青蒿素對(duì)肝癌細(xì)胞株Hep G2細(xì)胞增殖的影響＊

黃俊玲，李廣志，黃贊松，2△，尹毅霞，周喜漢，覃月秋

（1.右江民族醫(yī)學(xué)院消化疾病研究所／附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，廣西百色533000；2.廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，南寧530021）

青蒿素是中藥黃花蒿中提取的含有過(guò)氧基團(tuán)的倍半萜內(nèi)酯類藥物，二氫青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚、蒿乙醚等是青蒿素的重要衍生物。黃花蒿為我國(guó)一種傳統(tǒng)的中藥，其提取物青蒿素及其衍生物具有很強(qiáng)的抗瘧疾、抗白血病和免疫調(diào)節(jié)功能的作用，已經(jīng)廣泛用于治療瘧疾。近年來(lái)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)青蒿素具有抗腫瘤活性，可以抑制腫廇細(xì)胞的增殖，而且對(duì)正常細(xì)胞未見明顯影響，不良反應(yīng)小，其潛在的抗癌活性越來(lái)越受到關(guān)注，成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一［1-6］。研究還發(fā)現(xiàn)，青蒿素對(duì)胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、白血病、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌等腫瘤細(xì)胞都具有一定的增殖抑制或殺傷作 用［1，2，5，7］，但對(duì)肝癌的作用研究甚少。因此，本研究旨在觀察青蒿素對(duì)肝癌細(xì)胞株Hep G2 細(xì)胞增殖抑制作用、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞活力的影響，為青蒿素作為一種新的抗肝癌中藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 人肝癌Hep G2 細(xì)胞株，購(gòu)于中科院上海細(xì)胞生物研究所。

1.1.2 試劑與儀器 青蒿素由西安森卓生物科技有限公司提供；RPMI-1640 增養(yǎng)液由賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司提供；小牛血清GIBICO公司提供；PBS 緩沖液（1 ×）由北京索萊寶科技有限公司提供；胰酶-EDTA混合液、青鏈霉素混合液（100 ×）由北京索萊寶科技有限公司提供；噻唑藍(lán)（MTT）由Amresco 公司提供；二甲基亞楓（DMSO）由北京索萊寶科技有限公司提供；周期試劑盒和凋亡試劑盒均由美國(guó)BD Biosciences 提供；全自動(dòng)酶標(biāo)儀Multiskan MK3（USA）；BD FACSCantoⅡTM（USA）流式細(xì)胞儀。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組 體外培養(yǎng)人肝癌HepG2 細(xì)胞，以含100 U／m L青 霉素，100 U／mL鏈霉素，10%FBS的RPMI-1640 培養(yǎng)液在37 ℃5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取生長(zhǎng)良好并處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2 細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分成對(duì)照組及青蒿素組。

1.2.2 MTT法檢測(cè)青蒿素對(duì)細(xì)胞增殖抑制率的影響 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep G2 細(xì)胞，細(xì)胞濃度為1 ×104個(gè)／L，按每孔100μL／孔接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待4h 細(xì)胞貼壁后，分別加入預(yù)先制備好的含青蒿素20、40、60、80、160、200μmol／L的完全培養(yǎng)液，每孔設(shè)4 個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組加等量的RPMI-1640培養(yǎng)液。分別培養(yǎng)20、44、68 h 后，每孔加入MTT（5 mg／m L）20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸取并丟棄上清液，每孔加入150μL DMSO，于恒溫振蕩儀中以100 r／min 避光室溫下振蕩10 min，最后在酶標(biāo)儀中以波長(zhǎng)為490 nm測(cè)定每孔光密度（D值）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4 次，按公式計(jì)算出細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，以青蒿素各濃度組為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)繪制抑制曲線，抑制率（%）＝（1-D實(shí)驗(yàn)組／D對(duì)照組）×100%

