腎透明細(xì)胞癌中碳酸酐酶IX 與Pten蛋白的表達(dá)與意義

劉貝貝，梁朝朝△，劉建民，承澤農(nóng)

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，合肥230032；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，安徽蚌埠233004；3.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，安徽蚌埠233004）

腎癌是臨床上常見(jiàn)的泌尿系惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年升高，發(fā)病率在泌尿系腫瘤中僅次于膀胱癌［1］。腎癌比較隱匿，當(dāng)出現(xiàn)臨床癥狀時(shí)多數(shù)病情診斷已到晚期。對(duì)腎細(xì)胞癌的治療，早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶非常重要，而腎癌早期一般無(wú)明顯癥狀，目前影像學(xué)方法診斷腎癌的特異性和敏感性較差。腎癌的主要病理類型為腎透明細(xì)胞癌，占60%～85%［2］。近年來(lái)，多項(xiàng)研究報(bào)告碳酸酐酶IX 與Pten蛋白的表達(dá)可能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本文分析研究碳酸酐酶IX 與Pten蛋白在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)情況，碳酸酐酶IX 與Pten蛋白的表達(dá)與腎癌的臨床病理特征均具有相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2012年6月至2013年6月經(jīng)病理證實(shí)為腎透明細(xì)胞癌組織98例，男64例（65.31%），女34 例（34.69%）；年 齡20～68 歲，平 均（31.3±18.6）歲，腫瘤直徑大小2.1～12.2cm，平均（6.7±4.3）cm，左腎癌54例（55.10%），右腎癌44例（44.90%）。組織學(xué)Fuhrman 分級(jí)：Ⅰ級(jí)39例，Ⅱ級(jí)44例，Ⅲ～Ⅳ級(jí)15例。淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移82 例，轉(zhuǎn)移16例。根據(jù)2009年美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）的TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)分期：Ⅰ期33 例，Ⅱ期47 例，Ⅲ～Ⅳ期18例。同時(shí)經(jīng)病理證實(shí)為正常腎組織15例作為對(duì)照組［3］。所有組織標(biāo)本均用10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，3μm 厚度連續(xù)切片。

1.2 試劑 兔抗人碳酸酐酶IX 單克隆抗體購(gòu)自Abcam 公司，山羊抗人Pten多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)A.B.ROOM 公司。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑、免疫組織化學(xué)SP法試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司，國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭┮掖?、二甲苯等，?guó)產(chǎn)磷酸鹽緩沖液（PBS）等。

1.3 方法 采用免疫組織化學(xué)SP 法：將所有標(biāo)本用10%中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，以3μm 厚度連續(xù)切片，放于多聚賴氨酸玻片上，在65 ℃烤箱中烘烤過(guò)夜，次日取出，選用二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，選用3% H2O2孵化20 min，洗滌，置于0.01mol／L枸緣酸緩沖液內(nèi)煮沸，自然冷卻，洗滌；滴入羊血清封閉，一抗，孵化過(guò)夜，洗滌；二抗，孵化30min，洗滌；滴入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，孵化30min，洗滌；BAD 染色，蘇木素復(fù)染，脫水，干燥，封片，鏡檢。

1.4 結(jié)果判斷 陰性對(duì)照為PBS 緩沖液（0.01μmol／L pH＝7.40～7.60）代替一抗，將已知表達(dá)陽(yáng)性的腎透明細(xì)胞癌組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照。碳酸酐酶IX、Pten蛋白的陽(yáng)性表達(dá)主要定位在細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞呈現(xiàn)明顯棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞。據(jù)染色細(xì)胞百分率及細(xì)胞膜染色程度進(jìn)行分析評(píng)分。（1）陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：在高倍鏡視野（×400）下，隨機(jī)選擇10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)算100 個(gè)細(xì)胞，然后計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率，4分為陽(yáng)性細(xì)胞大于75%，3分為51%～75%，2分為26%～50%，1分為陽(yáng)性細(xì)胞6%～25%，0分為小于5%。（2）染色強(qiáng)度評(píng)分：3分為棕褐色，2分為棕黃色，1分為淡黃色，0分為無(wú)色。依據(jù)兩種評(píng)分總和作出判斷：≤3分為陰性（-），4～5分為弱陽(yáng)性（＋），6～7分為強(qiáng)陽(yáng)性（＋＋）［4］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析檢驗(yàn)相關(guān)性，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 碳酸酐酶IX 與Pten蛋白在腎透明細(xì)胞癌組織和正常腎組織的表達(dá)情況 碳酸酐酶IX 與Pten蛋白在腎透明細(xì)胞癌中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為72.45%（71／98）和42.86%（42／98），碳酸酐酶IX 在正常腎組織中無(wú)一例表達(dá)，Pten蛋白在正常腎組織中100%表達(dá)，碳酸酐酶IX 與Pten蛋白在腎透明細(xì)胞癌組織和正常腎組織的表達(dá)情況差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

2.2 碳酸酐酶IX 與Pten蛋白與臨床病理特征的相關(guān)性 碳酸酐酶IX 的表達(dá)與患者年齡分布、腫瘤直徑大小、TNM 分期、Fuhrman 分級(jí)、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素?zé)o關(guān)。Pten蛋白在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)與患者年齡分布、腫瘤直徑大小因素?zé)o關(guān)，而有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在組織學(xué)Fuhrman病理分級(jí)中，Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期的陽(yáng)性表達(dá)率分別為71.79%、36.36%、0，呈遞減趨勢(shì)（r＝-0.387，P＜0.01）；在臨床分期中，Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期的陽(yáng)性表達(dá)率分別為81.82%、53.19%、5.56%，呈遞減趨勢(shì)（r＝-0.314，P＜0.01），見(jiàn)表2。

