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    小鼠急性心肌梗死后IL-1β和IL-6的動態(tài)變化及3甲基腺嘌呤的影響

    2015-03-08 02:09:52陳法江何麗姍李康蘭羅健東
    廣州醫(yī)科大學學報 2015年5期
    關(guān)鍵詞:腺嘌呤前列腺癌甲基

    陳法江 何麗姍 李康蘭 楊 婭 羅健東

    ( 廣州醫(yī)科大學藥理教研室, 廣東 廣州 510182)

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    ·論著·

    小鼠急性心肌梗死后IL-1β和IL-6的動態(tài)變化及3甲基腺嘌呤的影響

    陳法江 何麗姍 李康蘭 楊 婭 羅健東*

    ( 廣州醫(yī)科大學藥理教研室, 廣東 廣州 510182)

    目的:探討小鼠急性心肌梗死(AMI)后炎癥因子IL-1β和IL-6的動態(tài)變化及3-甲基腺嘌呤對心肌炎癥因子IL-1β和IL-6釋放的影響。方法:雄性C57BL/6小鼠隨機分成四組:假手術(shù)組、AMI 1 d組、AMI 7 d組、AMI 21 d組,用超聲心動儀檢測心功能變化,用熒光定量PCR法、ELISA法和免疫組化法測量血清和心肌組織中炎癥因子IL-1β和IL-6的變化,用免疫蛋白印跡方法檢測心肌組織IL-1β轉(zhuǎn)換酶caspase-1蛋白的變化情況。在AMI 后給予3-甲基腺嘌呤7 d,用超聲心動儀檢測心功能變,用ELISA法和免疫組化法測量心肌組織中炎癥因子IL-1β和IL-6的變化情況。結(jié)果:小鼠冠狀動脈左前降支結(jié)扎術(shù)后7、21 d心功能顯著下降。小鼠AMI 后炎癥因子IL-1β和IL-6的mRNA水平表達增加,在血清和心肌組織中蛋白含量增加(P<0.05)。小鼠AMI 后心肌中caspase-1蛋白表達增加(P<0.05)。3-甲基腺嘌呤加重小鼠AMI 7 d后心臟功能下降(P<0.05),并促進炎癥因子IL-1β和IL-6的釋放(P<0.05)。結(jié)論:小鼠心肌損傷過程中炎癥因子IL-1β和IL-6表達增加,其機制可能跟AMI 后caspase-1的增加有關(guān);3-甲基腺嘌呤加重AMI 后心功能的下降,其機制可能與促進炎癥因子釋放有關(guān)。

    急性心肌梗死;3-甲基腺嘌呤;炎癥因子;白介素-1;白介素-6;半胱氨酸天冬氨酸酶-1

    冠心病已成為人類死亡的首要原因,急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是冠心病中的急危重癥。目前臨床廣泛的救治手段是在治療窗內(nèi)對閉塞的冠狀動脈進行血運重建,如經(jīng)皮冠狀動脈介入治療和冠狀動脈搭橋術(shù),但是缺血造成心肌細胞炎癥等損傷導致心臟功能下降仍然是AMI臨床治療的重要障礙[1]。各種誘因?qū)е碌难ㄐ纬勺钄喙诿}血流引發(fā)AMI后異常激活炎癥反應(yīng)系統(tǒng),致IL-1β、IL-6等促炎因子分泌增多,共同參與心肌細胞肥大、心肌纖維化等病理過程,成為導致心肌進行性重構(gòu)、心功能惡化的重要原因[2]。半胱氨酸天冬氨酸酶 (caspase)-1是caspase超家族的重要成員,能夠?qū)L-1β前體切割為具有活性的IL-1β,活性的IL-1β可激活下游NF-κB信號通路,促進IL-6等炎癥因子的釋放[3],被認為與機體的炎癥反應(yīng)和細胞凋亡有關(guān)。鑒于炎癥因子在AMI病程中扮演重要角色,本研究旨在觀察小鼠AMI后促炎因子的動態(tài)變化以及可能的相關(guān)機制,為臨床進一步認識AMI的病理生理過程提供依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 實驗動物

