人21.5 k Da MBP基因沉默對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖與凋亡的作用研究＊

田瑞敏，王含彥，易 芳，王曉明，陳建業(yè)△

（1.川北醫(yī)學院藥學院藥理學教研室，四川南充637000；2.川北醫(yī)學院基礎醫(yī)學院生物化學教研室，四川南充637000；3.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川南充637000）

人腦髓鞘堿性蛋白（human myelin basic protein，MBP）是由中樞神經(jīng)系統(tǒng)少突膠質(zhì)細胞和外周神經(jīng)系統(tǒng)雪旺氏細胞合成分泌的一種強堿性蛋白質(zhì)，MBP基因含有7 個外顯子，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)不同方式剪接可以產(chǎn)生分子量大小、結(jié)構(gòu)和功能不同的MBP 蛋白。在人腦主要含有21.5、20.0、18.5、17.3 和14.0 k Da MBP 等 幾種 表 達 產(chǎn) 物［1］，人 胎 腦 中 以21.5 k Da MBP表達為主，成年腦中以18.5 k Da MBP表達最多。MBP不僅在神經(jīng)纖維的絕緣和快速傳導中發(fā)揮著重要作用，而且在人腦發(fā)育、神經(jīng)細胞分化、髓鞘發(fā)生與髓鞘形成過程中具有重要功能。近年研究發(fā)現(xiàn)，21.5 kDa MBP 可能在細胞增殖與凋亡中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。越來越多的實驗研究顯示21.5 kDa MBP可以促進細胞增殖、抑制細胞凋亡［2-5］。但也有部分研究得出的結(jié)論與此相反［6-7］。為進一步深入研究21.5 k Da MBP 對細胞增殖與凋亡的確切作用，作者構(gòu)建了針對21.5 k DaMBP基因的序列特異性shRNA質(zhì)粒載體，擬經(jīng)脂質(zhì)體介導的方法轉(zhuǎn)染21.5 kDa MBP高表達人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U 251細胞株，觀察21.5 k DaMBP基因沉默對U 251細胞增殖及凋亡的確切影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株U251 由四川大學生物化學與分子生物實驗室惠贈；質(zhì)粒pGenesil-1-MBP-3 和pGenesil-1-MBP-neg 由本實驗室構(gòu)建并驗證［8］；Lipo2000 脂質(zhì)體購自美國invitrogen 公司；新生牛血清與DMEM購自美國Hyclone公司；RIPA細胞裂解液購自北京普利萊基因公司；兔抗MBP單克隆抗體購自美國EPITOMICS 公司，其二抗購自武漢博士德公司；兔抗GAPDH單克隆抗體及其二抗購自武漢博士德公司；Ec L 化學發(fā)光試劑盒購自MILLIPORE公司；CCK-8 試劑盒購自碧云天生物技術研究所；Annexin V-PE細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)U251細胞用新鮮完全DM EM培養(yǎng)液在37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，3～5 d 換1 次液，細胞長滿90%培養(yǎng)瓶底進行傳代。

1.2.2 實驗分組與細胞轉(zhuǎn)染 （1）實驗分為3 組：基因沉默組（21.5 k DaMBP基因沉默質(zhì)粒p Genesil-1-MBP-3 轉(zhuǎn)染）；陰性對照組（空質(zhì)粒p Genesil-1-MBP-neg 轉(zhuǎn)染）；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組（脂質(zhì)體空轉(zhuǎn)染）。（2）細胞轉(zhuǎn)染：將U251 細胞按2 ×105～3 ×105個／孔的密度接種于6 孔板培養(yǎng)過夜，待細胞鋪滿90%以上孔底時進行細胞轉(zhuǎn)染并在熒光顯微鏡下觀察細胞轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 實時定量PCR（RT-PCR）檢測21.5 k DaMBP基因的表達 細胞轉(zhuǎn)染后48 h，提取各組細胞總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，RT-PCR 檢測各組細胞中21.5 k Da MBP mRNA表達水平。PCR引物序列如下：MBP上游：5′-CAA GAT GAA AAC CCC GTA GTC C-3′，下 游：5′-GTA GCC AAA TCC TGG TCT CTG G-3′，序 列 長 度132 bp；GAPDH上 游：5′-CTT TGG TAT CGT GGA AGG ACT C-3′，下 游：5′-GTA GAG GCA GGG ATG ATG TTC T-3′，序列長度141 bp。PCR反應條件：95 ℃×30 s，進行預變性；95 ℃×5 s→95 ℃×30 s，共40個循環(huán)，進行定量PCR反應；95 ℃15 s→600 C ×1 min→95℃×15 s，進行反應延伸。反應結(jié)束后，觀察融解曲線。

1.2.4 Western blot 法檢測21.5kDa MBP 蛋白的表達 轉(zhuǎn)染后48 h，按文獻［7］方法進行21.5 kDa MBP蛋白的Westernblot 檢測。提取各組細胞蛋白質(zhì)并測定濃度，將稀釋過的蛋白質(zhì)與2 ×蛋白上樣緩沖液按照1∶1 的比例混勻，在沸水浴中煮5 min 變性。然后進行十二烷基-聚丙烯酰胺凝膠電脈（SDS-PAGE），半干法轉(zhuǎn)膜、封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜、洗膜，二抗孵育2 h、洗膜，化學發(fā)光法顯色，在成像儀上成像、拍照，用Image-Lab 軟件讀取各組條帶灰度值。

