• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    小鼠急性心肌梗死后IL-1β和IL-6的動態(tài)變化及3甲基腺嘌呤的影響

    2015-03-08 02:09:52陳法江何麗姍李康蘭羅健東
    廣州醫(yī)科大學學報 2015年5期
    關(guān)鍵詞:腺嘌呤前列腺癌甲基

    陳法江 何麗姍 李康蘭 楊 婭 羅健東

    ( 廣州醫(yī)科大學藥理教研室, 廣東 廣州 510182)

    ?

    ·論著·

    小鼠急性心肌梗死后IL-1β和IL-6的動態(tài)變化及3甲基腺嘌呤的影響

    陳法江 何麗姍 李康蘭 楊 婭 羅健東*

    ( 廣州醫(yī)科大學藥理教研室, 廣東 廣州 510182)

    目的:探討小鼠急性心肌梗死(AMI)后炎癥因子IL-1β和IL-6的動態(tài)變化及3-甲基腺嘌呤對心肌炎癥因子IL-1β和IL-6釋放的影響。方法:雄性C57BL/6小鼠隨機分成四組:假手術(shù)組、AMI 1 d組、AMI 7 d組、AMI 21 d組,用超聲心動儀檢測心功能變化,用熒光定量PCR法、ELISA法和免疫組化法測量血清和心肌組織中炎癥因子IL-1β和IL-6的變化,用免疫蛋白印跡方法檢測心肌組織IL-1β轉(zhuǎn)換酶caspase-1蛋白的變化情況。在AMI 后給予3-甲基腺嘌呤7 d,用超聲心動儀檢測心功能變,用ELISA法和免疫組化法測量心肌組織中炎癥因子IL-1β和IL-6的變化情況。結(jié)果:小鼠冠狀動脈左前降支結(jié)扎術(shù)后7、21 d心功能顯著下降。小鼠AMI 后炎癥因子IL-1β和IL-6的mRNA水平表達增加,在血清和心肌組織中蛋白含量增加(P<0.05)。小鼠AMI 后心肌中caspase-1蛋白表達增加(P<0.05)。3-甲基腺嘌呤加重小鼠AMI 7 d后心臟功能下降(P<0.05),并促進炎癥因子IL-1β和IL-6的釋放(P<0.05)。結(jié)論:小鼠心肌損傷過程中炎癥因子IL-1β和IL-6表達增加,其機制可能跟AMI 后caspase-1的增加有關(guān);3-甲基腺嘌呤加重AMI 后心功能的下降,其機制可能與促進炎癥因子釋放有關(guān)。

    急性心肌梗死;3-甲基腺嘌呤;炎癥因子;白介素-1;白介素-6;半胱氨酸天冬氨酸酶-1

    冠心病已成為人類死亡的首要原因,急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是冠心病中的急危重癥。目前臨床廣泛的救治手段是在治療窗內(nèi)對閉塞的冠狀動脈進行血運重建,如經(jīng)皮冠狀動脈介入治療和冠狀動脈搭橋術(shù),但是缺血造成心肌細胞炎癥等損傷導致心臟功能下降仍然是AMI臨床治療的重要障礙[1]。各種誘因?qū)е碌难ㄐ纬勺钄喙诿}血流引發(fā)AMI后異常激活炎癥反應(yīng)系統(tǒng),致IL-1β、IL-6等促炎因子分泌增多,共同參與心肌細胞肥大、心肌纖維化等病理過程,成為導致心肌進行性重構(gòu)、心功能惡化的重要原因[2]。半胱氨酸天冬氨酸酶 (caspase)-1是caspase超家族的重要成員,能夠?qū)L-1β前體切割為具有活性的IL-1β,活性的IL-1β可激活下游NF-κB信號通路,促進IL-6等炎癥因子的釋放[3],被認為與機體的炎癥反應(yīng)和細胞凋亡有關(guān)。鑒于炎癥因子在AMI病程中扮演重要角色,本研究旨在觀察小鼠AMI后促炎因子的動態(tài)變化以及可能的相關(guān)機制,為臨床進一步認識AMI的病理生理過程提供依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 實驗動物

    雄性清潔級C57BL/6小鼠68只,體質(zhì)量 24~26 g,由廣東省動物實驗中心提供,許可證:SCXK 粵 2008-0002。

    1.2 主要試劑

    3-甲基腺嘌呤購自美國Sigma公司。BCA蛋白定量試劑盒購自美國Pierce。蛋白電泳分子量(10~170kDa) 標記購自加拿大Fermentas。IL-1β抗體、IL-6抗體、caspase-1 抗體、GAPDH抗體、抗兔Ⅱ抗購自美國Santa Cruz。ELISA試劑盒購自深圳欣博盛。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara。SYBR?Green Ⅰ熒光定量試劑購自Roche。引物合成購自美國Invitrogen。其余試劑均為分析純產(chǎn)品。所用引物由美國Invitrogen公司根據(jù)設(shè)計合成,見表1。

