FasL及Fas LASODN在舌鱗癌細胞免疫逃逸中的作用＊

何志良，陳喬爾，王承陽，曹 雷，賀成功

（1.河北省承德市中心醫(yī)院承德醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院067000；2.安徽醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，合肥230032）

舌癌是口腔癌中第一大癌。目前仍不能準確的早期診斷和早期有效治療。對它的發(fā)病機制有學者提出了免疫監(jiān)視學說，認為免疫系統(tǒng)起了監(jiān)視機體，識別和殺傷腫瘤細胞作用，而腫瘤細胞能逃避機體的免疫監(jiān)視系統(tǒng)而無限制地生長下去。本實驗通過檢測Fas 配體（Fas L）反義寡核苷酸（ASODN）轉(zhuǎn)染舌鱗癌細胞前后，F(xiàn)as L 蛋白表達及m RNA水平的變化。從基因-蛋白-細胞效應3 個水平進行觀察，旨在進一步證實和探索舌鱗癌細胞通過Fas／FasL 途徑的免疫抑制機制及探討反義寡核苷酸能否通過有效封閉細胞表面Fas L表達，使舌鱗癌細胞誘導T細胞凋亡的能力減弱，為尋找免疫治療的新的靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器及材料Jurkat 細胞株為中國典型培養(yǎng)物保藏中心產(chǎn)品；SCC-9 細胞株來自美國ATCC產(chǎn)品，RPMI-1640 培養(yǎng)液、DMEM／F12 培養(yǎng)液為美國HyClone 公司產(chǎn)品，PE標記的小鼠抗人Fas 抗體，PE標記的小鼠抗人Fa s L抗體為美國eBioscience 公司產(chǎn)品，小鼠抗人Fas L 中和性抗體NOK-2 為美國BD公司產(chǎn)品，流式細胞儀為美國Beckman Coulter 公司產(chǎn)品，熒光定量PCR儀為美國Applied Biosystems 公司產(chǎn)品，紫外分光光度儀為尤尼柯儀器有限公司產(chǎn)品，熒光倒置顯微鏡為日本Olympus 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 寡核苷酸鏈的序列合成 參考文獻［1］完成，合成FasL ASODN 5′-CTC TCG GAG TTC TGC CAG CT-3′；正義寡脫 氧 核 苷 酸（SODN）5′-AGC TGG CAG AAC TCC GAG AG-3′；對每條序列兩端的各3個堿基進行硫代磷酸化修飾，對5′端進行FAM綠色熒光標記。

1.2.2 細胞培養(yǎng)SCC-9細胞應用含10%胎牛血清的DMEM／F12 培養(yǎng)液，在37 ℃、5%CO2的條件下進行培養(yǎng)［2］，含有0.02%乙二胺四乙酸的0.25%胰蛋白酶消化傳代；人急性T細胞白血病細胞系Jurkat 細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)，1～2d 換液1 次，相差顯微鏡下觀察細胞聚集成團時將細胞懸液按1∶4 傳代培養(yǎng)。待細胞生長至對數(shù)生長期開始實驗。

1.2.3 Jurkat 細胞Fas 蛋白表達量檢測 采用FCM檢 測Jurkat 細胞Fas 蛋白表達量，取對數(shù)生長期的Jurkat 細胞，陰性對照（同型對照）和實驗組；每組3 個復孔，1000r／min 離心5 min 收集細胞，倒掉培養(yǎng)基，PBS 洗1 次，調(diào)整細胞濃度為1 ×106個／mL。分別加入同型抗體、Fas-PE 抗體，4 ℃下避光反應達30 min；PBS 清洗1 次，再加入PBS 500μL 作流式細胞儀檢測［3］。以FSC／SSC 設門，獲取門內(nèi)細胞104個，以對數(shù)放大熒光強度，并將光散射數(shù)據(jù)存盤，使用Win MDI 軟件進行分析。每個指標重復檢測3 次。