    雄性清潔級C57BL/6小鼠68只,體質(zhì)量 24~26 g,由廣東省動物實驗中心提供,許可證:SCXK 粵 2008-0002。

    1.2 主要試劑

    3-甲基腺嘌呤購自美國Sigma公司。BCA蛋白定量試劑盒購自美國Pierce。蛋白電泳分子量(10~170kDa) 標記購自加拿大Fermentas。IL-1β抗體、IL-6抗體、caspase-1 抗體、GAPDH抗體、抗兔Ⅱ抗購自美國Santa Cruz。ELISA試劑盒購自深圳欣博盛。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara。SYBR?Green Ⅰ熒光定量試劑購自Roche。引物合成購自美國Invitrogen。其余試劑均為分析純產(chǎn)品。所用引物由美國Invitrogen公司根據(jù)設(shè)計合成,見表1。

    表1 熒光定量PCR所用的引物

    1.3 研究方法

    1.3.1 分組 將小鼠隨機分成5組:假手術(shù)組(AMI 0d,n=10):小鼠冠狀動脈左前降支(LAD)只穿線不結(jié)扎;AMI 1d組(n=16):小鼠LAD進行結(jié)扎;AMI 7d組(n=16):小鼠LAD進行結(jié)扎;AMI 21d組(n=16):小鼠LAD進行結(jié)扎;AMI 7d+3-甲基腺嘌呤組(AMI 7d+3MA組,n=9):小鼠LAD進行結(jié)扎后,給予3-甲基腺嘌呤[15 mg/(kg·d)]。

    1.3.2 小鼠AMI模型的建立[4]連接心電圖,氣管插管,連接小動物呼吸機,正壓通氣,頻率為 150次/min,呼吸氣時比為5∶4,潮氣量約 1.5 mL/kg。于左胸第3~4肋間開胸,暴露心臟。在左心耳與肺動脈圓錐間,以左冠狀動脈主干為標志,用8~0號縫線針穿刺結(jié)扎LAD。觀察心電圖,以心電圖Ⅱ?qū)?lián)出現(xiàn) ST 段抬高及肉眼觀察結(jié)扎區(qū)域以下組織變白等心肌缺血表現(xiàn)確定為結(jié)扎成功的指標;結(jié)扎確實后,膨肺,逐層關(guān)胸。

    1.3.3 超聲測量心功能 實驗結(jié)束進行M型超聲心動圖檢測。采用加拿大Visual Sonics產(chǎn)的Vevo2100高分辨小動物超聲成像系統(tǒng)(RMV707B 探頭,頻率設(shè)置為23MHz或30 MHz,探測深度為10~15 mm)和連接高頻探頭西門子超聲儀。2%異氟烷吸入麻醉,仰臥位固定,左胸前化學脫毛膏脫毛,在胸廓表面涂抹超聲波導聲劑,探頭置于小鼠胸骨前,獲取胸骨旁長軸、短軸視野。左室短軸切面,于乳頭肌水平應(yīng)用M型超聲記錄左心室運動曲線,測量左室舒張末期和收縮末期內(nèi)徑 (left ventricular internal dimension,diastolic;left ventricular internal dimension,systolic; LVIDd和LVIDs),左室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction, LVEF)、左室短軸縮短率(fractional shortening, FS)。

    1.3.4 熒光定量PCR法檢測IL-1β、IL-6 mRNA的表達 根據(jù)Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,樣本按以下反應(yīng)體系進行:總體積25 μL,其中SYBR?GreenⅠ12.5 μL,上游引物 F 0.5 μL,下游引物R 0.5 μL,ddH2O 10.5 μL,母版DNA1 μL。反應(yīng)條件為,95 ℃ 10min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40個循環(huán)。

    1.3.5 細胞因子的測定方法 用酶聯(lián)免疫方法測定心肌組織和血清IL-1β、IL-6水平。步驟如下:①除空白孔外,分別將標本或不同濃度標準品(100 μL/孔) 加入相應(yīng)孔中,用封板膠封住反應(yīng)孔,36℃孵箱孵育90 min,洗板; ② 除空白孔外,加入生物素抗體工作液(100 μL /孔) 封住板孔,36℃孵箱孵育60 min,洗板; ③加入酶結(jié)合物工作液(100 μL /孔) 封住板孔,36℃孵箱孵育30 min,洗板;④加入顯色劑(100 μL /孔),36℃避光顯色15 min;⑤加入終止液(100 μL /孔),混勻即刻測量A450 值; ⑥在手工繪制的標準曲線上測出標本的濃度。

