靶向調(diào)控FASN的miRNAs在不同侵襲力骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)＊

龍新華，劉志禮，劉家明，陳宣銀，王 恒，周 揚(yáng)，張志宏

（南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，南昌330006）

近年來(lái)眾多研究表明，脂肪酸合成酶（FASN）在多種惡性腫瘤中高表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［1-3］，大量前期研究也證實(shí)FASN高表達(dá)在骨肉瘤轉(zhuǎn)移中扮演重要的角色［4-6］。但是FASN在骨肉瘤中高表達(dá)的調(diào)控機(jī)制仍不清楚。近年來(lái)，大量研究證實(shí)microRNA不但參與腫瘤的發(fā)生、增殖、凋亡，而且對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移具有調(diào)節(jié)作用［7-9］。本研究擬通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，尋找可能調(diào)控FASN基因表達(dá)的mi RNA分子，并用RT-PCR法檢測(cè)這些分子在不同侵襲能力骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)，從而篩選出可能靶向調(diào)控FASN基因影響骨肉瘤侵襲轉(zhuǎn)移的miRNA分子，為進(jìn)一步研究骨肉瘤中FASN基因高表達(dá)的分子機(jī)制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料U2-OS、HOS細(xì)胞株購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)；SYBR Premix Ex Taq TMⅡ定量PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa 公司；實(shí)時(shí)定量PCR（RT-PCR）引物（含內(nèi)參U6 引物）由華安平康公司設(shè)計(jì)并合成；Rever Tra Ace-α-TM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TOYOBO公司；兔抗人FASNIg G，鼠抗人GAPDHIgG購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；Mat r ige l 基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)預(yù)測(cè) 應(yīng)用micro RNA在線數(shù)據(jù)庫(kù)Targetscanhuman6.2 （http：／／www.targetscan.org／）和microrna.org（http：／／www.microrna.org／microrna／search Mirnas.do），針對(duì)FASN基因（NM＿004104）預(yù)測(cè)可能調(diào)控其表達(dá)的miRNA分子。選取2種預(yù)測(cè)結(jié)果的交集m i RNA分子進(jìn)行RT-PCR 定量檢測(cè)。

1.2.2 RT-PCR 檢測(cè)miRNA分子在骨肉瘤細(xì)胞HOS、U2-OS 中的表達(dá) 用Tr izol 法處理骨肉瘤細(xì)胞，提取總RNA，紫外分光光度儀檢測(cè)所提取的總RNA濃度和質(zhì)量。然后取1 μg 總RNA，用Rever Tra Ace-α-TM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TOYOBO公司）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以此為模板進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。RT-PCR 引物（含內(nèi)參U6 引物）由華安平康公司設(shè)計(jì)并合成，序 列 如 下：hsa-miR-15a-5p正向引物 5′-CCAGCTGGGCTTTTTGCGGTCTGG-3′；hsa-miR-15b-5p 正向引物5′-CCAGCTGGGTAGCAGCACAGAAAT-3′；hsa-miR-16-5p正向 引 物5′-CCAGCTGGGCAGCAGCAATTCATGT-3′；hsamiR-195-5p正向引物5′-CCAGCTGGGCAGCAGCACACTGTG-3′；hsa-miR-495-3p正向引物5′-CCAGCTGGGACTCCATTTGTTTTGAT-3′；U6（內(nèi)參）正向引物5′-CCAGCTGGGATCACATTGCCAGGG-3′；通用反向引物（SLR-primer）5′-CTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATT-3′。按照SYBR Premix Ex Taq TMⅡRT-PCR試劑盒（TaKaRa 公司）說(shuō)明書進(jìn)行操作。反應(yīng)條件：94 ℃變性5 min，一個(gè)循環(huán)，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)RT-PCR 的擴(kuò)增曲線和熔解曲線，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。不同時(shí)間重復(fù)6 次實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 Western blot 檢測(cè)U2-OS 和HOS 細(xì)胞中FASN的表達(dá)水平 收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的骨肉瘤細(xì)胞，RIPA裂解，提取總蛋白，BCA法蛋白定量，10%十二烷基-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗（兔抗人FASN IgG，1∶1000，鼠抗人GAPDH IgG，1∶2500）室溫孵育2 h，TBST洗膜3 次，二抗（山羊抗兔和山羊抗鼠，1∶5000）室溫孵育1 h，TBST洗膜3 次，Pro-light HRP 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑（TIANGEN，PA112）化學(xué)發(fā)光，壓片，拍照，用Image J 軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行分析。不同時(shí)間重復(fù)實(shí)驗(yàn)6 次。