1.2.4 舌鱗癌細胞FasL 功能檢測 調(diào)SCC-9 細胞為1 ×106個／m L，每孔取1 m L接種至6 孔培養(yǎng)板，當孔底有80%以上被單層細胞覆蓋時，則將培養(yǎng)液去除，并沖洗板孔，分組檢測。實驗1 組（A組）：SCC-9 細胞每孔加1 ×106 個／mL Jurkat 細胞400μL；實驗2 組（B 組）：SCC-9 細胞每孔加400μL FasL 中和抗體NOK-2，濃度為10μg／mL，孵育1 h 后加400μL Jurkat細胞［2］；對照1 組（C組）：單 獨培養(yǎng)Jur kat 細胞；對照2組（D組）：Jurkat 細胞加400μL NOK-2。每組設置3 個復孔，各補充培養(yǎng)液至2 mL，培養(yǎng)24 h 后收集懸浮的Jurkat 細胞，再以PBS 清洗2 次，將細胞以1 ×106 個／mL重懸于1 ×Annexin ⅤBinding Buffer 中。另取試管1支，將其中100μL移至其中，分別加入PI 10μL，Annexin Ⅴ-FITC 5μL，輕輕混勻，在常溫下避光孵育15 min，再加入400μL 1 ×Annexin ⅤBinding Buffer，進行FCM檢測，定量分析細胞凋亡［4］。以FSC／SSC設門，獲取門內(nèi)細胞2 ×104 個，以對數(shù)放大熒光強度，并將光散射數(shù)據(jù)存盤，使用Win MDI 軟件進行分析。

1.2.5 SCC-9細胞轉(zhuǎn)染效率檢測 采用流式細胞術檢測SCC-9 細胞轉(zhuǎn)染效率，當細胞轉(zhuǎn)染12h，以PBS 沖洗6 孔培養(yǎng)板板孔，2 次／孔，而后每孔加入0.25%胰蛋白酶1 m L，在顯微鏡下觀察，待細胞間隙增大，加入含血清的培養(yǎng)基，收集細胞，并將其置于流式細胞管中，以PBS洗2次，細胞濃度調(diào)整為1 ×106 個／mL，以PBS 500μL 重懸細胞［5］，進行流式細胞術檢測。通過檢測選出ASODN和Lipo-fectamineTM 2000的最佳轉(zhuǎn)染比例［6］，為后續(xù)試驗提供依據(jù)。

1.2.6 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測Fas L ASODN／SODN作用前后Fa s LmRNA水平的變化 （1）抽提總RNA：收集FasL ASODN／SODN轉(zhuǎn)染濃度為0.4μmol／L，作用24 h 的處理組及對照組細胞，抽提總RNA［2］。①細胞（＞1 ×106）用PBS 清洗2 次，移入eppendrof 管中。②于細胞沉淀中加入1 m L Trizol Reagent 吹打均勻，置于室溫環(huán)境5 min，使其充分裂解。放入離心機，12000 ×g，離心5 min，棄沉淀。③加入氯仿200μL，輕微震蕩搖振15 s，冰上放置5 min。④4 ℃，12000 ×g，離心15min，另取1 支eppendrof 管，取上層水相置入。⑤加入異丙醇500μL，混勻后于室溫下放置10 min。⑥4 ℃，12000 ×g，離心10 min，上清液棄之，沉淀為RNA。⑦用焦碳酸二乙酯（DEPC）水配置75%乙醇1 m L，搖振后充分洗滌、沉淀，4 ℃，8000 ×g，5 min，上清液棄之，重復洗滌1次。⑧上清液棄之，置于無菌干燥環(huán)境10 min，加入100μL 無核糖核酸酶（Rnase）的水，沉淀重懸［7］，-80 ℃保存?zhèn)溆?。?）RNA定量：取上述樣品，用DEPC水將樣品稀釋100 倍，并以DEPC 水作空白管調(diào)零；用紫外分光光度儀檢測260 nm和280 nm吸光度（A），計算RNA濃 度，公式為RNA濃度（μg／μL）＝A260×40 ×稀釋倍數(shù)／1000［8］。（3）逆轉(zhuǎn)錄過程（反應體系為20μL）：①將1μg 總RNA加入微量離心管中，并于70℃溫育10 min，短暫離心后置于冰上備用。②依照所列順序加入以下試劑，建立一個20μL的反應體系。（4）熒光定量PCR結(jié)果定量分析：目的基因的表達量采用相對定量法計算結(jié)果：相對含量（%）＝2-△△Ct-△△Ct＝（目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct）對照組-（目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct）實驗組。

