg/mL，MBC值為320 μg/mL，與宋文剛等報(bào)道：發(fā)現(xiàn)其濃度為400 μg/mL即可明顯抑制MTB生長[4]。均可證明茜草素能明顯抑制MTB有效。本研究還發(fā)現(xiàn)茜草素對耐藥結(jié)核桿菌有效，甚至對MDR-TB同樣有效，在MDR-TB菌株中，測出茜草素的MIC為320 μg/mL，MBC為640 μg/mL。

我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥自 2000 多年前即有關(guān)于抗結(jié)核治療的記載。近年來，國內(nèi)研究者除采用傳統(tǒng)方法，即中藥對結(jié)核病的治療作用進(jìn)行臨床研究外，還進(jìn)行了中藥對MTB的體外抑菌作用，中藥對MTB感染免疫力影響等方面的研究，有的甚至已深入到分子和基因水平，本文探討茜草素對MTB的作用，記錄其對不同藥敏結(jié)果的MTB的MIC值及MBC值。旨在了解茜草素治療結(jié)核病進(jìn)程中的重要性。對于進(jìn)一步深入研究茜草素抗MTB的機(jī)制，了解藥物作用的最終靶標(biāo)和具體起作用的成分，對新的藥物靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)和新藥開發(fā)都具有非常重要的意義。

[1] 肖和平.中國耐藥結(jié)核病的流行現(xiàn)狀與治療對策[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2010, 33(7):481-82.

[2] 中國防癆協(xié)會基礎(chǔ)專業(yè)委員會．結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程[M].北京：中國教育文化出版社，2006：30．

[3] Yang Y,Li X,Zhou F,et al.Prevalence of drug-resistant tuberculosis in mainland China:systematic review and meta-analysis Dlos One,2011,6(6):e20343.

[4] 宋文剛.茜草素抗結(jié)核分支桿菌作用機(jī)制的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D].吉林大學(xué)博士學(xué)位論文，2007.

(本文編輯:張輝)

·醫(yī)學(xué)新聞·

卒中幸存者配偶長期生活質(zhì)量下降

據(jù)中國醫(yī)學(xué)論壇報(bào)報(bào)道，瑞典一項(xiàng)研究顯示，卒中幸存者配偶健康相關(guān)生活質(zhì)量下降不僅發(fā)生于卒中后1年，而是長期存在。論文8月20日在線發(fā)表于《卒中》(Stroke)雜志。

研究者利用SAHLSIS研究中7年的隨訪數(shù)據(jù)，共納入248對卒中幸存者夫婦(中位數(shù)64歲)和245對對照夫婦(中位數(shù)65歲)，采用健康狀況問卷(SF-36)評估配偶健康相關(guān)生活質(zhì)量，并通過美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表、簡易精神狀態(tài)評價(jià)量表、醫(yī)院焦慮抑郁量表、巴塞爾指數(shù)以及改良蘭金量表評價(jià)卒中幸存者狀況。

結(jié)果為，與對照組配偶相比，卒中幸存者配偶的量表精神領(lǐng)域評分(P<0.001)、總體健康狀況評分(P=0.013)以及軀體健康評分(P=0.006)均較低。配偶軀體健康狀況較差的預(yù)測因素為自身年齡和卒中幸存者總體殘疾水平;配偶精神健康較差的預(yù)測因素為抑郁癥狀、認(rèn)知損害及卒中幸存者總體殘疾水平。

An experimental study on actions of Alizarin against Mycobacterium tuberculosis

CaiZhiqun1,CaiXingshan1,DengHong2

(1DepartmentofInternalMedicine,GuangzhouChestHospital,Guangzhou510095,China;2WushanCommunityHealthCenterofTianheDistrict,Guangzhou510640,China)

Objective:To determine the inhibitory effect of Alizarin against Mycobaeterium tuberculosis (MTB), so as to lay down a basis for development of Chinese herbal medicine.Methods:MTB strains which was sensitive or resistant to one or more anti-TB drugs were cultured on medium containing double-diluted concentration of Alizarin. Then we determined the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of Alizarin.Results: For all-sensitive strains, the alizarin MIC was 160 μg/mL and MBC was 320μg/mL. For resistant strains, the alizarin MIC was 160 or 320 μg/mL, and MBC was 320 or 640 μg/mL.Conclusion:Alizarin exhibits antibacterial effect against Mycobacterium tuberculosis, which is particularly evident for all sensitive strains.

Alizarin; Mycobacterium tuberculosis; antibacterial activity

10.3969/j.issn.2095-9664.2015.05.018

廣東省中醫(yī)藥局項(xiàng)目(20142120)

蔡智群(1974-)，女，副主任醫(yī)師，本科。

R285.5

2095-9664(2015)05-0071-03

2014-11-25)

研究方向：結(jié)核病的防治。