    1.3.6 免疫組織化學 用免疫組織化學方法測定心肌IL-1β、IL-6水平。標本常規(guī)固定、 石蠟包埋后切片,免疫組織化學染色,光學顯微鏡下觀察心肌IL-1β、IL-6的表達。

    1.4 統(tǒng)計學分析

    2 結(jié) 果

    2.1 小鼠AMI7、21d后心臟功能下降

    本實驗共準備68只雄性C57BL/6小鼠進行AMI手術(shù)。根據(jù)小鼠LAD結(jié)扎前后心臟結(jié)扎區(qū)域心肌顏色的變化情況和心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST段是否抬高來判斷手術(shù)是否成功??傮w造模成功57只小鼠,成功率為83.82%。小鼠行LAD結(jié)扎1、7和21d后分別進行超聲心功能檢測,結(jié)果顯示AMI7、21d后小鼠心功能下降(P<0.05),見圖1。

    2.2 小鼠AMI1、7和21d后心肌IL-1β和IL-6mRNA表達增加

    實驗結(jié)束后迅速取AMI周邊區(qū)于提取RNA進行熒光定量PCR實驗,結(jié)果顯示AMI1、7和21d后小鼠心臟組織IL-1βmRNA表達增加,而IL-6mRNA表達在AMI1d達到峰值,隨后下降,但與正常組相比仍具有統(tǒng)計學差異(P<0.05),見圖2。

    注:A:M-模式圖典型代表團;B:左心室收縮末內(nèi)徑、左心室舒張末內(nèi)徑、射血分數(shù)和短軸縮短率的統(tǒng)計分析;與假手術(shù)組比較,*P<0.05

    圖1 小鼠AMI后心臟功能變化情況

    注:與假手術(shù)組比較,*P<0.05

    圖2 小鼠AMI后心肌IL-1β和IL-6的mRNA水平

    2.3 小鼠AMI 1、7 d后心肌和血清中IL-1β和IL-6表達增加

    實驗結(jié)束后麻醉小鼠行主動脈取血并迅速取AMI周邊區(qū)進行ELISA法實驗,結(jié)果顯示AMI 1、7d后小鼠心臟組織和血清中IL-1β和IL-6表達增加(P<0.05),見圖3。

    2.4 小鼠AMI 1、7和21 d后心肌IL-1β和IL-6 免疫組化結(jié)果

    實驗結(jié)束后迅速取心臟固定于4%多聚甲醛,石蠟包埋切片后進行免疫組化法檢測,結(jié)果顯示AMI 1、7、21 d后小鼠心臟組織IL-1β和IL-6表達增加。見圖4

    注:與假手術(shù)組比較,*P<0.05

    圖3 小鼠AMI后心肌和血清IL-1β和IL-6的含量

    圖4 小鼠AMI后心肌IL-1β和IL-6的表達變化情況(×400)

    2.5 小鼠AMI 1、7和21 d后心肌caspase-1蛋白表達增加

    實驗結(jié)束后迅速取AMI周邊區(qū)提取蛋白進行蛋白印跡法實驗,結(jié)果顯示AMI 1、7 d后小鼠心臟組織活化的caspase-1蛋白表達增加(P<0.05),見圖5。2.6 小鼠AMI后給予3-甲基腺嘌呤后心功能下降,心肌細胞IL-1β和IL-6的表達增加

    C57BL/6小鼠進行AMI手術(shù)后即腹腔注射3-甲基腺嘌呤[15 mg/(kg·d)],給藥7 d后進行進行超聲心功能檢測, 結(jié)果顯示,與AMI 7d組相比,給予3-甲基腺嘌呤7 d后小鼠心功能下降,LVIDs增加,EF、FS下降(P<0.05),心肌細胞IL-1β和IL-6的表達增加(P<0.05),見圖6,7。