1.2.3 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡情況 于75 cm培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)HepG2 細(xì)胞，以MTT結(jié)果選有效藥物濃度80 μmol／L 青蒿素處理48h 后，胰酶消化、離心并收集實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞。按細(xì)胞周期試劑盒及凋亡試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行操作，最后上機(jī)檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用±s表示，采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MTT法檢測(cè)青蒿素作用于HepG2 細(xì)胞增殖影響及繪制細(xì)胞增殖抑制率 青蒿素對(duì)Hep G2 細(xì)胞有增殖抑制作用且呈現(xiàn)量效、時(shí)間依賴性。同一作用時(shí)間的藥物濃度越高，細(xì)胞增殖抑制率也隨著增高；同一藥物濃度的不同作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖抑制率也隨著增高。不同青蒿素濃度之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；不同作用時(shí)間相比較，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 青蒿素對(duì)Hep G2 細(xì)胞的抑制作用（±s，μmol／L）

表1 青蒿素對(duì)Hep G2 細(xì)胞的抑制作用（±s，μmol／L）

作用時(shí)間青蒿素濃度（μmol／L）40608016020024 h 9.49±3.5214.63±1.8519.31±4.7329.01±1.7035.07±4.1948 h 19.38±1.6325.38±1.1133.27±2.0038.88±3.0046.12±1.1372 h 26.61±1.6436.21±2.9746.83±1.7554.62±3.4758.47±0.73

2.2 青蒿素對(duì)Hep G2 細(xì)胞增殖抑制率 用高倍顯微鏡觀察80μmol／L 青蒿素對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖抑制率的影響。青蒿素對(duì)HepG2 細(xì)胞有增殖抑制作用，可使腫瘤細(xì)胞發(fā)生腫脹、縮小、裂解、壞死，作用時(shí)間愈長(zhǎng)愈明顯，其鏡下表現(xiàn)見圖1。

圖1 高倍顯微鏡下細(xì)胞生長(zhǎng)情況（×100）

2.3 青蒿素對(duì)Hep G2細(xì)胞細(xì)胞周期的影響 檢測(cè)80 μmol／L 青蒿素作用HepG2 細(xì)胞48h 后，與對(duì)照組相比，可使細(xì)胞周期明顯阻滯于G0／S期。兩組之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2、圖2。

表2 80μmol／L 青蒿素作用于HepG2 細(xì)胞48h 對(duì)細(xì)胞周期的影響（±s，μmol／L）

表2 80μmol／L 青蒿素作用于HepG2 細(xì)胞48h 對(duì)細(xì)胞周期的影響（±s，μmol／L）

組別細(xì)胞周期G0／G1期 S期 G2／M期64.57±2.2411.25±2.1624.18±2.22青蒿素組對(duì)照組71.08±1.9812.05±1.4716.87±1.52

圖2 80μmol／L 青蒿素作用于HepG2細(xì)胞48 h 流式細(xì)胞周期檢測(cè)圖

2.4 青蒿素對(duì)HepG2 細(xì)胞凋亡的影響 檢測(cè)80μmol／L青蒿素作用Hep G2 細(xì)胞，使細(xì)胞發(fā)生凋亡，在雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)圖中Q1（Annexin V-／PI＋）代表壞死細(xì)胞；Q2（An nexin V＋／PI＋）代表晚期凋亡細(xì)胞和繼發(fā)壞死細(xì)胞；Q3（Annexin V＋／PI-）代表早期凋亡的細(xì)胞；Q4（Annexin V-／PI-）代表正常活細(xì)胞，在本實(shí)驗(yàn)中可見藥物作用后其凋亡實(shí)相發(fā)生于早期凋亡及晚期凋亡，兩組之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3、圖3。

表3 80μmol／L 青蒿素作用于HepG2 細(xì)胞48 h對(duì)細(xì)胞凋亡的影響（±s，μmol／L）

表3 80μmol／L 青蒿素作用于HepG2 細(xì)胞48 h對(duì)細(xì)胞凋亡的影響（±s，μmol／L）

象限組別Q1 Q2 Q3 Q4對(duì)照組1.55±0.072.00±0.362.43±0.2489.10±0.61青蒿素組1.62±0.232.95±0.145.71±0.3187.10±0.51

