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    Ndrg1基因缺失對(duì)腰椎到骶椎結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換的影響

    2015-03-04 07:26:32陳慧慧郭熙志
    國(guó)際骨科學(xué)雜志 2015年3期
    關(guān)鍵詞:骶椎脊椎胸椎

    陳慧慧 朱 煌 郭熙志

    脊椎在整個(gè)軀干和頭部支撐中扮演著非常重要的角色,且可為脊髓提供保護(hù)作用,并在前后軸方向上展示出區(qū)域性形態(tài)特征[1]。脊椎發(fā)育可分為早、晚期階段,即前原節(jié)中胚層體節(jié)分割和脊椎特化[2]。前原節(jié)中胚層周期性分割信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、Wnt和 Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[2-3],同時(shí)體節(jié)模式和形態(tài)變化也受Hox基因調(diào)控[4]。Hox基因由13個(gè)旁系同源基因線性排列組合而成,形成了體節(jié)特性的組合密碼[4-7],其功能性缺失和功能獲得性突變通常導(dǎo)致椎體同源轉(zhuǎn)變?nèi)毕荩?,8]。

    N-Myc下游調(diào)控基因家族(Ndrg1~4)屬于α/β水解酶家族,其具有高度保守性[9]。人類Ndrg基因家族成員氨基酸序列具有53%~65%的相似性[10-11],但 Ndrg1和 Ndrg2蛋白因缺少水解酶催化位點(diǎn)而不具有水解酶催化活性[11]。研究報(bào)道,Ndrg1是腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因,涉及胰腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、子宮頸癌、卵巢癌和前列腺癌等發(fā)生[9,12-14],而 Ndrg2 是 一 種 腫 瘤 抑 制基因[10-11]。我們的前期研究表明,Ndrg2是體節(jié)分化過(guò)程中的一種新型脊椎特化調(diào)控因子[3],但Ndrg1基因在脊椎特化中的作用目前尚不清楚。本研究將重點(diǎn)分析Ndrg1-/-鼠的脊椎特性和結(jié)構(gòu),觀察Ndrg1敲除對(duì)椎體同源轉(zhuǎn)換的作用并探討其發(fā)生機(jī)制,同時(shí)與Ndrg2在骨骼發(fā)育中的功能進(jìn)行對(duì)照研究。

    1 資料與方法

    1.1 研究材料

    Ndrg1fl/fl制備:采用靶向載體電轉(zhuǎn)R1胚胎干細(xì)胞,轉(zhuǎn)染過(guò)程使用G418抗生素,篩選具有G418抗性的胚胎干細(xì)胞克隆,并通過(guò)Sourthern免疫印跡確定正確靶向克??;將經(jīng)篩選的胚胎干細(xì)胞注射到囊胚中獲得老鼠嵌合體,此即為 Ndrg1fl/fl鼠[3]。

    將條件性敲除鼠與Actin-Cre鼠雜交以獲得Ndrg1-/-、Ndrg2-/-鼠。Ndrg1等位基因缺失鑒定引物 為 P1(5’-AGCAGGCTCTTAAAGCGGCTCC-3’)、P2(5’-CCGCCTCTGTCAAATTAGTAGCTG-3’)、P3(5’-GGGAGAGCTGAAGGCTGTTCTAGG-3’),Ndrg2等位基因缺失鑒定引物為 P4(5’AAAAGCTCTCCGTGTGTCTTGGCGT-3’)、P5(5’GTCATTTGGGAGAATGGAGGAGGCA-3’)。所有小鼠均為C57BL/6小鼠。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)格遵照上海交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理法規(guī)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    RNA原位雜交:采用地高辛標(biāo)記的FGF-8基因探針[15-16]。自主合成 Ndrg1、Hoxc8、Hoxc11基因探針,Ndrg1、Hoxc8、Hoxc11 cNDA 模板引物分別為 (F)5’AGTCTACTAGGCTCACTTGAAG-GAA、(R)5’CACGGTAGGAGTTGGCAGGAA,(F)5’TCTTCACGGTGCTTCTCTGGTAT、(R)5’GGCTAGGCAGTCTCAGTTGTTG,(F)5’GGCCTGGAACCGTCCGGGAAGTG、(R)5’TT-GGTCGCCGAGTGGGAAGAACC。其余基因探針完全以 Hoxc9(BC050838)、Hoxc10(BC053405)cDNA克隆為模板。

