疏肝消脂Ⅲ方膠囊對(duì)NAFLD模型大鼠脂聯(lián)素及胰島素抵抗指數(shù)干預(yù)作用研究

聶釗源 馮崇廉 鄧 煒 陳 進(jìn)

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院中醫(yī)科, 廣東 廣州 510150)

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·臨床研究·

疏肝消脂Ⅲ方膠囊對(duì)NAFLD模型大鼠脂聯(lián)素及胰島素抵抗指數(shù)干預(yù)作用研究

聶釗源 馮崇廉*鄧 煒 陳 進(jìn)

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院中醫(yī)科, 廣東 廣州 510150)

目的:探討疏肝消脂Ⅲ方膠囊對(duì)大鼠非酒精性脂肪肝(NAFLD)模型脂聯(lián)素(ADP)及胰島素抵抗評(píng)估指數(shù)(HOMA-IRI)的干預(yù)作用。方法：采用高脂乳劑灌胃法建立NAFLD大鼠模型，造模成功后，給予疏肝消脂Ⅲ方膠囊灌胃干預(yù)4周，觀察大鼠一般情況及肝組織病理形態(tài)變化；檢測(cè)血清血糖(FBG)、胰島素(FINS)含量，計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型HOMA-IRI；采用ELISA法檢測(cè)肝組織勻漿ADP的含量。結(jié)果：藥物組FBG、FINS、HOMA-IRI水平較模型組顯著降低(P<0.05)，肝組織ADP含量較模型組增高(P<0.05)，減輕病理學(xué)損傷。結(jié)論：疏肝消脂Ⅲ方膠囊治療NAFLD的機(jī)制與提高肝組織ADP表達(dá)，改善胰島素抵抗，減輕肝細(xì)胞脂肪變性及炎癥浸潤(rùn)有關(guān)。

疏肝消脂Ⅲ方膠囊；非酒精性脂肪肝；脂聯(lián)素；胰島素抵抗

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是一種無(wú)過(guò)量飲酒史，以肝臟脂肪儲(chǔ)積和脂肪變性為主要病理特征的病理綜合征。疾病后期可進(jìn)展為肝硬化、肝癌，而肝硬化不可逆轉(zhuǎn)，嚴(yán)重影響患者的健康及生活質(zhì)量[1]。近年來(lái)，中醫(yī)藥在脂肪肝的防治研究日趨活躍，并顯示出良好的發(fā)展前景，對(duì)減緩慢性肝病的進(jìn)展及改善預(yù)后有積極的意義。

在NAFLD的發(fā)病過(guò)程中，常伴有一系列細(xì)胞因子表達(dá)的變化，如脂聯(lián)素(adiponectin, ADP)、瘦素(leption , LEP)等，參與NAFLD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，介導(dǎo)糖脂代謝、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和免疫功能等[2]。疏肝消脂Ⅲ方膠囊是馮崇廉教授從中醫(yī)“肝主疏泄”理論組方用藥，經(jīng)驗(yàn)和科學(xué)研究結(jié)合研制而成，具有疏肝理氣、祛瘀化痰的功效，在臨床應(yīng)用和科學(xué)研究中顯示出良好的效果及應(yīng)用前景。本研究擬觀察疏肝消脂Ⅲ方膠囊干預(yù)NAFLD大鼠血清空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)、穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗評(píng)價(jià) (HOMA-IR) 指數(shù)、肝組織脂聯(lián)素(ADP)和病理學(xué)的變化，探討其治療脂肪肝的作用機(jī)制，為該藥的臨床應(yīng)用推廣提供可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)近交系健康雄性Sprague-Dawlay(SD)大鼠46只，體質(zhì)量180～220g，購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證明：44007200016915。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物、試劑、儀器

疏肝消脂Ⅲ方膠囊，由牛黃田七散合四逆散組方加減而成，每粒膠囊含原生藥量約3.12 g，由廣州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院中醫(yī)科委托廣東新峰藥業(yè)協(xié)制。葡萄糖檢測(cè)試劑盒，購(gòu)于羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司；胰島素(INS)試劑盒，購(gòu)于南京建成生物工程研究所)；脂聯(lián)素(ADP)試劑盒購(gòu)于cloud-clone公司；多聚甲醛、二甲苯購(gòu)于廣州化學(xué)試劑廠；Rt2100c酶標(biāo)檢測(cè)儀，購(gòu)于Rayto公司等。