1.2.7 流式細胞術檢測Fas L ASODN／SODN作用前后Fas L蛋白表達量的變化消化并收集0.4 μmol／L的Fas LASODN／SODN轉(zhuǎn)染并作用24 h的SCC-9細胞。實驗分為4組：脂質(zhì)體組（轉(zhuǎn)染時僅加脂質(zhì)體）、正義鏈組（以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染SODN）、反義鏈組（以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染ASODN）、空白對照組（細胞不進行轉(zhuǎn)染），每組各3 個復管，1 ×106 個細胞／管；以PBS 清洗2 次，細胞沉淀加入100μL PBS，吹打混勻，PE 標記的FasL 抗體5μL，輕輕吹打，混勻。陰性對照組采用同型對照代替一抗，將其置于4 ℃避光環(huán)境30 min［9］；以PBS 清洗1 次，加500 μL PBS，采取流式細胞儀進行檢測。以FSC／SSC設門，獲取門內(nèi)細胞104個，以對數(shù)放大熒光強度，并將光散射數(shù)據(jù)存盤，使用Win MDI 軟件進行分析。

1.2.8 FCM檢測Fas LASODN／SODN作用后SCC-9 細胞與Jurkat 細胞共同培養(yǎng)后Jurkat 細胞凋亡率的變化 胰酶消化收集細胞，PBS 清洗2 次，調(diào)細胞濃度1 ×106 個／m L；以每孔2 m L接種于六孔板中，24 h后，用0.4 μmol／L的Fas L ASODN／SODN轉(zhuǎn)染液轉(zhuǎn)染六孔板中的SCC-9 細胞，并設空白對照組及脂質(zhì)體對照組，分別作用48 h 后，以含10%胎牛血清的PMRI-1640 調(diào)整Jurkat 細胞濃度為2 ×105 個／m L，加入不同處理組和對照組SCC-9 細胞中，每孔2mL［5］，培養(yǎng)24h 后收集 懸 浮Jurkat細胞，以PBS清洗2次，將細胞重懸于500μL ×Annexin V Binding Buferr 之中，與Annexin V-FITC 5 μL 混勻后，加入濃度為250μg／m L的碘化丙啶（PI）5μL，混勻，置于室溫避光環(huán)境10 min。隨后上機分析，光源為448 nm氬離子激光器，F(xiàn)ITC 受激發(fā)后現(xiàn)綠色熒光，PI 現(xiàn)紅色熒光，每份標本收集細胞104個［10］。結(jié)果判斷標準見參考文獻［11］：（1）FITC-／PI-為活細胞；（2）FITC＋／PI-為早期凋亡細胞；（3）FITC＋／PI＋為晚期凋亡細胞；（4）FITC-／PI＋為壞死細胞。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0 統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料以±s表示，兩組間均數(shù)比較采用t 檢驗，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用方差分析及q檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 熒光顯微鏡下觀察細胞的轉(zhuǎn)染情況及流式細胞術檢測的轉(zhuǎn)染效率 轉(zhuǎn)染6 h 后，通過熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染的情況，并在轉(zhuǎn)染12 h后用流式細胞術檢測細胞效率，0.1、0.2、0.4、0.8μmol／L ASODN的轉(zhuǎn)染效率分別為66.5%、72.6%、99.7%、99.8%。研究結(jié)果表明，將脂質(zhì)體定量，通過流式細胞術檢測及倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，隨著FasL ASODN的濃度在一定范圍內(nèi)增加，其轉(zhuǎn)染效率也隨之增加。當濃度為0.4 μmol／L 和0.8μmol／L 時，轉(zhuǎn)染效率均為100%左右。圖1A、圖1D分別為0.4μmo l／LASODN與0.8μmo l／LASODN轉(zhuǎn)染后的眀視野圖；圖1B、圖1E中箭頭標注為熒光顯微鏡下綠色熒光的細胞即為轉(zhuǎn)染成功的細胞。

2.2 MTT 法檢測FasL ASODN轉(zhuǎn)染前后對腫瘤細胞增殖的影響FasL ASODN的濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.8μmol／L，采用MTT 法檢測不同時間段對SCC-9 細胞的增殖的影響。與空白對照組比較，除0.1μmol／L ASODN外，各反義鏈組24 h的抑制率均有明顯的抑制作用（P＜0.05）；各反義鏈組48 h 抑制率與空白對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且隨著ASODN 濃度的升高，抑制作用不斷增加，見表1。