1.2.4 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 將HOS、U2-OS 細(xì)胞用含10g／L 的牛血清清蛋白（BSA）無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 ×105 個(gè)／mL，取150μL 細(xì)胞懸液接種小室，然后將小室放入加有600μL／孔含10%胎牛血清的HAM′S／F-12 培養(yǎng)基的24 孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h。取出小室，吸棄上室液體，用PBS 漂洗2 次，95%乙醇固定10 min，用棉簽擦凈小室膜上側(cè)未遷移的細(xì)胞，4 g／L結(jié)晶紫染色20 min，PBS漂洗2 次。倒置顯微鏡下隨機(jī)選取10 個(gè)視野觀察細(xì)胞穿膜情況并拍照，Image J 分析軟件計(jì)數(shù)。不同時(shí)間重復(fù)實(shí)驗(yàn)6 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)比較2 個(gè)細(xì)胞侵襲能力及各miRNA在2 個(gè)細(xì)胞中的表達(dá)差異，用Pearson 法進(jìn)行相關(guān)性分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件TargetScan.human6.0 和microrna.org預(yù)測(cè)結(jié)果的交集顯示有6個(gè)可能靶向調(diào)控FASN基因的m i RNA分子，分別為：miR-195／15a／15b／16／424／497，見(jiàn)圖1。

2.2 骨肉瘤細(xì)胞U2-OS 和HOS 中各miRNA表達(dá)量比較RT-PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在預(yù)測(cè)出的6 個(gè)mi RNAs 中，miR-424在HOS 細(xì)胞中表達(dá)水平顯著高于在U 2-OS 細(xì)胞中的表達(dá)水平，HOS／U2-OS 為（543.4429±39.7931）倍；而miR-195／497／15a／15b／16 在HOS 細(xì)胞中的表達(dá)水平略高或略低于U2-OS 中的表達(dá)水平［HOS／U2-OS 分別為（1.5885±0.1533）、（1.4051±0.0545）、（0.6667±0.0692）、（0.6532±0.3005）及（0.5277±0.0268）倍］，均小于2 倍，見(jiàn)表2。

2.3 骨肉瘤細(xì)胞U2-OS 和HOS 中FASN表達(dá)水平比較Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖2），U2-OS 細(xì)胞中FASN表達(dá)水平高于HOS細(xì)胞中表達(dá)水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果

表2 骨肉瘤細(xì)胞U2-OS、HOS 中各miRNAs 表達(dá)量比較

圖2 Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 骨肉瘤細(xì)胞U2-OS和HOS侵襲能力的比較Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，24 h內(nèi)骨肉瘤細(xì)胞U 2-OS穿膜數(shù)（62.4±4.4）個(gè)／視野，明顯高于HOS 細(xì)胞穿膜數(shù)（27.4±4.7）個(gè)／視野（P＜0.05），見(jiàn)圖3。結(jié)果提示U2-OS 細(xì)胞侵襲能力顯著高于HOS 細(xì)胞。

圖3 Transwell invasion 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（結(jié)晶紫染色×200）

3 討 論

骨肉瘤好發(fā)于兒童及青少年，惡性度高，肺部轉(zhuǎn)移早，有約80%的患者往往在確診時(shí)已經(jīng)存在肺部微轉(zhuǎn)移［10］，這是骨肉瘤患者總體生存率徘徊不前的主要原因，也是骨肉瘤防治的關(guān)鍵所在。因此，尋找新的分子靶點(diǎn)、深入研究骨肉瘤侵襲轉(zhuǎn)移發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，對(duì)提高骨肉瘤治療具有非常重要的意義。