    表1 熒光定量PCR所用的引物

    1.3 研究方法

    1.3.1 分組 將小鼠隨機分成5組:假手術(shù)組(AMI 0d,n=10):小鼠冠狀動脈左前降支(LAD)只穿線不結(jié)扎;AMI 1d組(n=16):小鼠LAD進行結(jié)扎;AMI 7d組(n=16):小鼠LAD進行結(jié)扎;AMI 21d組(n=16):小鼠LAD進行結(jié)扎;AMI 7d+3-甲基腺嘌呤組(AMI 7d+3MA組,n=9):小鼠LAD進行結(jié)扎后,給予3-甲基腺嘌呤[15 mg/(kg·d)]。

    1.3.2 小鼠AMI模型的建立[4]連接心電圖,氣管插管,連接小動物呼吸機,正壓通氣,頻率為 150次/min,呼吸氣時比為5∶4,潮氣量約 1.5 mL/kg。于左胸第3~4肋間開胸,暴露心臟。在左心耳與肺動脈圓錐間,以左冠狀動脈主干為標志,用8~0號縫線針穿刺結(jié)扎LAD。觀察心電圖,以心電圖Ⅱ?qū)?lián)出現(xiàn) ST 段抬高及肉眼觀察結(jié)扎區(qū)域以下組織變白等心肌缺血表現(xiàn)確定為結(jié)扎成功的指標;結(jié)扎確實后,膨肺,逐層關(guān)胸。

    1.3.3 超聲測量心功能 實驗結(jié)束進行M型超聲心動圖檢測。采用加拿大Visual Sonics產(chǎn)的Vevo2100高分辨小動物超聲成像系統(tǒng)(RMV707B 探頭,頻率設(shè)置為23MHz或30 MHz,探測深度為10~15 mm)和連接高頻探頭西門子超聲儀。2%異氟烷吸入麻醉,仰臥位固定,左胸前化學脫毛膏脫毛,在胸廓表面涂抹超聲波導聲劑,探頭置于小鼠胸骨前,獲取胸骨旁長軸、短軸視野。左室短軸切面,于乳頭肌水平應(yīng)用M型超聲記錄左心室運動曲線,測量左室舒張末期和收縮末期內(nèi)徑 (left ventricular internal dimension,diastolic;left ventricular internal dimension,systolic; LVIDd和LVIDs),左室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction, LVEF)、左室短軸縮短率(fractional shortening, FS)。

    1.3.4 熒光定量PCR法檢測IL-1β、IL-6 mRNA的表達 根據(jù)Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,樣本按以下反應(yīng)體系進行:總體積25 μL,其中SYBR?GreenⅠ12.5 μL,上游引物 F 0.5 μL,下游引物R 0.5 μL,ddH2O 10.5 μL,母版DNA1 μL。反應(yīng)條件為,95 ℃ 10min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40個循環(huán)。

    1.3.5 細胞因子的測定方法 用酶聯(lián)免疫方法測定心肌組織和血清IL-1β、IL-6水平。步驟如下:①除空白孔外,分別將標本或不同濃度標準品(100 μL/孔) 加入相應(yīng)孔中,用封板膠封住反應(yīng)孔,36℃孵箱孵育90 min,洗板; ② 除空白孔外,加入生物素抗體工作液(100 μL /孔) 封住板孔,36℃孵箱孵育60 min,洗板; ③加入酶結(jié)合物工作液(100 μL /孔) 封住板孔,36℃孵箱孵育30 min,洗板;④加入顯色劑(100 μL /孔),36℃避光顯色15 min;⑤加入終止液(100 μL /孔),混勻即刻測量A450 值; ⑥在手工繪制的標準曲線上測出標本的濃度。

    1.3.6 免疫組織化學 用免疫組織化學方法測定心肌IL-1β、IL-6水平。標本常規(guī)固定、 石蠟包埋后切片,免疫組織化學染色,光學顯微鏡下觀察心肌IL-1β、IL-6的表達。

    1.4 統(tǒng)計學分析

    2 結(jié) 果

    2.1 小鼠AMI7、21d后心臟功能下降

    本實驗共準備68只雄性C57BL/6小鼠進行AMI手術(shù)。根據(jù)小鼠LAD結(jié)扎前后心臟結(jié)扎區(qū)域心肌顏色的變化情況和心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST段是否抬高來判斷手術(shù)是否成功??傮w造模成功57只小鼠,成功率為83.82%。小鼠行LAD結(jié)扎1、7和21d后分別進行超聲心功能檢測,結(jié)果顯示AMI7、21d后小鼠心功能下降(P<0.05),見圖1。

    2.2 小鼠AMI1、7和21d后心肌IL-1β和IL-6mRNA表達增加

    實驗結(jié)束后迅速取AMI周邊區(qū)于提取RNA進行熒光定量PCR實驗,結(jié)果顯示AMI1、7和21d后小鼠心臟組織IL-1βmRNA表達增加,而IL-6mRNA表達在AMI1d達到峰值,隨后下降,但與正常組相比仍具有統(tǒng)計學差異(P<0.05),見圖2。

    注:A:M-模式圖典型代表團;B:左心室收縮末內(nèi)徑、左心室舒張末內(nèi)徑、射血分數(shù)和短軸縮短率的統(tǒng)計分析;與假手術(shù)組比較,*P<0.05