1.3 造模材料

高脂乳劑配制，參考文獻(xiàn)[3-4]配方加以改進(jìn)：200 mL豬油、100 g膽固醇、10 g丙硫氧嘧啶、10 g蛋黃粉、20 g膽酸鈉、200 mL吐溫-80、200 mL丙二醇、300 g果糖、蒸餾水等；分裝置于4 ℃冰箱保存，使用時(shí)用37 ℃水浴，解凍后灌胃。

1.4 給藥方法

分組后給予藥物干預(yù)，每日固定時(shí)間灌胃予疏肝消脂Ⅲ方膠囊溶液。用量按照動(dòng)物與人體的每公斤體重劑量折算系數(shù)換算，分別折算成大鼠劑量為疏肝消脂Ⅲ方膠囊(315 mg/kg)，以蒸餾水稀釋成對(duì)應(yīng)濃度的溶液灌胃使用。模型組及正常對(duì)照組則予以相同容積的蒸餾水。

1.5 造模與分組

[3-5]制模方法，采用高脂乳劑灌胃法建立大鼠NAFLD模型；動(dòng)物檢疫合格后，大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組10只，NAFLD模型組24只。每天上午正常對(duì)照組按1 mL/100 g體重灌服蒸餾水，模型組按1mL/100 g體重灌服高脂乳劑。灌胃2周后，眼眶靜脈叢采血約測(cè)定總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平，與正常對(duì)照組比較，形成高脂血癥后，模型組隨機(jī)選取4只大鼠進(jìn)行病理切片觀察，病理結(jié)果顯示大部分肝細(xì)胞腫脹，形態(tài)排列不規(guī)則，胞漿內(nèi)充滿大小不等的脂滴。模型組余下20只大鼠隨機(jī)分成2組，即NAFLD模型組、疏肝消脂Ⅲ方膠囊(315 mg/kg)組，加上正常對(duì)照組，一共3組，每組10只。每天上午，除正常對(duì)照組給予等量蒸餾水灌胃外，其余各組灌胃高脂乳劑；每天下午，正常對(duì)照組和NAFLD模型組則給予等量蒸餾水，疏肝消脂Ⅲ方膠囊組給予對(duì)應(yīng)藥物灌胃。

藥物治療4周后，術(shù)前禁食，以3%的戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血5 mL，分離出血清，置凍存管保存于-20 ℃的冰箱內(nèi)，待用；取血完畢后，所有動(dòng)物放血處死，迅速解剖摘取肝臟，用4 ℃預(yù)冷的生理鹽水沖洗其表面血液，濾紙拭干，取約2 g左右肝組織至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；每只大鼠切取肝右葉的一半放于10%的中性甲醛溶液中固定，病理檢測(cè)備用。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)

1.6.1 一般情況觀察 觀察動(dòng)物的日常情況包括體形、皮毛、皮膚、糞便、肌肉張力、步態(tài)、精神、呼吸等。

1.6.2 FBG、FINS檢測(cè) 血清FBG檢測(cè)采用己酶激酶法，按照試劑盒操作說(shuō)明處理血清樣品，由德國(guó)羅氏C8000全自動(dòng)生化儀測(cè)定；血清FINS檢測(cè)按照試劑盒操作說(shuō)明采用ELISA法。

1.6.3 根據(jù)公式計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗評(píng)估指數(shù) HOMA-IRI=FINS×FBG/22.5。

1.6.4 肝組織ADP檢測(cè) 制備肝組織勻漿，按照試劑盒操作說(shuō)明采用ELISA法檢測(cè)肝組織ADP含量。

1.6.5 肝組織病理學(xué)觀察 將固定于甲醛溶液中的各組大鼠肝組織依次經(jīng)脫水、透明和石蠟包埋后，連續(xù)切片，切片厚度約4 μm，進(jìn)行HE染色。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠的一般情況

實(shí)驗(yàn)至第6周結(jié)束，飼養(yǎng)期間，各組大鼠全部存活。正常組大鼠精神狀態(tài)良好，動(dòng)作靈活，反應(yīng)敏捷，皮毛光澤整潔，體重穩(wěn)定上升，食量正常，大小便正常；模型組大鼠隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，精神萎靡，動(dòng)作反應(yīng)遲緩，行動(dòng)欠佳，皮毛蓬松，欠缺光澤，體重略有減輕，飲食減少，大小便正常。藥物組大鼠精神狀態(tài)較好，動(dòng)作尚靈活，反應(yīng)較靈敏，皮毛色澤較模型組好，食欲均有減少，體重略有減輕，大小便正常。模型組與藥物組大鼠體重、飲食情況的改變考慮可能與高脂乳劑引起胃腸道刺激有關(guān)。