表1 碳酸酐酶IX 與Pten蛋白在腎透明細(xì)胞癌組織和 正常腎組織的表達(dá)情況［n（%）］

表2 碳酸酐酶IX 與Pten蛋白在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)情況［n（%）］

續(xù)表2 碳酸酐酶IX 與Pten蛋白在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)情況［n（%）］

3 討 論

腎透明細(xì)胞癌是臨床上最常見(jiàn)的腎臟惡性腫瘤，其發(fā)病率占腎癌的60%～85%。腎透明細(xì)胞癌的早期臨床癥狀非常隱匿，目前臨床診斷方法主要為B 超、CT、MRI等影像方法，大部分患者在初診時(shí)腎癌已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移［5］。由于腎透明細(xì)胞癌對(duì)放療及化療不敏感，臨床治療主要通過(guò)手術(shù)治療，但是已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的晚期腎癌一般過(guò)了最佳手術(shù)時(shí)間，未轉(zhuǎn)移早期進(jìn)展期腎細(xì)胞癌患者經(jīng)根治術(shù)后依然有20%～40%會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)［6］。因此對(duì)于尋找能夠預(yù)測(cè)預(yù)后、診斷、治療腎透明細(xì)胞癌的標(biāo)記分子顯得非常重要。近年來(lái)，隨著腎腫瘤分子生物學(xué)研究的快速發(fā)展，其中碳酸酐酶IX 與Pten蛋白能夠成為診斷進(jìn)展期腎細(xì)胞癌、預(yù)測(cè)預(yù)后及治療反應(yīng)的新指標(biāo)和治療的新靶點(diǎn)。

碳酸酐酶IX 是由酸性氨基酸組成的跨膜糖蛋白，為碳酸酐酶家族的一員，主要定位于細(xì)胞膜上，能可逆催化CO2水化，生成H＋和HCO3-，HCO3-與細(xì)胞內(nèi)Cl-交換來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)堿性環(huán)境，細(xì)胞內(nèi)H＋通過(guò)H＋-Na＋離子泵方式運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外，將細(xì)胞外變?yōu)樗嵝原h(huán)境［7］。碳酸酐酶IX 在大部分正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)，而在腎透明細(xì)胞癌中高表達(dá)，這也是造成腫瘤酸性微環(huán)境的形成的一個(gè)重要因素，且碳酸酐酶IX 可能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展［8］。關(guān)于透明細(xì)胞系腎細(xì)胞癌中的碳酸酐酶IX 表達(dá)是否與病理分級(jí)、臨床分期、組織學(xué)類型、轉(zhuǎn)移情況及腫瘤大小有關(guān)一直存在爭(zhēng)議。有研究結(jié)果表明腎透明細(xì)胞癌中碳酸酐酶IX 的表達(dá)與腫瘤的TMN 分期、Fuhrma病理分級(jí)或轉(zhuǎn)移情況無(wú)關(guān)。但是，楊珊珊等［9］采用Meta分析碳酸酐酶IX 高表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌Fuhrma病理分級(jí)、臨床分期的關(guān)系，得出結(jié)論為碳酸酐酶IX 高表達(dá)同透明細(xì)胞系腎細(xì)胞癌分級(jí)與分期有一定相關(guān)性，且呈負(fù)相關(guān)［9］。本文結(jié)果顯示，碳酸酐酶IX 的表達(dá)與患者年齡分布、腫瘤直徑大小、臨床分期、Fuhrman病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等因素?zé)o關(guān)，這可能與本研究方法、樣本量和研究人群及判斷方法的差異不同導(dǎo)致，本文碳酸酐酶IX 結(jié)果按陽(yáng)性、陰性區(qū)分，而不是高、低表達(dá)分開(kāi)。但是多項(xiàng)研究結(jié)果顯示碳酸酐酶IX 可以作為腫瘤分子標(biāo)記物用于進(jìn)展期腎細(xì)胞癌的預(yù)后判斷［10］。

Pten蛋白是由Pten基因編碼的一類具有磷酸酯酶活性的蛋白質(zhì)，其能拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。目前多項(xiàng)研究表明，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌、肺癌、腎癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、甲狀腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤等多種腫瘤中存在Pten基因異常，因此認(rèn)為Pten 基因一種非常重要的抑癌基因［4］。而Pten蛋白在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)情況的研究較少，本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)在98例腎透明細(xì)胞癌組織中的不同大小腫瘤、不同年齡方面的Pten蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級(jí)及臨床分期方面的Pten蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。且Pten蛋白的表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌的臨床分期、Fuhrman病理分級(jí)呈負(fù)相關(guān)（r＝-0.314，P＜0.01；r＝-0.387，P＜0.01）。因此，Pten蛋白的檢測(cè)有助于腎透明細(xì)胞癌的臨床分期、Fuhrman病理分級(jí)的判斷，其對(duì)腎透明細(xì)胞癌的診斷、治療、預(yù)后均具有重要意義。

綜上所述，碳酸酐酶IX 有助于腎透明細(xì)胞癌的診斷，Pten蛋白的表達(dá)與腎癌的臨床病理特征具有相關(guān)性，聯(lián)合檢測(cè)有助于腎癌的病情判斷及預(yù)后評(píng)估。

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