    圖1 小鼠AMI后心臟功能變化情況

    注:與假手術(shù)組比較,*P<0.05

    圖2 小鼠AMI后心肌IL-1β和IL-6的mRNA水平

    2.3 小鼠AMI 1、7 d后心肌和血清中IL-1β和IL-6表達增加

    實驗結(jié)束后麻醉小鼠行主動脈取血并迅速取AMI周邊區(qū)進行ELISA法實驗,結(jié)果顯示AMI 1、7d后小鼠心臟組織和血清中IL-1β和IL-6表達增加(P<0.05),見圖3。

    2.4 小鼠AMI 1、7和21 d后心肌IL-1β和IL-6 免疫組化結(jié)果

    實驗結(jié)束后迅速取心臟固定于4%多聚甲醛,石蠟包埋切片后進行免疫組化法檢測,結(jié)果顯示AMI 1、7、21 d后小鼠心臟組織IL-1β和IL-6表達增加。見圖4

    注:與假手術(shù)組比較,*P<0.05

    圖3 小鼠AMI后心肌和血清IL-1β和IL-6的含量

    圖4 小鼠AMI后心肌IL-1β和IL-6的表達變化情況(×400)

    2.5 小鼠AMI 1、7和21 d后心肌caspase-1蛋白表達增加

    實驗結(jié)束后迅速取AMI周邊區(qū)提取蛋白進行蛋白印跡法實驗,結(jié)果顯示AMI 1、7 d后小鼠心臟組織活化的caspase-1蛋白表達增加(P<0.05),見圖5。2.6 小鼠AMI后給予3-甲基腺嘌呤后心功能下降,心肌細胞IL-1β和IL-6的表達增加

    C57BL/6小鼠進行AMI手術(shù)后即腹腔注射3-甲基腺嘌呤[15 mg/(kg·d)],給藥7 d后進行進行超聲心功能檢測, 結(jié)果顯示,與AMI 7d組相比,給予3-甲基腺嘌呤7 d后小鼠心功能下降,LVIDs增加,EF、FS下降(P<0.05),心肌細胞IL-1β和IL-6的表達增加(P<0.05),見圖6,7。

    注:與假手術(shù)組比較,*P<0.05

    圖5 小鼠AMI后心肌活化的caspase-1蛋白的表達情況

    注:與假手術(shù)組比較,*P<0.05

    圖6 小鼠AMI并注射3-甲基腺嘌呤7 d后心臟功能變化情況

    注:與AMI 7 d組比較,*P<0.05

    圖7 3-甲基腺嘌呤促進小鼠AMI 7 d后心肌IL-1β和IL-6的表達

    3 討 論

    心肌缺血是威脅人類健康的常見心血管疾病。明確AMI的發(fā)病機制對于臨床治療具有重要的現(xiàn)實意義[5-6]。AMI的基本病因是冠狀動脈粥樣硬化斑塊的破裂、出血和血栓的形成,造成管腔嚴重狹窄或閉塞引起心肌血供不足或中斷[7-8]。本研究發(fā)現(xiàn)隨著小鼠LAD結(jié)扎時間的增長,心臟功能逐漸下降。AMI后心輸出量的急劇減少引起機體和各組織器官血供減少,導致內(nèi)環(huán)境失衡,產(chǎn)生大量自由基激活單核巨噬細胞系統(tǒng),使 IL -1β、IL -6等炎癥因子水平升高,并引起反應(yīng)逐級放大,引起炎癥反應(yīng)綜合征、加重心肌組織缺氧、功能障礙[9]。

    Yuan等[10]在1993年發(fā)現(xiàn)IL-1β轉(zhuǎn)換酶(IL -1β converting enzyme, ICE)與秀麗線蟲(Caenorhabditis elegans)的死亡基因CED-3具有高度同源性,過表達該基因可以誘導細胞凋亡的發(fā)生,于是ICE后來被重新命名為caspase-1,故caspase-1也可以被稱為IL -1β轉(zhuǎn)換酶。caspase-1是以無活性的酶原形式(pro-caspase-1)存在于細胞質(zhì)中,其分子量為45 kDa,其活化需要炎性平臺[11]。當機體受到各種病原體或其他刺激時細胞內(nèi)會生成炎性體,該炎性體可以募集pro-caspase-1并形成相對局部高濃度,此時酶原自體水解,形成具有活性的caspase-1,后者通過促進炎癥因子IL-1β的加工和釋放而調(diào)控細胞的炎癥反應(yīng)[3]。IL-1β是細胞內(nèi)重要的促炎癥因子,與相應(yīng)受體結(jié)合而激活下游的NF-κB信號通路,促進如IL-3、IL-5、IL-6等炎癥因子的釋放。