    注:與假手術(shù)組比較,*P<0.05

    圖5 小鼠AMI后心肌活化的caspase-1蛋白的表達情況

    注:與假手術(shù)組比較,*P<0.05

    圖6 小鼠AMI并注射3-甲基腺嘌呤7 d后心臟功能變化情況

    注:與AMI 7 d組比較,*P<0.05

    圖7 3-甲基腺嘌呤促進小鼠AMI 7 d后心肌IL-1β和IL-6的表達

    3 討 論

    心肌缺血是威脅人類健康的常見心血管疾病。明確AMI的發(fā)病機制對于臨床治療具有重要的現(xiàn)實意義[5-6]。AMI的基本病因是冠狀動脈粥樣硬化斑塊的破裂、出血和血栓的形成,造成管腔嚴重狹窄或閉塞引起心肌血供不足或中斷[7-8]。本研究發(fā)現(xiàn)隨著小鼠LAD結(jié)扎時間的增長,心臟功能逐漸下降。AMI后心輸出量的急劇減少引起機體和各組織器官血供減少,導致內(nèi)環(huán)境失衡,產(chǎn)生大量自由基激活單核巨噬細胞系統(tǒng),使 IL -1β、IL -6等炎癥因子水平升高,并引起反應(yīng)逐級放大,引起炎癥反應(yīng)綜合征、加重心肌組織缺氧、功能障礙[9]。

    Yuan等[10]在1993年發(fā)現(xiàn)IL-1β轉(zhuǎn)換酶(IL -1β converting enzyme, ICE)與秀麗線蟲(Caenorhabditis elegans)的死亡基因CED-3具有高度同源性,過表達該基因可以誘導細胞凋亡的發(fā)生,于是ICE后來被重新命名為caspase-1,故caspase-1也可以被稱為IL -1β轉(zhuǎn)換酶。caspase-1是以無活性的酶原形式(pro-caspase-1)存在于細胞質(zhì)中,其分子量為45 kDa,其活化需要炎性平臺[11]。當機體受到各種病原體或其他刺激時細胞內(nèi)會生成炎性體,該炎性體可以募集pro-caspase-1并形成相對局部高濃度,此時酶原自體水解,形成具有活性的caspase-1,后者通過促進炎癥因子IL-1β的加工和釋放而調(diào)控細胞的炎癥反應(yīng)[3]。IL-1β是細胞內(nèi)重要的促炎癥因子,與相應(yīng)受體結(jié)合而激活下游的NF-κB信號通路,促進如IL-3、IL-5、IL-6等炎癥因子的釋放。

    本研究發(fā)現(xiàn)在小鼠AMI急性期(AMI 1d)和亞急性期(AMI 7d)心肌炎癥因子IL -1β、IL -6的mRNA和蛋白表達水平增加,釋放入血清中的炎癥因子IL -1β、IL -6也增加,但是在修復(fù)期(AMI 21d) 時IL -1β、IL -6的表達又明顯下降了,表明炎癥因子IL -1β、IL -6參與了AMI急性期和亞急性期的病理生理進展過程,而在修復(fù)期時炎癥對心肌重構(gòu)的作用就減弱了。同時發(fā)現(xiàn)在小鼠AMI急性期和亞急性期心肌caspase-1前體表達下降,而有活性的caspase-1表達增加,而在修復(fù)期時活化的caspase-1表達減少。本研究發(fā)現(xiàn)小鼠AMI后心臟活性caspase-1的表達與炎癥因子IL -1β、IL -6的表達具有一定的同步性,那么AMI后炎癥因子IL -1β、IL -6的增加與caspase-1信號通路的變化是否具有一定的因果關(guān)系,尚需進一步的研究探討。

    本研究發(fā)現(xiàn)3-甲基腺嘌呤可以促使AMI后心臟功能的進一步惡化,同時進一步促進炎癥因子IL-1β和IL-6的表達,但是其機制尚不清楚。很多文獻報道3-甲基腺嘌呤可抑制自噬的水平[12],有研究3-甲基腺嘌呤可以抑制III型PI3K或干擾Bcl-2和Beclin-1的表達[13],發(fā)現(xiàn)因此3-甲基腺嘌呤加AMI后心功能的惡化,有可能與抑制自噬途徑有關(guān),需要進一步進行試驗研究探討。