圖3 檢測(cè)80μmol／L 青蒿素作用于HepG2 細(xì)胞48 h 的流式細(xì)胞凋亡圖

3 討 論

肝癌是消化系惡性腫瘤，其細(xì)胞增殖能力極強(qiáng)，惡性程度高［8］。目前肝癌的主要治療方法是手術(shù)切除、肝移植，但手術(shù)切除后的復(fù)發(fā)率高，晚期肝癌治療是以化療為主，而目前肝癌對(duì)西藥常用化療藥物極易出現(xiàn)多重耐藥性［9］。因此探索抗癌中藥是目前治療肝癌的非手術(shù)治療途徑之一，中藥治療肝癌具有一定優(yōu)勢(shì)［10］。本實(shí)驗(yàn)就青蒿素對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響進(jìn)行進(jìn)一步研究。

青蒿素是從中藥植物黃花蒿中提取的一種生物有效成分，其在抗瘧疾治療上有確切的療效，青蒿素抗瘧疾的作用機(jī)制是通過(guò)鐵離子介導(dǎo)而形成內(nèi)過(guò)氧化橋，并產(chǎn)生活性氧離子（ROS）和以碳為核心的自由基，后者的作用是能使細(xì)胞發(fā)生分子損傷和細(xì)胞死亡。鐵是細(xì)胞內(nèi)的重要元素，特別在增殖旺盛的癌細(xì)胞中含量極其豐富，在一定條件下高價(jià)態(tài)的鐵可轉(zhuǎn)變?yōu)閬嗚F狀態(tài)。惡性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中需要大量的Fe2＋作為合成去氧核糖的原料，因此癌細(xì)胞表面存在著大量的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白受體。肝癌細(xì)胞作為一種惡性腫瘤細(xì)胞，其Fe2＋含量要較正常肝細(xì)胞大得多，并且鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白受體只存在于惡性瘤細(xì)胞的表面，因此利用青蒿素與癌細(xì)胞的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白受體結(jié)合，可起到靶位點(diǎn)的作用，從而提高藥物在腫瘤細(xì)胞中的濃度而起到毒殺作用［11-12］。鄧小榮等［13］的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，青蒿素可使肝癌細(xì)胞發(fā)生死亡，在癌細(xì)胞中加入全轉(zhuǎn)鐵蛋白后，敏感性有所增強(qiáng)，故青蒿素對(duì)人肝癌細(xì)胞的選擇性增強(qiáng)，毒性強(qiáng)于對(duì)照組。Singh 等［14］已經(jīng)成功地用Fe2＋青蒿素處理人白血病Mol-t4 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)它可以有選擇性且有效地殺滅腫瘤細(xì)胞，而青蒿素對(duì)正常細(xì)胞幾乎無(wú)毒性。因此，青蒿素與腫瘤細(xì)胞結(jié)合具有一定的靶向性。

本研究用流式細(xì)胞術(shù)分析青蒿素作用48 h 對(duì)細(xì)胞周期及凋亡影響的結(jié)果顯示：與陰性對(duì)照組相比，G0／G1期、S期細(xì)胞比例增高，而G2／M期比例下降，表明青蒿素可阻滯細(xì)胞周期使癌細(xì)胞生長(zhǎng)出現(xiàn)停滯。說(shuō)明青蒿素類藥物可以阻滯細(xì)胞周期，使細(xì)胞停止生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)生凋亡，但具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)青蒿素作用于HepG2 細(xì)胞，使細(xì)胞發(fā)生凋亡，其凋亡實(shí)相發(fā)生于早期凋亡及晚期凋亡。Disbrow等［15］經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，二氫青蒿素和青蒿琥酯對(duì)HeLa 細(xì)胞具有較強(qiáng)的毒性作用，其機(jī)制是通過(guò)激活線粒體Caspase 途徑起到誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。Dell′Eva 等［16］還證實(shí)，青蒿琥酯可以誘導(dǎo)Kaposi 肉瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，并呈現(xiàn)出劑量依賴性，而正常細(xì)胞并不被青蒿琥酯誘導(dǎo)凋亡。董海鷹等［17］用青蒿素處理HeLa細(xì)胞后得出，HeLa 細(xì)胞發(fā)生凋亡，并在電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中可見到典型的凋亡小體，而且細(xì)胞凋亡率在一定范圍內(nèi)與藥物濃度（20～80μmol／L）呈正相關(guān)。因此青蒿素類藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，青蒿素對(duì)肝癌HepG2 細(xì)胞具有抑制增殖作用，其機(jī)制可能為與細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合而提高青蒿素在肝癌細(xì)胞中的含量，進(jìn)一步阻滯肝癌細(xì)胞于G0／S期，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡而起到抗肝癌的作用。說(shuō)明青蒿素具有潛在的抗肝癌治療的作用，但其確切作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究及探討。

［1］ Efferth T，Sauerbrey A，Olbrich A，et al.Molecular modes of action of artesunate in tumor cell lines［J］.Mol Pharmacol，2003，64（2）：382-394.