    本研究發(fā)現(xiàn)在小鼠AMI急性期(AMI 1d)和亞急性期(AMI 7d)心肌炎癥因子IL -1β、IL -6的mRNA和蛋白表達水平增加,釋放入血清中的炎癥因子IL -1β、IL -6也增加,但是在修復(fù)期(AMI 21d) 時IL -1β、IL -6的表達又明顯下降了,表明炎癥因子IL -1β、IL -6參與了AMI急性期和亞急性期的病理生理進展過程,而在修復(fù)期時炎癥對心肌重構(gòu)的作用就減弱了。同時發(fā)現(xiàn)在小鼠AMI急性期和亞急性期心肌caspase-1前體表達下降,而有活性的caspase-1表達增加,而在修復(fù)期時活化的caspase-1表達減少。本研究發(fā)現(xiàn)小鼠AMI后心臟活性caspase-1的表達與炎癥因子IL -1β、IL -6的表達具有一定的同步性,那么AMI后炎癥因子IL -1β、IL -6的增加與caspase-1信號通路的變化是否具有一定的因果關(guān)系,尚需進一步的研究探討。

    本研究發(fā)現(xiàn)3-甲基腺嘌呤可以促使AMI后心臟功能的進一步惡化,同時進一步促進炎癥因子IL-1β和IL-6的表達,但是其機制尚不清楚。很多文獻報道3-甲基腺嘌呤可抑制自噬的水平[12],有研究3-甲基腺嘌呤可以抑制III型PI3K或干擾Bcl-2和Beclin-1的表達[13],發(fā)現(xiàn)因此3-甲基腺嘌呤加AMI后心功能的惡化,有可能與抑制自噬途徑有關(guān),需要進一步進行試驗研究探討。

    [1] Dargie H. Heart failure post-myocardial infarction:a review of the issue[J]. Heart, 2005;91(Suppl 2):ii3-ii6.

    [2] Ferrari AU, Radaelli A, Centola M. Invited Review:Aging and the cardiovascular system[J]. J Appl Physiol, 2003, 95 (9):2591-2597.

    [3] Kiichi Nakahira, Jeffrey Adam Haspel, Vijay AK Rathinam, et al. Autophagy proteins regulate innate immune response by inhibiting NALP3 inflammasome-mediated mitochondrial DNA release[J]. Nat Immunol,2011,12(3):222-230.

    [4] Qing Xiao, Ning Hou, Yan-Ping Wang, et al. Impaired sonic hedgehog pathway contributes to cardiac dysfunction in type 1 diabetic mice with myocardial infarction[J]. Cardiovascular Research, 2012, 95 (11):507-516.

    [5] 熊龍根, 陸東鳳, 劉世明, 等. 直接經(jīng)皮冠狀動脈介入治療80歲以上急性心肌梗死患者的臨床評價[J]. 中華生物醫(yī)學工程雜志,2009, 15(5):398-401

    [6] 王 峰. 青少年急性心肌梗死的原因分析[J]. 衛(wèi)生職業(yè)教育,2014, 32(23):145-148.

    [7] Califf RM. The rationale for thrombolytic therapy[J]. Eur Heart J,1996; 17(supplE):2-8.

    [8] Díaz R, Paolasso EA, Piegas LS, et al. Metabolic modulation of acute myocardial infarction. The ECLA (Estudios Cardiológicos Latinoamérica) Collaborative Group[J]. Circulation,1998, 98(21):2227-2234.

    [9] Mouco OM, Nicolau JC, Souza TR, et al. Inflammatory markers of atherosclerotic plaque stabilization after acute coronary event temporal trends[J]. Arq Bras Cardiol, 2006, 87 (9):28-36.

    [10] Yuan J, Shaham S, Ledoux S, et al. The C. elegans cell death gene ced-3 encodes a protein similar to mammalian interleukin-1β-converting enzyme[J]. Cell,1993,75 (Suppl 1):641-652.

    [11] Martinon F, Tschopp J. Inflammatory caspases:linking an intracellular innate immune system to autoinflammatory diseases[J]. Cell,2004,117(2):561-574.

    [12] 陳興泳, 汪銀洲, 雷惠新, 等. 大鼠腦缺血再灌注后自噬的變化及燈盞生脈膠囊干預(yù)的影響[J]. 中國康復(fù)理論與實踐,2015,21(7):773-779.

    [13] 孔曉霞, 張宏宇, 鐘加滕, 等. 自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤在H2O2引起的神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細胞損傷中的作用[J]. 中國病理生理雜志,2011,27(4):695-698.

    (本文編輯:王馨)

    ·醫(yī)學新聞·

    前列腺癌:非手術(shù)方法治療效果或許更好

    據(jù)生物谷報道,一項由美國約翰霍普金斯大學Brady泌尿研究所完成的統(tǒng)計學研究表明,對于成年男性中那些非侵略性前列腺癌患者和由泌尿?qū)<冶O(jiān)控病情的前列腺癌患者,其發(fā)展成為惡性前列腺癌的概率和死于癌癥的概率很低。這項研究分析了過去20年間,1298位參與“前列腺癌主動監(jiān)控”項目的成年男性患者中,僅有兩位死于前列腺癌和三位發(fā)展為了惡性前列腺癌。

    這項研究的領(lǐng)導者、成年泌尿?qū)?浦魅蜨. Ballentine Carter教授指出,通過他們的統(tǒng)計學數(shù)據(jù),那些只患有非侵略性前列腺癌和長期處于醫(yī)生監(jiān)控監(jiān)控下的前列腺癌患者們的死亡率很低。雖然說,這個“前列腺癌主動監(jiān)控”項目的患者有的是被“精心選擇”過的,但是如果繼續(xù)這項研究,Carter教授認為結(jié)果也不會有太大變化。原因在于,三位死者中的兩位的死亡另有其他原因。同時,Carter教授也指出,這項研究是在高加索人種(白人)中完成的,可能并不適用于黑人,因為黑人的癌癥往往為惡性癌癥。