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    (本文編輯:王馨)

    ·醫(yī)學新聞·

    前列腺癌:非手術(shù)方法治療效果或許更好

    據(jù)生物谷報道,一項由美國約翰霍普金斯大學Brady泌尿研究所完成的統(tǒng)計學研究表明,對于成年男性中那些非侵略性前列腺癌患者和由泌尿?qū)<冶O(jiān)控病情的前列腺癌患者,其發(fā)展成為惡性前列腺癌的概率和死于癌癥的概率很低。這項研究分析了過去20年間,1298位參與“前列腺癌主動監(jiān)控”項目的成年男性患者中,僅有兩位死于前列腺癌和三位發(fā)展為了惡性前列腺癌。

    這項研究的領(lǐng)導者、成年泌尿?qū)?浦魅蜨. Ballentine Carter教授指出,通過他們的統(tǒng)計學數(shù)據(jù),那些只患有非侵略性前列腺癌和長期處于醫(yī)生監(jiān)控監(jiān)控下的前列腺癌患者們的死亡率很低。雖然說,這個“前列腺癌主動監(jiān)控”項目的患者有的是被“精心選擇”過的,但是如果繼續(xù)這項研究,Carter教授認為結(jié)果也不會有太大變化。原因在于,三位死者中的兩位的死亡另有其他原因。同時,Carter教授也指出,這項研究是在高加索人種(白人)中完成的,可能并不適用于黑人,因為黑人的癌癥往往為惡性癌癥。

    Effect of 3-methyl adenine on dynamic changes of IL-1β and IL-6 in mice with acute myocardial infarction

    ChenFajiang,HeLishan,LiKanglan,YangYa,LuoJiandong

    (DepartmentofPharmacology,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510182,China)

    Objective:To investigate the dynamic changes of the inflammatory cytokines, interleukin-1β (IL-1β) and IL-6 in mice after acute myocardial infarction (AMI) and the effect of 3-methyl adenine on the release of myocardial inflammatory cytokines IL-1β and IL-6.Methods:Male C57BL/6 mice were randomly divided into four groups:sham operation group, AMI 1 day (AMI 1d) group, AMI 7 days (AMI 7d) group, and AMI 21 days (AMI 21d) group. We determined the changes of heart function by echocardiography, the changes of inflammatory cytokines IL-1β and IL-6 in serum and myocardial tissue by fluorescent quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR), enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA) and immunohistochemistry, and IL-1β converting enzyme caspase-1 protein in myocardial tissue by Western blotting. All mice were given 3-methyl adenine for seven days after AMI. We determined the changes of heart function by echocardiography, the changes of inflammatory cytokines IL-1β and IL-6 in myocardial tissue by ELISA and immunohistochemistry. Results: The heart function in mice was significantly decreased at 7 and 21 d after left anterior descending coronary artery ligation. Increased mRNA expression levels of inflammatory cytokines IL-1β and IL-6, and increased protein levels in serum and myocardial tissue were found in mice after AMI (P<0.05). The caspase-1 protein expression was increased in myocardial tissue in mice after AMI (P<0.05). 3-methyl adenine aggravated heart dysfunction in the AMI 7d group (P<0.05), and promoted the release of inflammatory cytokines IL-1β and IL-6 (P<0.05). Conclusion:In the process of myocardial injury, inflammatory cytokines IL-1β and IL-6 expression are increased in mice. The mechanism may be associated with the increased caspase-1 after AMI. 3-methyl adenine aggravates heart dysfunction in mice after AMI, probably via the release of inflammatory cytokines.

    acute myocardial infarction; 3-methyl adenine; inflammatory factor; interleukin-1;interleukin-6; caspase-1

    10.3969/j.issn.2095-9664.2015.05.002

    國家自然科學基金資助項目(81173062)

    陳法江(1989-),男,碩士,助理研究員。

    R363

    2095-9664(2015)05-0006-06

    2014-07-24)

    研究方向:心血管藥理學。

    *通訊作者:E-mail:jiandongluo@hotmail.com

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