圖1 FAM綠色熒光標記的Fa s LASODN轉(zhuǎn)染結(jié)果示意圖（×200）

圖2 Fas L ASODN對SCC-9 細胞凋亡的影響

表1 FasL ASODN對SCC-9 細胞增殖的影響（±s，n＝3）

表1 FasL ASODN對SCC-9 細胞增殖的影響（±s，n＝3）

a：P＜0.05，與空白對照組比較。

組別 抑制率（%）24 h 48 h空白對照組00脂質(zhì)體組 -2.091±1.1121.214±1.531反義鏈組（μmol／L）0.12.319±1.52010.058±0.899a 0.210.518±1.019a 12.022±1.251a 0.413.779±1.318a 36.109±1.781a 0.824.370±1.138a 52.169±1.253a正義鏈組（μmol／L）0.40.170±1.7585.854±1.060

2.3 FasL ASODN誘導SCC-9 細胞的凋亡率的變化 轉(zhuǎn)染6 h 后，通過倒置顯微鏡進行觀察發(fā)現(xiàn)反義鏈組細胞產(chǎn)生凋亡作用，且與空白對照組相比明顯增高。轉(zhuǎn)染FasL ASODN 24 h后，流式細胞術檢測舌鱗癌細胞的凋亡發(fā)現(xiàn)各組間凋亡率無明顯的差異。而轉(zhuǎn)染48 h 后，與空白對照組比較的結(jié)果，同與脂質(zhì)體組比較的結(jié)果相一致，即反義鏈組除早期凋亡率外，其余各項指標差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；反義鏈組與正義鏈組比較，其晚期凋亡率、總凋亡率、總病死率差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖2。

3 討 論

研究表明，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與細胞的過度增殖［12］和凋亡的減少有 關［13］，1989年，Yonehara 等［14］發(fā) 現(xiàn)了Fas 系統(tǒng) 及其誘導多種人細胞系發(fā)生凋亡的特性，使其成為重要的凋亡基因之一。腫瘤細胞存在多種免疫逃逸機制，而Fas／Fas L系統(tǒng)則在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮著極其重要的作用。腫瘤細胞既可以通過Fas／FasL 系統(tǒng)反擊免疫細胞促進T細胞凋亡，從而使腫瘤細胞逃避效應細胞的殺傷和攻擊，實現(xiàn)免疫逃逸；還能夠通過基因突變、異常轉(zhuǎn)錄等方式低表達及不表達Fas 分子，或者表達無功能的Fas，抵抗細胞毒T淋巴細胞（CTL）的殺傷機制，參與免疫逃逸［15］。研究表明，腫瘤細胞對于Fas L觸發(fā)信號凋亡的敏感性，主要依賴于自身表面正常Fas 蛋白的表達水平，同時也依賴于自然殺傷細胞（NK）和CTL細胞表面正常FasL 蛋白的表達［16］。以往有研究認為，F(xiàn)as L 表達的升高與腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移有著密切的關系，很多惡性腫瘤中都存在Fas L 表達升高的現(xiàn)象，如結(jié)腸癌、胰腺癌、胃癌等，其腫瘤細胞表面均存在Fas L 表達，它能夠使周圍正常表達Fa s 的細胞凋亡，或者使浸潤到腫瘤內(nèi)的腫瘤浸潤性淋巴細胞（TIL）凋亡，F(xiàn)asL 通過與激活的T細胞表面F a s 相結(jié)合來誘導T細胞凋亡［17］，反擊宿主免疫系統(tǒng)，從而實現(xiàn)腫瘤細胞逃避免疫活性細胞的監(jiān)視，促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。口腔鱗狀細胞癌是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，目前口腔癌患者中有45.9%得的是舌癌，是口腔癌中第一大癌［18］。目前手術治療是治療舌癌的主要手段。但術后會引起進食、吞咽或言語困難等。而由于放療化療沒有辨別能力，所以需要重復放、化療，多次放、化療以后，患者免疫功能下降，抵抗力降低，容易轉(zhuǎn)移，因此免疫治療、基因治療等新興治療手段應運而生。陳喬爾等［19］的研究顯示，健康人口腔黏膜的Fas L 為陰性表達，鱗癌組織的Fas L陽性表達率則高達60.5%，而鱗癌組織中TIL的Fas 陽性表達率可高達81.6%，表明口腔鱗癌中存在著Fas／Fas L的表達異常。經(jīng)過進一步的研究發(fā)現(xiàn)并證實，從健康人口腔黏膜→異常增生→口腔鱗癌的發(fā)展過程中，F(xiàn)as L表達表現(xiàn)為逐漸增高［20］。此外，這一研究結(jié)果提示Fas 系統(tǒng)介導的凋亡異常對于口腔鱗癌的發(fā)生、發(fā)展具有重要作用，說明Fas 系統(tǒng)介導的腫瘤逃逸存在于口腔腫瘤中，那么，通過下調(diào)Fas L的表達，則可有效地降低腫瘤細胞的抗凋亡能力，免疫逃逸也有望得以逆轉(zhuǎn)，這一結(jié)論無疑為后續(xù)研究提供了重要理論依據(jù)。