    Effect of 3-methyl adenine on dynamic changes of IL-1β and IL-6 in mice with acute myocardial infarction

    ChenFajiang,HeLishan,LiKanglan,YangYa,LuoJiandong

    (DepartmentofPharmacology,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510182,China)

    Objective:To investigate the dynamic changes of the inflammatory cytokines, interleukin-1β (IL-1β) and IL-6 in mice after acute myocardial infarction (AMI) and the effect of 3-methyl adenine on the release of myocardial inflammatory cytokines IL-1β and IL-6.Methods:Male C57BL/6 mice were randomly divided into four groups:sham operation group, AMI 1 day (AMI 1d) group, AMI 7 days (AMI 7d) group, and AMI 21 days (AMI 21d) group. We determined the changes of heart function by echocardiography, the changes of inflammatory cytokines IL-1β and IL-6 in serum and myocardial tissue by fluorescent quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR), enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA) and immunohistochemistry, and IL-1β converting enzyme caspase-1 protein in myocardial tissue by Western blotting. All mice were given 3-methyl adenine for seven days after AMI. We determined the changes of heart function by echocardiography, the changes of inflammatory cytokines IL-1β and IL-6 in myocardial tissue by ELISA and immunohistochemistry. Results: The heart function in mice was significantly decreased at 7 and 21 d after left anterior descending coronary artery ligation. Increased mRNA expression levels of inflammatory cytokines IL-1β and IL-6, and increased protein levels in serum and myocardial tissue were found in mice after AMI (P<0.05). The caspase-1 protein expression was increased in myocardial tissue in mice after AMI (P<0.05). 3-methyl adenine aggravated heart dysfunction in the AMI 7d group (P<0.05), and promoted the release of inflammatory cytokines IL-1β and IL-6 (P<0.05). Conclusion:In the process of myocardial injury, inflammatory cytokines IL-1β and IL-6 expression are increased in mice. The mechanism may be associated with the increased caspase-1 after AMI. 3-methyl adenine aggravates heart dysfunction in mice after AMI, probably via the release of inflammatory cytokines.

    acute myocardial infarction; 3-methyl adenine; inflammatory factor; interleukin-1;interleukin-6; caspase-1

    10.3969/j.issn.2095-9664.2015.05.002

    國家自然科學基金資助項目(81173062)

    陳法江(1989-),男,碩士,助理研究員。

    R363

    2095-9664(2015)05-0006-06

    2014-07-24)