［2］ Lu JJ，Meng LH，Cai YJ，et al.Dihydroartemisinin induces apoptosis in HL-60 leukemia cells dependent of iron and p38 mitogen-activated protein kinase activation but independent of reactive oxygen species［J］.Cancer Biol Ther，2008，7（7）：1017-1023.

［3］ Lu JJ，Chen SM，Zhang XW，et al.The anti-cancer activity of dihydroartemisinin is associated with induction of irondependent endoplasmic reticulum stress in colorectal carcinoma HCT116 cells［J］.Invest New Drug，2011，29（6）：1276-1283.

［4］ Lu JJ，Meng LH，Shankavaram UT，et al.Dihydroartemisinin accelerates c-MYC oncoprotein degradation and induces apoptosis in c-MYC-overexpressing tumor cells［J］.Biochem Pharmacol，2010，80（1）：22-30.

［5］ Hou J，Wang D，Zhang R，et al.Experimental therapy of hepatoma with artemisinin and its derivatives：in vitro and in vivo activity，chemosensitization，and mechanisms of action［J］.Clin Cancer Res，2008，14（17）：5519-5530.

［6］ Chen T，Li M，Zhang R，et al.Dihydroartemisinin induces apoptosis and sensitizes human ovarian cancer cells to carboplatin therapy［J］.J Cell Mol Med，2009，13（7）：1358-1370.

［7］ Wang SJ，Gao Y，Chen H，et al.Dihydroartemisinin inactivates NF-kappaB and potentiates the anti-tumor effect of gemcitabine on pancreatic cancer both in vitro and in vivo［J］.Cancer Lett，2010，293（1）：99-108.

［8］ 黃贊松，仇儀英，周喜漢.原發(fā)性肝癌現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2012，18（24）：4169-4172.

［9］ 金小順，耿小平，朱立新.肝癌多藥耐藥的研究進(jìn)展［J］.肝膽外科雜志，2007，15（3）：234-236.

［10］ 黃贊松，仇儀英.中醫(yī)藥治療原發(fā)性肝癌的研究現(xiàn)狀［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2012，23（12）：2851-2853.

［11］ 鄧小榮，余和平，潘雷，等.青蒿素聯(lián)合全轉(zhuǎn)鐵蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的研究［J］.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2009，25（6）：802.

［12］ 馬鎮(zhèn)堅(jiān)，張厚德，杜冀暉.青蒿素及其衍生物抗腫瘤的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2008，14（9）：1331-1333.

［13］ 鄧小榮，潘雷，余和平，等.青蒿素聯(lián)合全轉(zhuǎn)鐵蛋白對(duì)肝癌的選擇性抑制作用［J］.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2009，26（8）：1000-1001.

［14］ Singh NP，Lai H.Selective toxicity of dihydroartemisinin and holotransferrin toward human breast cancer cells［J］.Life Sci，2001，70（1）：49-56.

［15］ Disbrow GL，Baege AC，Kierpiec KA，et al.Dihydroartemisinin is cytotoxic to papillomavirus expressing epithelial cells invitro and in vivo［J］.Cancer Res，2005，65（23）：10854-10861.

［16］ Dell′Eva R，Pfeffer U，Vene R，et al.Inhibition of angiogenesis in vivo and growth of Kaposi′s sarcoma xenograft tumors by the anti malarial artesunate［J］.Biochem Pharmacol，2004，68（12）：2359-2366.

［17］ 董海鷹，宋維華，孫建平，等.青蒿素對(duì)體外培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)的影響［J］.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，6（36）：423-427.