    實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR):收集10.5 d的 Ndrg1-/- 鼠胚胎及其同窩小鼠,10.5 d時(shí)應(yīng)用一步法從后面體節(jié)到第12塊體節(jié)抽提總RNA,采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)情況。Ndrg1 引 物 為 (F)5’GGTGAAGCCTCTGGTG-GAAAAAG、(R)5’GTGAGGATGACAGGACG-GTTGC,Hoxc8引物為(F)5’GTCCATGCCTTC-CTTGCCTTG、(R)5’ATGGTGACTTCTGAG-CACAAACA,Hoxc9 引 物 為 (F)5’TGTAG-CGATTTTCCGTCCTGTAG、(R)5’CCGTA-AGGGTGATAGACCACAGA,Hoxc10 引 物 為(F)5’GGGCCAAGACCGCAGACT、(R)5’GC-CAATTTCCTGTGGTGTTTTC,Hoxc11引物為(F)5’GCGGCCGACGAGCTTATG、(R)5’TTTTTCATGAGGATCTCAGTGACTGT。基因組DNA來(lái)源于野生型小鼠鼠尾。

    骨架染色:出生后6 d的 Ndrg1-/-和Ndrg1/2-/-鼠窒息處死后,去除皮膚、內(nèi)臟及結(jié)締組織,進(jìn)行阿爾新藍(lán)和茜素紅染色[17]。

    2 結(jié)果

    2.1 Ndrg1在不同體節(jié)中的表達(dá)

    為了檢測(cè)Ndrg1在體節(jié)發(fā)生過(guò)程中的表達(dá)情況,我們通過(guò)使用地高辛標(biāo)記的Ndrg1、Ndrg2和FGF-8探針對(duì)10.5 d的胚胎進(jìn)行整體原位雜交實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明胚胎期10.5 d Ndrg1在頸椎和胸椎體節(jié)處顯著表達(dá),在腰椎和骶椎體節(jié)處表達(dá)較弱(圖1a),而Ndrg2則在腰椎和骶椎體節(jié)處表達(dá)較強(qiáng),在頸椎和胸椎體節(jié)處表達(dá)較弱(圖1b)。在該階段,Ndrg1并未在肢芽由FGF-8標(biāo)記的前原節(jié)中胚層中出現(xiàn)(圖1c)??傮w上,在體節(jié)中Ndrg1表達(dá)部分與Ndrg2疊加,但又與Ndrg2表達(dá)有明顯區(qū)別。

    2.2 Ndrg1缺失對(duì)腰椎至骶椎同源轉(zhuǎn)換的影響

    為了獲得Ndrg1-/-鼠,我們引進(jìn)了攜帶條件性等位基因Ndrg1fl/fl的小鼠。該等位基因在第1個(gè)外顯子兩邊插入Loxp片段及pGKneo篩選基因(圖2a)。我們將攜帶條件性等位基因Ndrg1fl/fl的小鼠與Actin-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交。經(jīng)過(guò)幾個(gè)步驟的回交,得到Ndrg1-/-鼠(圖2b)。雜合子和基因敲除小鼠可以通過(guò)引物P1/P2/P3進(jìn)行基因型鑒定(圖2c)。通過(guò)qRT-PCR測(cè)試,Ndrg1基因敲除率達(dá)到90%左右(圖2d)。Ndrg1-/-鼠是可育的,且無(wú)明顯生長(zhǎng)缺陷。然而,Ndrg1-/-鼠在腰椎至骶椎的過(guò)渡區(qū)域出現(xiàn)同源轉(zhuǎn)換(下頁(yè)圖3)。在野生型鼠中,中軸骨常由7塊頸椎(C1~C7)、13塊胸椎(T1~T13)、6塊腰椎(L1~L6)、4塊骶椎(S1~S4)和一定數(shù)量的尾椎組成。Ndrg1-/-鼠頸椎、胸椎和尾椎的數(shù)量和組織排列與野生型鼠相同,但其L6形態(tài)與野生型鼠S1部分相似,出現(xiàn)不同程度的L6~S1同源轉(zhuǎn)換(下頁(yè)圖3)。