    研究方向:心血管藥理學。

    *通訊作者:E-mail:jiandongluo@hotmail.com

    猜你喜歡
    腺嘌呤前列腺癌甲基
    UIO-66熱解ZrO2負載CoMoS對4-甲基酚的加氫脫氧性能
    分子催化(2022年1期)2022-11-02 07:10:56
    1,2,4-三甲基苯氧化制備2,3,5-三甲基苯醌的技術(shù)進展
    腺嘌呤聚酰亞胺/氧化石墨烯復(fù)合材料的制備及熱解動力學特性
    云南化工(2021年8期)2021-12-21 06:37:20
    前列腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的治療
    關(guān)注前列腺癌
    認識前列腺癌
    前列腺癌,這些蛛絲馬跡要重視
    聚甲基亞膦酸雙酚A酯阻燃劑的合成及其應(yīng)用
    中國塑料(2016年2期)2016-06-15 20:30:00
    WO3/ZnO的制備及其光催化降解甲基橙研究
    木醋液與6-芐基腺嘌呤對擬南芥生長的影響研究
    中文字幕亚洲精品专区| 2021少妇久久久久久久久久久| 国产一区二区 视频在线| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产一区二区 视频在线| 欧美中文综合在线视频| 日本色播在线视频| 美女大奶头黄色视频| 日韩人妻精品一区2区三区| 久久免费观看电影| 久久久亚洲精品成人影院| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产有黄有色有爽视频| 日本免费在线观看一区| 在线看a的网站| 中文字幕人妻丝袜制服| 永久免费av网站大全| 国产免费福利视频在线观看| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 午夜福利在线免费观看网站| 亚洲av成人精品一二三区| 制服人妻中文乱码| 水蜜桃什么品种好| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 在现免费观看毛片| 亚洲欧美色中文字幕在线| 黄色一级大片看看| 欧美日韩精品成人综合77777| 黑人猛操日本美女一级片| 久久国产亚洲av麻豆专区| 亚洲五月色婷婷综合| 波多野结衣av一区二区av| 黄色配什么色好看| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 成人影院久久| 少妇 在线观看| 亚洲欧美色中文字幕在线| 久久精品人人爽人人爽视色| 亚洲欧洲国产日韩| 久久久久久久精品精品| 国产精品久久久久久精品古装| 久久久精品免费免费高清| 99精国产麻豆久久婷婷| 桃花免费在线播放| 亚洲,一卡二卡三卡| 久久久久国产精品人妻一区二区| 久久毛片免费看一区二区三区| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 99热国产这里只有精品6| 国产一区二区 视频在线| 九色亚洲精品在线播放| 美女中出高潮动态图| 叶爱在线成人免费视频播放| 色吧在线观看| 不卡av一区二区三区| 亚洲美女搞黄在线观看| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 视频在线观看一区二区三区| 丝袜美腿诱惑在线| 久久人妻熟女aⅴ| 精品国产乱码久久久久久男人| 岛国毛片在线播放| 国产av一区二区精品久久| 精品亚洲成a人片在线观看| 亚洲欧美色中文字幕在线| 国产av一区二区精品久久| 深夜精品福利| 女性生殖器流出的白浆| 欧美最新免费一区二区三区| 久久99一区二区三区| 这个男人来自地球电影免费观看 | 亚洲av日韩在线播放| 精品国产乱码久久久久久男人| 日韩伦理黄色片| 青青草视频在线视频观看| 国产精品免费视频内射| 1024香蕉在线观看| 哪个播放器可以免费观看大片| 黑人欧美特级aaaaaa片| 婷婷色av中文字幕| 九草在线视频观看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| videossex国产| 成年av动漫网址| 在线天堂中文资源库| 亚洲天堂av无毛| 亚洲国产精品一区三区| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 久久鲁丝午夜福利片| 国产精品偷伦视频观看了| 久久ye,这里只有精品| 水蜜桃什么品种好| 国产伦理片在线播放av一区| 制服诱惑二区| 黄色怎么调成土黄色| 啦啦啦啦在线视频资源| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 搡老乐熟女国产| 少妇人妻精品综合一区二区| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 久久午夜福利片| 免费高清在线观看日韩| 国产麻豆69| av在线播放精品| 欧美成人精品欧美一级黄| 日本黄色日本黄色录像| 久久这里只有精品19| 99久久综合免费| 亚洲美女搞黄在线观看| 男女免费视频国产| 激情五月婷婷亚洲| 久久精品久久久久久久性| 亚洲男人天堂网一区| 国产极品天堂在线| 综合色丁香网| 久久精品国产a三级三级三级| 成人亚洲精品一区在线观看| 日韩三级伦理在线观看| 少妇 在线观看| 久久毛片免费看一区二区三区| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲内射少妇av| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产成人av激情在线播放| 亚洲av综合色区一区| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 丝袜美腿诱惑在线| www.精华液| 国产精品99久久99久久久不卡 | 精品福利永久在线观看| 中国国产av一级| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 黄片小视频在线播放| 国产黄频视频在线观看| 91精品伊人久久大香线蕉| 久久精品国产亚洲av天美| 久久久久久久久久人人人人人人| 一边亲一边摸免费视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| 十八禁网站网址无遮挡| 日韩大片免费观看网站| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产精品成人在线| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产精品蜜桃在线观看| 亚洲中文av在线| 性少妇av在线| 水蜜桃什么品种好| 午夜福利视频在线观看免费| 国产又爽黄色视频| 精品久久蜜臀av无| 人人妻人人澡人人看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| videossex国产| 97人妻天天添夜夜摸| 热re99久久精品国产66热6| 国产精品久久久av美女十八| 波野结衣二区三区在线| 亚洲av电影在线进入| 成人手机av| 亚洲内射少妇av| 国产精品 欧美亚洲| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲国产欧美网| 在线免费观看不下载黄p国产| 熟妇人妻不卡中文字幕| 女人久久www免费人成看片| 亚洲av中文av极速乱| 日韩大片免费观看网站| 国产av国产精品国产| 国产精品免费视频内射| 国产野战对白在线观看| 亚洲久久久国产精品| 交换朋友夫妻互换小说| av片东京热男人的天堂| 最近中文字幕高清免费大全6| 秋霞在线观看毛片| 成年人免费黄色播放视频| 日本wwww免费看| 人妻人人澡人人爽人人| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 日本vs欧美在线观看视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 天天操日日干夜夜撸| 欧美少妇被猛烈插入视频| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 