FASN是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的一種大分子多功能酶，在合成內(nèi)源性脂肪酸的過(guò)程中起關(guān)鍵作用。FASN與腫瘤的關(guān)系十分密切。Silva 等［1］在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌研究中發(fā)現(xiàn)FASN高表達(dá)與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌肺轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，并且FASN高表達(dá)是頭頸部鱗狀細(xì)胞癌肺轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要特征。Carvalho 等［2］利用小鼠黑色素瘤模型發(fā)現(xiàn)抑制FASN能減少黑色素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移擴(kuò)散；Murata 等［3］在直腸癌的研究中也發(fā)現(xiàn)抑制FASN的表達(dá)能抑制直腸癌的肝轉(zhuǎn)移。本研究前期對(duì)新鮮骨肉瘤組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果顯示，F(xiàn)ASN在骨肉瘤中呈高表達(dá)，且發(fā)生轉(zhuǎn)移的骨肉瘤組織中的表達(dá)量明顯高于未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移骨肉瘤組織［11］。本研究在骨肉瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)，抑制FASN骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá)能顯著降低骨肉瘤細(xì)胞的遷移、侵襲能力，下調(diào)PI3K／Akt／NF-κB 通 路 為 其 重 要 調(diào) 控 通 路 之 一［5-6］。然 而FASN在骨肉瘤中高表達(dá)的調(diào)控機(jī)制如何，目前仍不清楚。

近年來(lái)，miRNA的發(fā)現(xiàn)為研究腫瘤轉(zhuǎn)移調(diào)控機(jī)制提供了新的視角。miRNA是一類長(zhǎng)度在22 個(gè)核苷酸（nt）的參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，通常與靶基因mRNA的3′-UTR部分序列反向互補(bǔ)結(jié)合而抑制翻譯過(guò)程，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖、凋亡、發(fā)育和代謝等生命活動(dòng)的功能。有研究報(bào)道，miRNA-7、miRNA-10 參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌轉(zhuǎn)移調(diào)控［12-13］；也有研究者證實(shí)，miRNA-21、miRNA-221等miRNAs 在骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用［14-15］。因此尋找miRNA與靶基因之間的調(diào)控關(guān)系在骨肉瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制研究中可行而有意義。

本研究首先運(yùn)用2 種不同生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的方法，預(yù)測(cè)出可能調(diào)控靶基因FASN的miRNAs，然后檢測(cè)這些miRNAs 在不同侵襲能力的骨肉瘤細(xì)胞U2-OS 和HOS中的表達(dá)水平。本研究 結(jié) 果 顯 示，miR-195／15a／15b／16／424／497同 時(shí) 被2種生物信息學(xué)預(yù)測(cè)方法預(yù)測(cè)出可能靶向調(diào)控FASN基因表達(dá)；用RT-PCR對(duì)這些mi RNA在骨肉瘤細(xì)胞U2-OS、HOS 中表達(dá)進(jìn)行定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：miR-424在HOS細(xì)胞中表達(dá)相對(duì)于U2-OS 細(xì)胞中高出（543.4429±39.7931）倍，而在其余micro RNA在HOS 中表達(dá)高出或低于U2-OS 中表達(dá)都在2 倍之內(nèi)；U2-OS細(xì)胞中F A SN蛋白表達(dá)水平明顯高于HOS中FASN表達(dá)水平；同時(shí)Tanswell invasion 實(shí)驗(yàn)證實(shí)骨肉瘤U2-OS 細(xì)胞侵襲能力明顯高于HOS 細(xì)胞。

綜上所述，miR-424 在骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá)水平與細(xì)胞侵襲能力呈負(fù)相關(guān)，因而miR-424 很可能通過(guò)靶向調(diào)控FASN基因在骨肉瘤侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，為骨肉瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制研究提供了新的思路。但是，由于體外模擬環(huán)境和體內(nèi)微環(huán)境之間存在差異，miR-424 是否確實(shí)通過(guò)靶向調(diào)控FASN參與骨肉瘤轉(zhuǎn)移，還需進(jìn)一步大量體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。

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