1.2.5 CCK-8 法檢測U251 細胞的增殖變化 按CCK-8 試劑盒方法進行細胞增殖檢測。U251 細胞轉(zhuǎn)染12h 后，將各組細胞消化重懸，調(diào)節(jié)細胞濃度至2 ×104 個／m L。按照100μL／孔的量接種于96 孔板，保證每孔含2000 個細胞，每個組設置5 個重復孔，分別檢測轉(zhuǎn)染后12、24、36、48、72h 共5 個時間點的吸光度值。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡率的變化 各組細胞轉(zhuǎn)染48 h 后，用不含EDTA的胰酶消化，2000 r pm離心5min 收集細胞沉淀；PBS 洗滌2次，再離心收集細胞沉淀并用500μL Binding Buffer 重懸細胞。向細胞懸液內(nèi)加1μL Annexin VPE 混勻，室溫下避光反應15 min。用美國BD公司流式細胞儀進行細胞凋亡檢測，以未轉(zhuǎn)染組U251 細胞進行熒光補償調(diào)節(jié)（激發(fā)波長為488 nm；發(fā)射波長為578 nm），用FL2 通道檢測各轉(zhuǎn)染組細胞的凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，多組間比較采用one-way-ANOVA檢驗分析：首先做方差齊性檢驗，如果方差齊性，則組間比較采取LSD法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 U251 細胞染轉(zhuǎn)結(jié)果 細胞轉(zhuǎn)染前，呈長梭形，邊緣清晰，生長旺盛，結(jié)構(gòu)正常。經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染24 h 后，用熒光顯微鏡觀察可見基因沉默組和陰性對照組細胞內(nèi)均有大量綠色熒光蛋白表達（表達率可達80%），說明21.5 k DaMBP基因干擾質(zhì)粒p Genesil-1-MBP-3 和空質(zhì)粒表達pGenesi l-1-MBP-neg 均已成功轉(zhuǎn)入到U251 細胞中并在細胞中有效表達，見圖1。

圖1 U251 細胞轉(zhuǎn)染前后細胞對比圖

2.2 各組細胞中21.5 kDaMBP基因在m RN A水平的表達結(jié)果 各轉(zhuǎn)染組細胞中MBP基因表達的RT-PCR檢測結(jié)果見圖2、3。圖2 可見擴增產(chǎn)物的溶解曲線均可擴增出單峰，且3 次重復表現(xiàn)一致，表明擴增具有良好的特異性和重復性。圖3 為各轉(zhuǎn)染組細胞21.5 k DaMBP基因表達柱狀圖，各組實驗數(shù)據(jù)經(jīng)2-△△Ct轉(zhuǎn)換和SPSS13.0 軟件one-way-ANOVA檢驗分析，與陰性對照組相比，基因沉默組細胞內(nèi)21.5 k DaMBP基因表達量降低了94.9%（P＜0.05）。

圖2 各轉(zhuǎn)染組21.5 k DaMBP mRNAs 擴增產(chǎn)物的溶解曲線

2.3 各組細胞中21.5 kDaMBP基因在蛋白質(zhì)水平的表達結(jié)果Western bolt 檢測顯示，3 組細胞中內(nèi)參照GAPDH的表達基本一致。但基因沉默組細胞中21.5 k Da MBP蛋白的表達水平顯著低于陰性對照組和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組；Image-Lab 軟件分析顯示，基因沉默組細胞中21.5 kDa MBP 蛋白表達的相對灰度值為0.833±0.007、陰性對照組為1.637±0.131、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組為1.543±0.034。將所得出數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，方差齊性檢驗結(jié)果顯示方差齊性（P＝0.067）；方差分析結(jié)果顯示組間差異具有統(tǒng)計學意義（F＝762.277，P＜0.05）；LSD法進行兩兩比較，基因沉默組與其他兩組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Western bolt 檢測結(jié)果顯示，經(jīng)沉默質(zhì)粒pGenesil-1-MBP-3 轉(zhuǎn)染，明顯干擾了U251 細胞中21.5 k DaMBP基因的表達，細胞中21.5 kDa MBP 蛋白的表達量較陰性對照組降低了49.12%，見圖4。

圖3 21.5 k Da MBP基因在m RN A水平表達柱狀圖

圖4 各轉(zhuǎn)染組細胞中21.5 kDa MBP 的表達

2.4 CCK-8 法檢測細胞增殖結(jié)果 陰性對照組和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組的細胞生長曲線基本重疊，基因沉默組的細胞生長曲線明顯向右移，表明基因沉默組的細胞生長速度變慢。基因沉默組細胞的OD值隨轉(zhuǎn)染時間的延長而增高，轉(zhuǎn)染12、24、36、48、72 h 的OD值分別為（0.515±0.046）、（0.593±0.043）、（0.675±0.011）、（0.807±0.017）、（0.952±0.041），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖5。