三级国产精品片| 亚洲国产精品999| 美女大奶头黄色视频| 免费观看在线日韩| 亚洲欧美一区二区三区国产| 中文字幕精品免费在线观看视频| 丝袜在线中文字幕| 亚洲三级黄色毛片| 女性生殖器流出的白浆| 久久精品国产自在天天线| 天堂8中文在线网| 一级黄片播放器| 久久久精品免费免费高清| 丝袜美腿诱惑在线| 青草久久国产| 国产人伦9x9x在线观看 | 久久婷婷青草| 久久久久国产网址| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 午夜影院在线不卡| 久久久久久久久久人人人人人人| 五月伊人婷婷丁香| 成人影院久久| 黄色视频在线播放观看不卡| 久久久久久久亚洲中文字幕| 成人亚洲精品一区在线观看| 五月伊人婷婷丁香| 人人澡人人妻人| 亚洲精品成人av观看孕妇| 欧美变态另类bdsm刘玥| 欧美精品一区二区大全| 一本色道久久久久久精品综合| 久久国内精品自在自线图片| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 日韩人妻精品一区2区三区| 精品少妇久久久久久888优播| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 母亲3免费完整高清在线观看 | 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 欧美变态另类bdsm刘玥| 中国三级夫妇交换| 久久精品夜色国产| 色94色欧美一区二区| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 丝袜在线中文字幕| 成人毛片60女人毛片免费| 综合色丁香网| 日韩一区二区视频免费看| 69精品国产乱码久久久| 在线免费观看不下载黄p国产| 久久精品人人爽人人爽视色| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 精品人妻一区二区三区麻豆| 欧美日韩成人在线一区二区| 国产精品熟女久久久久浪| 国产伦理片在线播放av一区| 各种免费的搞黄视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 激情五月婷婷亚洲| 午夜影院在线不卡| 亚洲欧洲国产日韩| 啦啦啦啦在线视频资源| 精品人妻偷拍中文字幕| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 午夜福利一区二区在线看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 人妻少妇偷人精品九色| kizo精华| 久久99蜜桃精品久久| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产又爽黄色视频| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 三级国产精品片| 叶爱在线成人免费视频播放| 啦啦啦在线免费观看视频4| 美女中出高潮动态图| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲人成77777在线视频| 国产亚洲最大av| 高清在线视频一区二区三区| 日韩中字成人| 日韩一区二区三区影片| 满18在线观看网站| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 七月丁香在线播放| 中文字幕制服av| 电影成人av| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产av一区二区精品久久| 亚洲伊人久久精品综合| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 免费观看av网站的网址| 精品少妇内射三级| 久久鲁丝午夜福利片| 夫妻午夜视频| 国产精品久久久av美女十八| 国产极品粉嫩免费观看在线| 另类精品久久| 日韩人妻精品一区2区三区| 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲内射少妇av| 亚洲av在线观看美女高潮| 欧美日韩成人在线一区二区| 狂野欧美激情性bbbbbb| 午夜福利网站1000一区二区三区| 中文字幕精品免费在线观看视频| 免费高清在线观看日韩| 日日摸夜夜添夜夜爱| 另类亚洲欧美激情| 国产成人精品婷婷| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 精品国产一区二区久久| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产成人精品在线电影| 在线观看美女被高潮喷水网站| 青春草视频在线免费观看| 亚洲国产av新网站| 男人舔女人的私密视频| 日韩中字成人| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 九色亚洲精品在线播放| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | freevideosex欧美| 制服人妻中文乱码| 如何舔出高潮| 色94色欧美一区二区| 成人国产av品久久久| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 日韩三级伦理在线观看| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲精品一二三| 久久精品国产自在天天线| 五月天丁香电影| 国产高清不卡午夜福利| 91在线精品国自产拍蜜月| 蜜桃在线观看..| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 日本wwww免费看| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 两性夫妻黄色片| 曰老女人黄片| 亚洲一码二码三码区别大吗| 人妻人人澡人人爽人人| 99精国产麻豆久久婷婷| 久久精品国产综合久久久| 看免费成人av毛片| 看免费av毛片| 国产xxxxx性猛交| 69精品国产乱码久久久| 亚洲精品日本国产第一区| 欧美黄色片欧美黄色片| 成人国语在线视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 精品国产一区二区三区四区第35| 在线看a的网站| 国产精品一区二区在线不卡| 久久久久久久大尺度免费视频| 久久女婷五月综合色啪小说| xxx大片免费视频| 久久精品久久久久久久性| 免费高清在线观看日韩| 国产精品免费大片| 性色av一级| 国产av精品麻豆| 国产片内射在线| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 高清黄色对白视频在线免费看| 人人澡人人妻人| 丁香六月天网| 一区二区三区精品91| 午夜老司机福利剧场| 欧美激情 高清一区二区三区| 久久久久久伊人网av| 国产精品蜜桃在线观看| 男女边吃奶边做爰视频| 另类亚洲欧美激情| 成人影院久久| 免费在线观看完整版高清| 欧美另类一区| 国产不卡av网站在线观看| 夫妻午夜视频| 国产成人午夜福利电影在线观看| av天堂久久9| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 欧美精品av麻豆av| 1024香蕉在线观看| 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲精品一二三| 亚洲精品国产色婷婷电影| 秋霞伦理黄片| 91久久精品国产一区二区三区| 秋霞伦理黄片| 欧美精品av麻豆av| 免费在线观看完整版高清| 在线观看国产h片| 赤兔流量卡办理| 一级片'在线观看视频| 久久久久久久国产电影| 午夜福利网站1000一区二区三区| 99热网站在线观看| 久久久久国产网址| 国产 一区精品| 精品国产乱码久久久久久小说| 日日摸夜夜添夜夜爱| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 中文天堂在线官网| 黑人欧美特级aaaaaa片| 十八禁高潮呻吟视频| 