本研究中，將脂質(zhì)體定量，通過流式細胞術檢測及倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，隨著FasL ASODN的濃度在一定范圍內(nèi)增加，其轉(zhuǎn)染效率也隨之增加。結(jié)果顯示，濃度為0.4μmol／L和0.8μmol／L 時，轉(zhuǎn)染效率均接近100%，因此選用0.4μmol／L Fas L ASODN進行后續(xù)試驗的檢測。研究結(jié)果顯示，脂質(zhì)體組和SODN對SCC-9 細胞的增殖并未發(fā)生抑制作用，不同濃度的FasL ASODN對SCC-9 的增殖存在不同程度的抑制作用，且Fas L ASODN對SCC-9 增殖的抑制作用有一定的濃度依賴性和時間依賴性，即隨著時間的延長和ASODN濃度的增加，F(xiàn)asL ASODN對SCC-9 細胞的抑制作用也增加。流式細胞儀的檢測顯示，反義組與脂質(zhì)體組、正義組、空白組比較，晚期凋亡率、總凋亡率及總病死率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而早期凋亡率之間雖有變化，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），這可能因為檢測凋亡時間為轉(zhuǎn)染后48 h，造成作用時間相對過長，致使早期凋亡多已發(fā)展為晚期凋亡。筆者認為，F(xiàn)as L ASODN可以促進舌鱗癌細胞SCC-9 的凋亡，究其原因，是與其逃避免疫系統(tǒng)殺傷的途徑有關，研究表明，腫瘤細胞不僅可以通過上調(diào)Fas L表達主動殺傷侵入腫瘤內(nèi)的T細胞凋亡，且能夠通過產(chǎn)生可溶性的sFasL與自身Fas 結(jié)合，從而封閉Fas 的結(jié)合位點，實現(xiàn)降低腫瘤細胞自身的凋亡［21］，同時使腫瘤周圍正常的細胞產(chǎn)生凋亡；這就是腫瘤細胞逃避免疫細胞Fas 途徑攻擊并形成腫瘤侵襲的機制之一，且Fas／FasL相互作用不但能引起細胞凋亡，也能引起細胞壞死。此即為本研究中Fas L ASODN能夠?qū)CC-9 的增殖活性產(chǎn)生抑制以及誘導其凋亡的原因之一，然而由于Fas 系統(tǒng)介導的凋亡及非凋亡機制較廣泛且復雜，具體的機制尚需要進一步研究。

綜上所述，本研究從宏觀效應方面證明了FasL ASODN對于舌鱗癌細胞SCC-9 的增殖具有明顯的抑制作用，體現(xiàn)了其對于舌癌治療方法探索的重要價值，為后續(xù)研究提供了方向。從理論方面分析，通過減低Fas L的表達，能夠減少舌鱗癌細胞對免疫細胞及周圍正常細胞的殺傷作用，從而降低其轉(zhuǎn)移與浸潤作用。FasL ASODN具體的作用機制及其作用效應有待進一步深入探討。

［1］ Ji J，Wernli M，Buechner S，et al.Fas ligand downregulation with antisense oligonucleotides in cells and in cultured tissues of normal skin epidermis and basal cell carcinoma［J］.J Invest Dermatol，2003，120（6）：1094-1099.

［2］ 張嬌，劉倩，王杰，等.Fas L反義寡核苷酸逆轉(zhuǎn)肝癌細胞免疫逃逸的實驗研究［J］.中國現(xiàn)代普通外科進展，2006，9（3）：147-150.