    圖1 胚胎期10.5 d Ndrg1、Ndrg2在分化體節(jié)中的表達(dá) a.Ndrg1在頸椎和胸椎體節(jié)處表達(dá)水平較高 b.Ndrg2在腰椎和骶椎體節(jié)處表達(dá)水平較高 c.由FGF-8標(biāo)記的前原節(jié)中胚層

    圖2 Ndrg1-/-鼠制備和基因型鑒定 a.Ndrg1fl/fl等位基因結(jié)構(gòu),Loxp位點(diǎn)被插入第1外顯子Ndrg1啟動(dòng)子上游和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游 b.Ndrg1-/-鼠由Ndrg1fl/fl鼠于Actin-Cre鼠雜交獲得 c.野生型鼠和Ndrg1-/-鼠基因型鑒定 d.采用qRT-PCR分析Ndrg1基因敲除率

    我們的前期研究顯示,Ndrg2-/-鼠也出現(xiàn)與Ndrg1-/-鼠類似的 L6~S1同源轉(zhuǎn)換。此外,Ndrg2-/-鼠在T9~T10、T13~L1和S4~C1過(guò)渡區(qū)域也發(fā)生椎體同源轉(zhuǎn)換。為了檢測(cè)Ndrg1和Ndrg2在體節(jié)特化過(guò)程中是否有疊加作用,我們比較了 Ndrg1/2-/- 鼠和 Ndrg1-/- 鼠的椎體結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示在Ndrg1/2-/-鼠L6~S1存在相似的椎體同源 轉(zhuǎn) 換,但 Ndrg1/2-/- 鼠 與 Ndrg1-/- 鼠、Ndrg2-/-鼠相比并無(wú)額外的缺陷(圖2),或者說(shuō),Ndrg1/2-/-鼠除 L6~S1椎體同源轉(zhuǎn)換外,Ndrg1缺失反而彌補(bǔ)了Ndrg2缺失引起的T13~L1和S4~C1區(qū)域椎體同源轉(zhuǎn)變。

    2.3 Ndrg1缺失與 Hoxc8-11基因表達(dá)

    圖3 Ndrg1-/-、Ndrg1/2-/-鼠椎體同源轉(zhuǎn)換 a~d1.腰椎和骶椎背視圖,包括野生型鼠腰椎(a)和骶椎 (a1)、中度突變Ndrg1-/-鼠腰椎(b)和骶椎 (b1)、嚴(yán)重突變 Ndrg1-/-鼠腰椎(c)和骶椎 (c1)、Ndrg1/2-/-鼠腰椎(d)和骶椎 (d1) e.L1~S2椎體背視圖,其中*表示發(fā)生轉(zhuǎn)變的椎體,在Ndrg1-/-、Ndrg1/2-/-鼠中L6的結(jié)構(gòu)與S1的結(jié)構(gòu)相似(紅色箭頭指示),所有骨架均于出生后6 d收集(其中 Ndrg1-/-鼠10只,Ndrg1/2-/- 鼠6只)

    圖4 Ndrg1-/-鼠胚胎中Hoxc8~11基因表達(dá)情況 a~h.應(yīng)用整體原位雜交技術(shù)檢測(cè)胚胎期10.5 d Ndrg1-/-鼠Hoxc8~11基因表達(dá),其中△表示體節(jié)處基因表達(dá)明顯改變(n=3) i.經(jīng)qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)顯示,與對(duì)照組相比,胚胎期10.5 d Ndrg1-/-鼠后面體節(jié)Hoxc8表達(dá)水平下降,而Hoxc9~11基因表達(dá)水平上升 (n=3)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參范圍)

    為了探索Ndrg1-/-鼠中椎體同源轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制,我們應(yīng)用整體胚胎原位雜交和qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)胚胎期10.5 d Ndrg1-/-鼠 Hoxc8、Hoxc9、Hoxc10和Hoxc11表達(dá)模式,結(jié)果顯示10.5 d的胚胎從頸椎至尾椎體節(jié)經(jīng)歷著成骨、成軟骨分化,與對(duì)照組相比,Ndrg1-/-鼠Hoxc8表達(dá)水平增加,而Hoxc9、Hoxc10和Hoxc11表達(dá)水平卻有所下降(圖4),表明Ndrg1至少部分通過(guò)調(diào)節(jié)Hoxc8~11基因表達(dá)水平來(lái)調(diào)控椎體特化。