国产av一区二区精品久久| 一级毛片 在线播放| 亚洲av综合色区一区| 欧美日韩成人在线一区二区| 99九九在线精品视频| 黄片小视频在线播放| 日日撸夜夜添| 丝袜在线中文字幕| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 黄片播放在线免费| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 婷婷色综合大香蕉| www日本在线高清视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 少妇人妻久久综合中文| 久久精品久久久久久久性| 久久99一区二区三区| 嫩草影院入口| 国产精品二区激情视频| 高清av免费在线| 韩国精品一区二区三区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 成年人午夜在线观看视频| 成人免费观看视频高清| 色哟哟·www| 十八禁高潮呻吟视频| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 免费日韩欧美在线观看| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产成人精品一,二区| 国产国语露脸激情在线看| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 免费日韩欧美在线观看| 久久精品人人爽人人爽视色| 两个人看的免费小视频| 国产免费又黄又爽又色| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 久久久精品区二区三区| 亚洲av欧美aⅴ国产| 一本久久精品| www.av在线官网国产| 久久ye,这里只有精品| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 久久这里只有精品19| 999精品在线视频| freevideosex欧美| 男人爽女人下面视频在线观看| 亚洲人成77777在线视频| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产精品蜜桃在线观看| 夫妻性生交免费视频一级片| 日韩成人av中文字幕在线观看| 人妻 亚洲 视频| 国产一区亚洲一区在线观看| 久久久久久人妻| 中文欧美无线码| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产熟女欧美一区二区| 国产精品女同一区二区软件| 精品人妻在线不人妻| 大码成人一级视频| 精品人妻一区二区三区麻豆| 久久精品国产自在天天线| 丰满饥渴人妻一区二区三| 精品人妻偷拍中文字幕| 日本欧美国产在线视频| 国产成人精品在线电影| 亚洲色图综合在线观看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 亚洲欧洲日产国产| 日本欧美视频一区| 99热网站在线观看| www.自偷自拍.com| 99香蕉大伊视频| 久久精品久久久久久久性| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲精品日本国产第一区| 国产av码专区亚洲av| 午夜日韩欧美国产| 国产一区二区激情短视频 | 国产老妇伦熟女老妇高清| 精品国产露脸久久av麻豆| 国产在视频线精品| 国产av精品麻豆| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 大陆偷拍与自拍| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 久久久久国产网址| xxxhd国产人妻xxx| 日韩一区二区视频免费看| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 一级毛片 在线播放| 国产亚洲精品第一综合不卡| av免费在线看不卡| 日本91视频免费播放| 亚洲av.av天堂| 国产乱人偷精品视频| 精品久久久久久电影网| www.自偷自拍.com| 美女主播在线视频| 18禁动态无遮挡网站| 五月伊人婷婷丁香| 国产精品久久久久久久久免| 波多野结衣一区麻豆| 晚上一个人看的免费电影| 99香蕉大伊视频| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 欧美成人午夜免费资源| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 熟妇人妻不卡中文字幕| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲精品一区蜜桃| 色吧在线观看| 美女午夜性视频免费| 国产男人的电影天堂91| 波多野结衣av一区二区av| 国产精品一国产av| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 在线观看www视频免费| 午夜福利网站1000一区二区三区| 在现免费观看毛片| 亚洲av日韩在线播放| 国产老妇伦熟女老妇高清| 久久精品国产亚洲av高清一级| 超碰成人久久| 高清黄色对白视频在线免费看| 亚洲av免费高清在线观看| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 亚洲一区中文字幕在线| 美女大奶头黄色视频| 亚洲av免费高清在线观看| 国产成人精品无人区| 精品久久久精品久久久| 在线天堂最新版资源| 亚洲欧美清纯卡通| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| videossex国产| 国产有黄有色有爽视频| 国产精品熟女久久久久浪| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 好男人视频免费观看在线| 波野结衣二区三区在线| 亚洲成人手机| 国产成人精品在线电影| 国产人伦9x9x在线观看 | 日本欧美视频一区| 老鸭窝网址在线观看| 久久ye,这里只有精品| 高清视频免费观看一区二区| 精品一区在线观看国产| 久久亚洲国产成人精品v| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 伦精品一区二区三区| 日本av手机在线免费观看| 国产一区二区激情短视频 | 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产av精品麻豆| 午夜老司机福利剧场| 满18在线观看网站| 亚洲精品成人av观看孕妇| 18在线观看网站| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲av欧美aⅴ国产| 人妻系列 视频| 成人黄色视频免费在线看| 97在线人人人人妻| 2018国产大陆天天弄谢| 国产毛片在线视频| 大片免费播放器 马上看| 国产福利在线免费观看视频| 亚洲五月色婷婷综合| 69精品国产乱码久久久| 纯流量卡能插随身wifi吗| 少妇人妻久久综合中文| 波多野结衣av一区二区av| 午夜久久久在线观看| 免费在线观看完整版高清| 一二三四中文在线观看免费高清| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 在现免费观看毛片| 麻豆av在线久日| 久久久精品区二区三区| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 自线自在国产av| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| h视频一区二区三区| xxxhd国产人妻xxx| 免费高清在线观看日韩| 欧美日韩av久久| 亚洲天堂av无毛| 丁香六月天网| 免费av中文字幕在线| 久久鲁丝午夜福利片| 欧美国产精品va在线观看不卡| 免费高清在线观看视频在线观看| 老汉色∧v一级毛片| 欧美日韩精品成人综合77777| 欧美成人午夜免费资源| av免费在线看不卡| 男人添女人高潮全过程视频| 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 亚洲精品国产色婷婷电影|