圖5 CCK-8 檢測細胞增殖曲線

2.5 流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染后細胞凋亡率U251 細胞轉(zhuǎn)染48 h后，各轉(zhuǎn)染組的細胞凋亡率分別為：基因沉默組（6.16±0.525）%、陰 性 對 照 組（1.96±0.083）%、脂 質(zhì) 體 轉(zhuǎn) 染 組（0.96±0.115）%；方差齊性檢驗結(jié)果為P＝0.077，顯示方差齊；方差分析結(jié)果為F＝231.704、P＜0.05，說明3 組間差異有統(tǒng)計學意義；用LSD法進行兩兩比較顯示，與陰性對照組和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組兩組相比，基因沉默組的細胞凋亡率顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖6。

圖6 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡圖

3 討 論

MBP 是一種含有多種堿性氨基酸的強堿性膜蛋白，主要分布在神經(jīng)組織，在其他組織中含量極少，主要功能是維持神經(jīng)纖維的絕緣和快速傳導。近年研究發(fā)現(xiàn)，21.5 k Da MBP 在多種腫瘤組織細胞中高表達［9-10］；在人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中21.5 k Da MBP 的表達量更豐富［11-12］，提示21.5 k Da MBP可能在腫瘤細胞增殖及凋亡中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，可能與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展具有密切聯(lián)系。

本研究構(gòu)建了針對21.5 k Da MBP的特異性干擾重組質(zhì)粒并經(jīng)脂質(zhì)體介導將其導入神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞，證實該質(zhì)粒在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中可以顯著降低21.5 k Da MBP的表達。通過細胞增殖實驗與流式細胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn)，21.5 kDaMBP基因沉默能夠顯著抑制U251 的細胞增殖、促進細胞凋亡。

但神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中的21.5 kDa MBP導致細胞增殖加快、凋亡減慢的機制尚不明確，有待進一步深入研究。業(yè)已證實，MBP 存在著磷酸化、脫磷酸兩種形式，分別參與不同的代謝調(diào)節(jié)。例如，MBP 的磷酸化參與凋亡因子Fa s 蛋白類似物MT-21 及抗癌劑細胞三烯菌素A對HL-60細胞凋亡的誘導［13］，MBP 的磷酸化還參與髓鞘形成與穩(wěn)定性調(diào)節(jié)及脫髓鞘疾病多發(fā)性硬化癥的調(diào)節(jié)［14］。Chen 等［3］研究發(fā)現(xiàn)，在體外將MBP 微基因轉(zhuǎn)染至腫瘤細胞（YTLMC-90）或正常細胞（成纖維細胞與平滑肌細胞）均可促進細胞增殖。本研究推測MBP、磷酸化MBP 的相對濃度改變可能是調(diào)節(jié)某些細胞增殖與凋亡的重要因素，MBP增高則細胞增殖，磷酸化MBP增高則細胞發(fā)生凋亡。線粒體Caspase激酶級聯(lián)途徑與真核細胞凋亡密切相關，Kobayashi 等［4］研究發(fā)現(xiàn)MBP可以降低DRG細胞中的Caspase-3而抑制細胞凋亡。Pan 等［5］研究檢測到21.5 k Da MBP 轉(zhuǎn)染的HepG-2 細胞中Caspase-3的表達量較對照組顯著降低，說明MBP可能通過調(diào)節(jié)細胞中的凋亡蛋白而發(fā)揮抗凋亡作用。Smith 等［15］研究發(fā)現(xiàn)21.5 k Da MBP高表達可以促進N19-OLG細胞增殖，同時觀察到細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK1／2）、蛋白激酶B1（AKt1）和核糖體蛋白S6（r PS6）表達上調(diào)，說明可能通過激活某些蛋白激酶及相關的信號通路促進細胞增殖。

21.5 kDa MBP的促細胞增殖與抗凋亡活性還可能與腫瘤細胞侵及周邊神經(jīng)組織和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的行為有關，這可能也是21.5 k Da MBP 在肺癌、乳腺癌等多種非神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤組織中異位高表達的原因所在。因為MBP是神經(jīng)髓鞘化過程非常重要的蛋白質(zhì)，從基因上將實驗老鼠剔除MBP后，發(fā)現(xiàn)它們減少了中央神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘化及漸進的失調(diào)，如顫抖、癲癇及過早死亡。因此，MBP對正常的神經(jīng)細胞形態(tài)及功能的維持是必需的，而在癌細胞中表達增強是其分化和增殖失控的結(jié)果還是調(diào)控的一個關鍵點，仍有待進一步深入研究。

本研究從基因沉默的角度證實了21.5 kDa MBP具有促進細胞增殖與抑制細胞凋亡的雙重調(diào)節(jié)功能，并從基因干擾的角度為腫瘤的基因治療進行了一次有益的嘗試。本研究構(gòu)建的21.5 k Da MBP 特異性干擾重組質(zhì)粒，為進一步研究21.5 k Da MBP 的功能及神經(jīng)膠質(zhì)瘤的基因治療提供了一種可供選擇的物質(zhì)手段。

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