    3 討論

    Ndrg1是腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因,涉及多種癌癥發(fā)生發(fā)展[9,12-14]。在 臨 床 上,目前尚 無(wú) 關(guān) 于 Ndrg1 基因表達(dá)缺陷與脊柱疾病等方面的報(bào)道。

    在此項(xiàng)研究中,我們通過(guò)使用Ndrg1-/-鼠來(lái)研究Ndrg1基因在調(diào)控椎體特化過(guò)程中的功能,Ndrg1和Ndrg2的表達(dá)在分化體節(jié)中部分重疊,但與Ndrg2相比,Ndrg1在前部體節(jié)中表達(dá)水平較高;Ndrg1-/-鼠和 Ndrg2-/-鼠均出現(xiàn)腰椎與胸椎過(guò)渡區(qū)域L6~S1椎體同源缺陷;在脊椎發(fā)育過(guò)程中,Ndrg1-/-鼠的缺陷表型不及 Ndrg2-/-鼠明顯,Ndrg1/2-/-鼠椎體特化缺陷與 Ndrg1-/-鼠一致,Ndrg2-/-鼠其他椎體缺陷如T13~L1和S3~S4過(guò)渡區(qū)域椎體同源轉(zhuǎn)變?cè)贜drg1/2-/-鼠中并未發(fā)現(xiàn),也可以說(shuō),Ndrg1的缺失部分挽救了Ndrg2-/-鼠表型??偟膩?lái)說(shuō),雖然Ndrg1的表達(dá)譜及功能與Ndrg2部分相似,但兩者的作用不具有冗余性。

    研究[18]報(bào)道,Hox基因簇的重要標(biāo)志之一是它們?cè)谌旧w上的線性排列與其在早期發(fā)育中的表達(dá)時(shí)間點(diǎn)和前后軸邊界直接相關(guān)。椎體同源轉(zhuǎn)換通常與Hox基因表達(dá)邊界改變有關(guān)。Ndrg1-/-鼠椎體同源轉(zhuǎn)換與Hoxc8~11基因表達(dá)水平改變有關(guān)。與對(duì)照組相比,Ndrg1-/-鼠胚胎體節(jié)中 Hoxc8表達(dá)水平升高,而Hoxc9~11表達(dá)水平下降。而體節(jié)中Hoxc8或Hoxc9基因的缺失會(huì)導(dǎo)致L1~T13及T10~T13過(guò)渡區(qū)域椎體同源轉(zhuǎn)換[8,19],但這些表型均未在 Ndrg1-/-鼠中觀察到。然而,Hoxc10、Hoxc11缺失鼠表現(xiàn)出與Ndrg1-/-鼠和Ndrg2-/-鼠一些相似的椎體同源轉(zhuǎn)換[20-21]。值得注意的是,在Ndrg1-/-鼠體節(jié)中檢測(cè)到的是Hoxc8~11轉(zhuǎn)錄水平的改變,而非表達(dá)邊界的改變。Hox基因表達(dá)邊界大多先于體 節(jié)分割[4,22-23]。因此,我們推測(cè)Hox基因表達(dá)水平的組合改變即使不是唯一,也能部分解釋Ndrg1-/-鼠中的椎體同源轉(zhuǎn)換。

    總之,這些結(jié)果表明Ndrg1基因部分通過(guò)調(diào)節(jié)Hoxc8~11基因表達(dá)水平調(diào)控腰椎和胸椎過(guò)渡區(qū)域椎體同源轉(zhuǎn)換。值得注意的是,Ndrg1基因在前部體節(jié)中表達(dá)較高,但其功能卻在后部體節(jié)如腰、骶椎中更顯著。這提示,在椎體分化早期階段,Ndrg1可能與其他調(diào)控子一起發(fā)揮作用。在脊椎發(fā)育過(guò)程中,Ndrg基因家族其他成員如Ndrg3、Ndrg4也在體節(jié)和尾牙處有表達(dá)[24]。然而,目前還沒(méi)有關(guān)于Ndrg3-/-、Ndrg4-/-小鼠在脊椎發(fā)育過(guò)程中相關(guān)功能的報(bào)道,關(guān)于Ndrg1、Ndrg3、Ndrg4在椎體特化過(guò)程中是否相互作用,仍需進(jìn)一步研究。

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