［3］ 康敏，鐘德君，李鵬，等.Fas／FasL 信號傳導通路對NAFLD大鼠肝細胞凋亡的影響［J］.重慶醫(yī)學，2011，40（7）：633-635.

［4］ 方麗，陳喬爾.Fas L 的反義基因在腫瘤治療中的作用［J］.安徽醫(yī)藥，2013，17（3）：370-372.

［5］ 方麗，陳喬爾，任翠平，等.Fas L反義寡核苷酸對舌鱗癌細胞Tca8113 增殖和凋亡的影響［J］.安徽醫(yī)科大學學報，2012，47（11）：1300-1303.

［6］ 路秀英，王垚，李曉明.低氧條件下Stat3 反義寡核苷酸對喉癌細胞Hep-2的化療增敏作用［J］.中國癌癥防治雜志，2013，5（4）：308-311.

［7］ Zheng J，F(xiàn)u R，Li J，et al.CpG oligonucleotides suppress Hep G2 cells-induced Jurkat cell apoptosis via the Fas-Fas L-mediated pathway［J］.J Exp Clin Cancer Res，2011，30（1）：48-54.

［8］ 李廣章，劉長劍，湯欣.PKC-δ在TRAIL 與阿霉素聯(lián)合誘導骨肉瘤細胞株MG-63 凋亡中的作用［J］.中國骨腫瘤骨病，2011，10（3）：281-284，310.

［9］ 祖谷，陳喬爾，胡芳芳，等.Fas 基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合應用順鉑對舌鱗癌細胞的殺傷作用［J］.安徽醫(yī)科大學學報，2011，46（9）：890-892，896.

［10］ 劉海威，程樂，吳非，等.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染survivin 反義寡核苷酸對人胰腺癌細胞凋亡的影響［J］.中國普外基礎與臨床雜志，2010（10）：1056-1061.

［11］ 郭唐猛，楊群芳，劉承云，等.大鼠心肌缺血再灌注損傷SOCS-1／3 m RNA的 表 達 和 意 義［J］.醫(yī) 學 研 究 雜 志，2011，40（4）：89-92.

［12］ 張薇.口腔鱗癌細胞Fas／Fas L 的表達及對癌細胞凋亡的影響［J］.皖南醫(yī)學院學報，2010，29（2）：92-95.

［13］ Shatnyeva OM，Kubarenko AV，Weber CE，et al.Modulation of the CD95-induced apoptosis：the role of CD95 Nglycosylation［J］.PLoS One，2011，6（5）：e19927.

［14］ Yonehara S，Ishii A，Yonehara M.A cell-killing monoclonal antibody（anti-Fas）to a cell surface antigen codownregulated with the receptor of tumor necrosis factor［J］.J Exp Med，1989，169（5）：1747-1756.

［15］ Southwell AL，Skotte NH，Bennett CF，et al.Antisense oligonucleotide therapeutics for inherited neurodegenerative diseases［J］.Trends Mol Med，2012，18（11）：634-643.

［16］ 江磊，林泓磊，張長源，等.口腔臨床常用烤瓷合金對小鼠肺成纖維細胞體外毒性研究［J］.中國實用口腔醫(yī)學，2012，5（10）：600-609．

［17］ 王紅梅，張國強，戴紀綱，等．人淋巴瘤細胞Jurkat通過Fas／FasL途徑抑制人肺癌細胞A549的免疫逃逸［J］．中國肺癌雜志，2010（7）：681-685．

［18］ 金成日，金彬，玄云澤．Ki-67和Bcl-2在延邊地區(qū)口腔鱗狀細胞癌患者中的表達及其意義［J］．重慶醫(yī)學，2012，41（31）：3316-3318．

［19］ 陳喬爾，王元銀，李倩，等．口腔黏膜癌前病變和口腔鱗癌組織Fas／FasL 的表達及其意義［J］．臨床口腔醫(yī)學雜志，2006，22（7）：413-416．

［20］ 李俊玫，楊寧，王行天，等．野黃芩苷對人舌鱗癌Tca8113細胞周期及Fas蛋白表達的影響［J］．實用口腔醫(yī)學雜志，2013，29（2）：250-252．

［21］ Fang L，Sun L，Hu FF，et al．Effect of FasL expression in oral squamous cell cancer［J］．Asian Pacific J Cancer Prev，2013，14（1）：281-285．