2.2 疏肝消脂Ⅲ方膠囊對(duì)大鼠FBG、FINS、HOMA-IRI的影響

與正常組比較，模型組大鼠FBG、FINS含量及HOMA-IRI水平顯著性升高(P<0.05)。而給予藥物干預(yù)后，大鼠FBG、FINS含量及HOMA-IRI水平不同程度降低，疏肝消脂Ⅲ方膠囊組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清FBG、FINS、HOMA-IR的比較結(jié)果

注：與正常組比較,*P<0.05； 與模型組比較,#P<0.05

2.3 疏肝消脂Ⅲ方膠囊對(duì)大鼠肝組織ADP的影響

與正常組比較，各組大鼠肝組織勻漿ADP水平均顯著性降低(P<0.05)，其中模型組ADP水平最低。而給予藥物治療后，大鼠肝組織勻漿ADP水平不同程度提高，疏肝消脂Ⅲ方膠囊組與模型組比較，有顯著性差異(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠肝組織脂聯(lián)素(ADP)含量的比較結(jié)果

注：與正常組比較,*P<0.05； 與模型組比較,#P<0.05

2.4 各組大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)變化的比較結(jié)果

病理學(xué)組織診斷標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[6]，各組大鼠肝臟病理結(jié)果顯示：正常組的匯管區(qū)結(jié)構(gòu)正常，肝索以中央靜脈為中心呈放射狀排列，結(jié)構(gòu)清楚，肝細(xì)胞為單核或雙核，顆粒大小均勻一致；模型組肝臟病理呈中-重度脂肪變性，肝細(xì)胞腫脹，胞漿內(nèi)見(jiàn)大量形狀大小不等的脂滴(空泡)，較大的脂滴將細(xì)胞核擠向周邊，肝小葉及匯管區(qū)可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴、單核細(xì)胞為主，肝索排列紊亂，結(jié)構(gòu)不清晰(無(wú)呈放射狀排列)。疏肝消脂Ⅲ方膠囊組以輕-中度脂肪變性為主，肝細(xì)胞腫脹減輕，胞漿內(nèi)脂滴減少，細(xì)胞核大小較均勻。胞質(zhì)可見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞，匯管區(qū)可見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝索排列較整齊，結(jié)構(gòu)較清晰。與模型組相比較，說(shuō)明疏肝消脂Ⅲ方膠囊能減輕肝臟脂肪變性程度，減輕細(xì)胞炎癥，但與正常組比較仍有差異，未能達(dá)到正常組水平。見(jiàn)圖1。

注：A. 正常組；B. NAFLD模型組；C. 疏肝消脂Ⅲ方膠囊組

圖1 各組大鼠肝組織病理學(xué)形態(tài)變化比較結(jié)果(HE, ×400)

3 討 論

迄今為止，對(duì)NAFLD的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前較為成熟及完善的理論為Day等[7]提出的“二次打擊”學(xué)說(shuō)為主，其學(xué)說(shuō)強(qiáng)調(diào)了胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子表達(dá)變化等在NAFLD發(fā)病中的作用。ADP是脂肪組織分泌的一種肽類(lèi)激素，是目前已知的脂肪細(xì)胞因子中唯一的負(fù)性調(diào)節(jié)激素，其作為一種抵抗肝脂肪變性、炎癥反應(yīng)和肝纖維化的新型激素參與NAFLD的發(fā)病過(guò)程[8]。ADP能加快血漿中游離脂肪酸的清除，降低甘油三脂水平[9]。ADP水平下降可減少體內(nèi)脂肪酸氧化反應(yīng)，減少葡萄糖在骨骼肌細(xì)胞中的攝取，并增加肝細(xì)胞的糖異生，導(dǎo)致血糖水平升高；另一方面，可減少脂肪酸β氧化反應(yīng)，導(dǎo)致FFA水平升高，肝臟脂質(zhì)沉積，發(fā)生炎癥及增加胰島素抵抗，進(jìn)而降低葡萄糖的吸收，導(dǎo)致血糖及脂質(zhì)代謝異常。因此，ADP具有增強(qiáng)脂肪酸β氧化，改善胰島素敏感性，減輕胰島素抵抗水平，改善脂質(zhì)代謝的作用，同時(shí)具有抑制炎癥，減輕氧化應(yīng)激而保護(hù)肝細(xì)胞等作用[10-11]。中醫(yī)認(rèn)為，胰島素抵抗與肝脾氣機(jī)失調(diào)，津液代謝異常，痰濁血瘀互結(jié)等因素有關(guān)，且痰瘀貫穿整個(gè)病程[12]。臨床上辨證施藥以疏肝解郁、健脾益氣、化痰祛濕、活血祛瘀等法調(diào)整人體陰陽(yáng)。

疏肝消脂Ⅲ方膠囊具有疏肝理氣、祛瘀化痰的功效，以牛黃田七散合四逆散加減組方而成，方中牛黃、田七相須為伍，加強(qiáng)化痰祛瘀之功。方中柴胡、白芍、枳殼行氣疏肝解郁；佛手、荷葉升清降濁，佐以疏肝；丹參、山楂、郁金等活血祛瘀；田基黃、川萆薢、澤瀉等清肝利膽祛濕。諸藥合伍共奏疏肝解郁、行氣化痰、活血化瘀之功，藥效平和，不易損傷人體正氣。前期研究表明可改善大鼠肝功能、脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)，減輕氧化應(yīng)激及改善脂質(zhì)過(guò)氧化等療效[13-15]；毒理學(xué)研究表明疏肝消脂Ⅲ方膠囊規(guī)定劑量下服用安全可靠[16]。

本研究表明，疏肝消脂Ⅲ方膠囊組FBG、FINS、HOMA-IRI水平較模型組均降低(P<0.05)，肝組織ADP含量較模型組增高(P<0.05)，形態(tài)學(xué)上的肝細(xì)胞脂肪變性和炎癥浸潤(rùn)得到改善和恢復(fù)，顯示疏肝消脂Ⅲ方膠囊有保護(hù)肝臟的作用?；谥嗅t(yī)藥的多靶點(diǎn)效應(yīng)，疏肝消脂Ⅲ方膠囊對(duì)NAFLD的干預(yù)作用靶點(diǎn)之一有可能通過(guò)調(diào)節(jié)肝組織ADP水平，從而改善胰島素抵抗、減輕肝細(xì)胞炎癥、減輕肝細(xì)胞脂肪變性等有關(guān)。肝損傷疾病的病理機(jī)制復(fù)雜，多種因素相互作用，互相轉(zhuǎn)化，共同參與促進(jìn)疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸預(yù)后。中成藥復(fù)方的優(yōu)勢(shì)所在是其具有多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)作用[17]，如何通過(guò)機(jī)體調(diào)節(jié)肝臟脂肪細(xì)胞因子的表達(dá)水平，增強(qiáng)胰島素與受體結(jié)合提高胰島素敏感性，改善胰島素抵抗，降低脂質(zhì)在肝臟的蓄積，減輕肝細(xì)胞的損傷，有望成為今后探討的熱點(diǎn)。

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(本文編輯:張輝)

Intervention of Shugan Xiaozhi Recipe III Capsules on adiponectin and insulin resistance index in NAFLD rat models

NieZhaoyuan,FengChonglian,DengWei,ChenJin

(DepartmentofTraditionalChineseMedicine,ThirdAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510150,China)

Objective:To investigate the intervention of Shugan Xiaozhi Recipe Ⅲ (SXR Ⅲ) Capsules on adiponectin (ADP) and insulin resistance (IR) index in rat models with non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Methods:The NAFLD rat models were established by gavage of high-fat emulsion. After the rat models were established successfully, the rats were given SXR III Capsules by gavage for 4 weeks. The general condition and pathological changes of liver tissues in rats were observed. The fasting blood glucose (FBG) and fasting insulin (FINS) contents were determined. Homeostasis model assessment-insulin resistance index (HOMA-IRI) was calculated. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to determine the ADP content in the liver tissues.Results: Compared with the untreated model group, the levels of FBG, FINS, and HOMA-IRI were decreased (P<0.05), and the content of ADP in the liver tissue was increased (P<0.05) in the medication group, with milder pathological damage.Conclusion:The mechanism of SXR III Capsules in the treatment of NAFLD may be associated with increased expression level of ADP in the liver tissue, improved IR, and reduced hepatocyte steatosis and inflammatory cells infiltration.

Shugan Xiaozhi Recipe III Capsules; non-alcoholic fatty liver; adiponectin; insulin resistance

10.3969/j.issn.2095-9664.2015.05.006

廣州市“十二五”中醫(yī)重點(diǎn)專(zhuān)科—肝病科(穗衛(wèi)中[2013]6號(hào))；廣州市中醫(yī)藥科技項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：2014A011005)

聶釗源(1988-)，男，碩士，住院醫(yī)師。

R285.5

2095-9664(2015)05-0024-04

2014-07-03)

研究方向：中醫(yī)肝病。

*通訊作者：e-mail:fengchonglian@126.com